CC BY
124
: Клинико-лабораторные особенности эссенциального ; тромбоцитоза и первичного миелофиброза в зависимости s от мутационного статуса генов JAK2 и CALR1
N
ев Е.Г. Лисина1, Н.Т. Сиордия2, П.А. Бутылин2, А.А. Силютина2, Н.М. Матюхина2,
_j О.М. Сендерова3, Е.С. Фокина4, В.А. Овсепян4, Э.Г. Ломаиа2, А.Ю. Зарицкий2
I— 1БУ«Республиканская клиническая больница» Минздрава Чувашской Республики;
Россия, 428018 Чебоксары, просп. Московский, 9;
ш 2ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова» Минздрава России;
5Е Россия, 197341 Санкт-Петербург, ул. Аккуратова, 2;
о 3ГБУЗ «Иркутская ордена "Знак Почета " областная клиническая больница»; Россия, 664049 Иркутск, м-н Юбилейный, 100;
¡5 4ФГБУН «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-
_ биологического агентства»; Россия, 610027Киров, ул. Красноармейская, 72
OJ
*- Контакты: Екатерина Геннадьевна Лисина eglisina@mail.ru
Е
о ^
Введение. Мутация гена JAK2V617Fвстречается примерно у 50 % пациентов с эссенциальным тромбоцитозом (ЭТ) и первичным i— миелофиброзом (ПМФ). В 2013 г. у большинства JAK2-негативных пациентов выявлены мутации в гене CALR. Диагностическая ™ ценность мутаций в генах JAK2 и CALR высокая, но их прогностическая значимость недостаточно ясна. Данные о влиянии мутационного статуса генов JAK2 и CALR на тромботические осложнения при ЭТ и ПМФ противоречивы.
Цель исследования — выявление клинико-лабораторных особенностей у пациентов сЭТи ПМФ в зависимости от наличия мута-s ций генов JAK2V617F и CALR.
Материалы и методы. Проведено ретроспективное исследование пациентов, наблюдавшихся в четырех медицинских учрежде-^ ниях Санкт-Петербурга, Чебоксар, Иркутска и Кирова (БУ «Республиканская клиническая больница» Минздрава Чувашской ® Республики, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова» Минздрава России, ГБУЗ «Иркут-^ ская ордена "Знак Почета" областная клиническая больница», ФГБУН«Кировский научно-исследовательский институт гема-^ тологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства»). В клетках периферической крови пациентов
проводили определение генетических мутаций: CALR (с выделением 1-го и 2-го типов), MPL W515L/K, JAK2V617F. ^ Результаты. При ЭТ у 21 % (n = 16) больных зарегистрированы тромботические осложнения, при этом они встречались чаще = среди носителей мутации JAK2V617F (p <0,05). При ПМФ медиана уровня гемоглобина оказалась наименьшей в группе пациентов с «тройным негативным» статусом, а уровень лейкоцитов более высоким, чем в группе с мутациями CALR (р = 0,014). Заключение. При ЭТ мутация JAK2 сопровождается высоким риском развития тромбозов. Наличие мутации CALR может иметь благоприятный прогноз в плане риска развития тромботических осложнений. Выявлены некоторые лабораторные особенности, характерные для мутации CALR при ЭТ и ПМФ.
Ключевые слова: эссенциальный тромбоцитоз, миелофиброз, хронические миелопролиферативные заболевания, JAK2, CALR, тром-ботические осложнения
DOI: 10.17650/1818-8346-2017-12-3-8-16
Clinical and laboratory features of essential thrombocytosis and primary myelofibrosis depending
on JAK2 and cALR1 mutation status
E.G. Lisina1, N.T. Siordiya2, P.A. Butylin2, A.A. Silyutina2, N.M. Matyukhina2, O.M. Senderova3, E.S. Fokina4, V.A. Ovsepyan 4, E.G. Lomaia2, A.Yu. Zaritskiy2
'Chuvash Republican Clinical Hospital; 9 Moscovskiy prospect, Cheboksary, Chuvash Republic, Russia, 428018;
2Almazov National Medical Research Center; 2 Akkuratova str., St. Petersburg, Russia, 197341;
3"Badge of Honor" Irkutsk Regional Clinical Hospital; 100 Yubileyny microrayon, Irkutsk, Russia; 664049;
4Kirov Scientific Research Institute of Hematology and Blood Transfusion; 72 Krasnoarmeiskaya str., Kirov, Russia, 610027
Introduction. JAK2V617F mutation is detected in approximately 50 % of patients with essential thrombocytosis (ET) and primary myelofibrosis (PMF). In 2013 most of the JAK2 negative patients showed mutations in the CALR gene. Diagnostic value of JAK2 and CALR mutations is high, but their prognostic significance is not sufficiently clear. Data on impact of JAK2 and CALR mutational status on thrombotic complications in ET and myelofibrosis patients are contradictory.
The aim of the study was to identify clinical and laboratory features in patients with ET and PMF in accordance with the mutational status of JAK2V617F and CALR gene.
Materials and methods. Patients treated in Almazov National Medical Research Center (St. Petersburg), Chuvash Republican Clinical Hospital (Cheboksary), Irkutsk Regional Clinical Hospital (Irkutsk), Kirov Research Institute of Hematology and Blood Transfusion (Kirov)
was included in the retrospective study. CALR mutation (1 and 2 types), MPL W515L/Kand JAK2V617Fmutation were detected in peripheral blood cells.
Results. We identified that 21 % (n = 16) of ET patients had thrombotic complications, and they occurred more often among JAK2V617F positive patients (p <0.05). The median of hemoglobin level in PMF was the lowest in the group of triple negative patients. The level of leukocytes in PMF was higher in the group of triple negative patients than in the group with mutated CALR (p = 0.014).
Conclusion. JAK2V617F mutation in ET patients was associated with a high risk of thrombosis. Patients with CALR mutations may have a favorable prognosis regarding to thrombotic complications. Some laboratory features of CALR mutations in ET and PMF patients have been revealed.
Key words: essential thrombocytosis, myelofibrosis, chronic myeloproliferative diseases, JAK2, CALR, thrombotic complications
cv со
ев
Введение
Эссенциальный тромбоцитоз (ЭТ), истинная по-лицитемия (ИП) и первичный миелофиброз (ПМФ) являются классическими хроническими миелопроли-феративными заболеваниями (ХМПЗ), характеризующимися повреждением полипотентной кроветворной клетки и избыточной пролиферацией клеток миелоидной линии на разных стадиях созревания. Этим заболеваниям присущи следующие общие кли-нико-лабораторные особенности: мегакариоцитарная гиперплазия и тромбоцитоз, спленомегалия, частые тромботические осложнения, при длительном течении — риск трансформации миелодиспластического синдрома в острый лейкоз.
Клинические особенности течения болезни находятся в непосредственной связи с молекулярно-генетиче-ским профилем. На сегодняшний день при ХМПЗ выявляется несколько мутаций. В 2005 г. была обнаружена точечная соматическая мутация в 14-м экзоне гена JAK2 у большинства пациентов с хроническими миелопроли-феративными неоплазиями [1—4]. Мутация JAK2V617F определяется более чем у 95 % пациентов с ИП [1, 5] и у 50-60 % пациентов с ЭТ [1, 5-9] или ПМФ [1, 5, 8, 10, 11]. Мутация в 12-м экзоне гена JAK2 обнаружена у 4 % пациентов с ИП [12]. JAK2, являясь цитоплазмати-ческой тирозинкиназой, передает внутриклеточный сигнал с рецепторов для цитокинов - эритропоэтина, тромбопоэтина, G-CSF (гранулоцитарного колониести-мулирующего фактора), GM-CSF (гранулоцитарно-ма-крофагального колониестимулирующего фактора) и ин-терлейкина 3 к ядру клетки для активации процессов пролиферации [13, 14]. Мутация JAK2V617Fприводит к цитокин-независимой активации сигнальных путей JAK-STAT, PI3K(фосфатидилинозитол-3-киназы), АКТ (протеинкиназы В), m-TOR и МАРК-ЕКК (митоген-ак-тивированных протеинкиназ — внеклеточной регулируемой киназы) [2—4, 15], которые участвуют в передаче сигналов с цитокиновых рецепторов [15].
Позже была выявлена мутация в гене рецептора тромбопоэтина (MPL W515) [16], которая встречается при ПМФ и ЭТ в 3—8 % случаев [17, 18]. Мутация MPL W515 наблюдалась только при ЭТ или ПМФ и никогда при ИП, что свидетельствует о потенцирующем эффекте MPL W515 в поддержании мегакариоцитар-ной гиперплазии и тромбоцитоза [18].
В 2013 г. были опубликованы данные двух независимых лабораторий об открытии мутаций в гене CALR. У пациентов с ЭТ и ПМФ, не имеющих мутаций в генах JAK2 или MPL, мутации CALR выявлялись с частотой от 67 до 88 % случаев [19, 20]. На сегодняшний день обнаружено более 40 различных мутаций в 9-м экзоне гена CALR. Все они являются инсерциями и/или делециями и приводят к образованию новой С-концевой последовательности белка и потере сигнальной последовательности KDEL за счет сдвига рамки считывания на 1 нуклеотид: +1 пара оснований (п. о.) [19—21]. Наиболее часто встречающимися мутациями являются делеция 52 п. о. (1-й тип) и инсер-ция 5 п. о. (2-й тип), причем мутации 1-го типа чаще встречаются при ПМФ [22].
Кальретикулин — многофункциональный Са2+-связывающий белок, локализуется преимущественно в эндоплазматической сети, но также обнаруживается в цитоплазме и на поверхности клетки. Показано, что мутантные формы кальретикулина способны связываться с экстраклеточным доменом MPL и, таким образом, индуцировать конститутивную лиганд-неза-висимую активацию JAK2-STAT/PI3K/MAPK сигнальных путей, что ведет к пролиферации и автономному росту клеток линий Ba/F3 UT-7/TPO [23, 24].
Участием JAK-STAT сигнального пути у пациентов c мутацией CALR можно объяснить эффективность JAK2-ингибиторной терапии ПМФ у этой группы больных [19]. Тем не менее около 5—10 % пациентов с ЭТ и ПМФ являются «тройными негативными» (triple negative), т. е. у них не обнаруживаются мутации в генах JAK2, MPL, CALR. Мутации в других генах, таких как TET2, ASXL1 и CBL, были описаны при всех видах ХМПЗ, тем не менее они сосуществуют с мутациями в генах JAK2, MPL и CALR и встречаются при различных миелоидных опухолях [20, 25—27]. Было показано, что большинство из них участвует в прогрессии клонального гемопоэза заболевания [28]. В случаях «тройных негативных» ХМПЗ также имеется повышенная активация JAK-STAT сигнального пути [29]. Таким образом, Ph-отрицательные ХМПЗ описываются как заболевания, обусловленные гиперактивацией JAK-STAT сигнального пути [30].
На сегодняшний день доказана диагностическая значимость мутаций JAK2, MPL, CALR и они включе-
CV со
сч cv
es
cv cv
ны в критерии для постановки диагноза эссенциаль-ной тромбоцитемии и ПМФ по критериям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ, 2016) [31]. Кроме того, опубликован ряд работ, описывающих клинические изменения, характерные для каждого типа мутаций при ЭТ и ПМФ, однако сравнительный анализ международных данных выявляет некоторые различия между ними. В ряде исследований когорт пациентов с ЭТ и ПМФ показано, что носители мутации в гене CALR имеют более низкие уровни гемоглобина и лейкоцитов и более высокое содержание тромбоцитов по сравнению с группой больных, имеющих мутацию в гене JAK2 [19, 31—33]. При этом среди пациентов с мутацией CALR отмечена редкая встречаемость венозных тромбозов [22, 34—36]. Также выявлена более высокая частота фиброзной трансформации при ЭТ с мутацией в гене CALR [20, 34]. Однако некоторые исследователи не выявили существенных различий в развитии венозных тромбозов и риска фибротической трансформации [31, 32], а также в показателях общей выживаемости [32, 34] у пациентов с ЭТ в зависимости от наличия мутации CALR или JAK2. В одном из исследований не выявлено значимой связи между присутствием мутации CALR и клинико-лабораторными особенностями или стратификацией пациентов при ПМФ в соответствии со шкалой IPSS (International Scoring Prognostic System — Международная шкала оценки прогноза)
[37]. Тем не менее при ЭТ и ПМФ подтверждается положительное влияние мутации гена CALR на выживаемость больных [19, 33].
Кроме того, в ряде работ были выявлены различия в клинических и лабораторных особенностях пациентов, несущих разные типы мутаций CALR [38, 39]. Сравнительный анализ мутаций 1-го и 2-го типов в группе пациентов с ПМФ показал, что пациенты с мутациями 2-го типа относились к группе высокого риска (4 балла и более по системе стратификации DIPSS), имели выраженный лейкоцитоз и повышенное содержание бластных клеток в периферической крови по сравнению с пациентами, несущими мутации 1-го типа. Общая выживаемость пациентов с мутациями CALR 2-го типа и JAK-2 была значительно ниже выживаемости пациентов с мутациями 1-го типа
[38]. Исследование когорты пациентов с ЭТ не выявило различий между вариантами мутаций CALR в уровне гемоглобина, количестве лейкоцитов и стратификацией пациентов в соответствии с классификацией по системе IPSS, а также в показателях общей выживаемости и риска возникновения тромботических осложнений, однако содержание тромбоцитов при мутациях 2-го типа CALR было значительно выше, чем при мутациях 1-го типа [39].
Целью данного исследования стало выявление клинических особенностей у пациентов с ЭТ и ПМФ в зависимости от наличия мутаций генов JAK2V617F и CALR.
Материалы и методы
Проведено ретроспективное исследование пациентов, наблюдавшихся в ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова» (НМИЦ им. В.А. Алмазова) Минздрава России (Санкт-Петербург), БУ «Республиканская клиническая больница» Минздрава Чувашии (Чебоксары), ГБУЗ «Иркутская ордена "Знак Почета" областная клиническая больница» (Иркутск), ФГБУН «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства» (Киров). В исследование были включены 149 пациентов, у 76 из них диагностирован ЭТ (22 мужчины, 54 женщины), у 73 — ПМФ (30 мужчин, 43 женщины).
Всеми пациентами было подписано информированное согласие на участие в исследовании. Данные собирались из медицинской документации, полученной в ходе амбулаторного консультирования пациентов с установленными диагнозами ПМФ и ЭТ.
Диагноз устанавливался с учетом действующих рекомендаций ВОЗ (2008) [40], в дальнейшем пересматривался ретроспективно в соответствии с новыми критериями ВОЗ от 2016 г. [31]. Показатели гемограмм (уровень гемоглобина, тромбоцитов, лейкоцитов, количество бластных клеток) регистрировались на момент диагностики, учитывались клинические данные, размеры печени и селезенки, проводилась стратификация пациентов по группам риска в соответствии с системами IPSS и DIPSS [41, 42]. Исследование утверждено этическим комитетом ФГБУ «СЗФМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России.
В клетках периферической крови больных проводили определение возможных генетических мутаций, встречающихся при данных нозологиях: CALR (с выделением 1-го и 2-го типов), MPL W515L/K, JAK2V617F. При получении отрицательных результатов на вышеуказанные мутации устанавливался «тройной негативный» статус (triple negative).
Исследование образцов крови. Выделение ДНК проводили из 500 мкл крови с использованием набора реагентов FlexiGene DNA Kit (Qiagen, Германия) и в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию и чистоту ДНК оценивали с помощью прибора NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, США).
Для амплификации 9-го экзона гена CALR1 использовали пару специфических олигонуклеотидных праймеров CALR-Fи CALR-R [20]. Реакционная смесь содержала: 10Х Taq-буфера (Евроген, РФ), 50Х смесь dNTP (10 мМ каждого) (Евроген, РФ), 50Х Taq ДНК-полимеразы (Евроген, РФ), 0,4 мкМ праймера CALR-F, 0,4 мкМ праймера CALR-R и 100 нг ДНК, конечный объем реакционной смеси составил 25 мкл. Для проведения амплификации использовали прибор DNA Engine Dyad Thermal Cycler (Bio-Rad, США). Программа для амплификации включала: первичную денатурацию (95 °C/5 мин); циклирование — 10 циклов:
94 °C/30 с; 67 °C (-0,5 °C/1 цикл)/30 с; 72 °C/30 с; и 29 циклов: 94 °C/30 с; 62 °C/30 с; 72 °C/30 с; и конечную элонгацию (72 °C/10 мин).
Очистка продуктов амплификации. Электрофоре-тическое разделение продуктов амплификации проводили в 2 % агарозном геле при напряжении 5у/см3 в течение 2,5 ч. Для визуализации продуктов амплификации непосредственно в гель добавляли бромистый этидий до концентрации 10 мг/л. В качестве электрофоретического буфера использовали 1-кратный раствор ТАЕ (трис-ацетатного буфера): 40 мМ Трис, 40 мМ СНЗСООН, 2 мМ EDTA-Na pH 8,0). После окончания электрофореза из геля вырезали фрагменты интересующей длины. ДНК из геля выделяли с помощью набора для экстракции ДНК из ага-розного геля (Амбер, РФ).
Для проведения сиквенсовой реакции использовали прибор DNA Engine Dyad Thermal Cycler (BioRad, США). Реакционную смесь готовили с использованием пары праймеров для амплификации и набора реагентов BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Scientific, США). Реакционная смесь содержала 5X Sequencing Buffer, BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction Mix, 3,2 мкМ праймера CALR-F или CALR-R и 30 нг ДНК, конечный объем реакционной смеси был равен 10 мкл. Программа для сиквенсовой реакции включала первичную денатурацию (96 °C/1 мин) и ци-клирование: 25 циклов (96 °C/10 с; 50 °C/5 с; 60 °C/4 мин).
Очистка продуктов сиквенсовой реакции. Для очистки продуктов сиквенсовой реакции к 10 мкл смеси, полученных на предыдущем этапе, добавляли 1 мкл 3М ацетата натрия, 1 мкл 0,125М ЭДТА (этилен-диаминтетрауксусная кислота), 0,5 мкл гликогена и 25 мкл охлажденного 96° этилового спирта. Полученную смесь оставляли на ночь при температуре -20 °С. Далее откручивали микропробирки в центрифуге в течение 20 мин при 4 °C и 12 600 об/мин, отбирали надосадочную жидкость и промывали осадок 35 мкл охлажденного 80° этилового спирта, затем повторяли данный шаг. Осадки сушили при комнатной температуре в течение 10 мин в темном месте. Добавляли к полученным осадкам 10 мкл Hi-Di Formamide (CE-IVD) (Applied Biosystems, США) и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин в темном месте.
Секвенирование 9-го экзона гена CALR1. Секвени-рование 9-го экзона гена CALR проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, США). При анализе нуклеотидных последовательностей использовали пакет программ Unipro UGENE 1.15 (РФ).
Данные обрабатывали в программе Statist^ for Windows 6.0. При анализе вариационного ряда использовали среднее (М), медиану (Ме) и стандартное отклонение (с), для сравнения средних при правильном распределении — t-критерий Стьюдента (p),
при неправильном распределении либо малом числе наблюдений — критерий Манна—Уитни (рт _ u), при сравнении 3 групп и более — критерий Крускала— Уоллиса.
Анализ качественных величин проводили по критерию хи-квадрат (p2), при количестве наблюдений менее 5 в одной из ячеек либо общем числе наблюдений в таблице менее 30 применяли точный критерий Фишера (pF). Результаты анализа считались приемлемыми при вероятности ошибки (р, рт _ u, pF , р2) менее 0,05.
Результаты
В группе пациентов с ЭТ мутация JAK2V617F выявлена у 46,1 % больных, CALR — у 44,7 % больных, в 1 случае детектирована мутация MPL W515L, у 7,9 % больных не выявлено ни одной «драйверной» мутации (triple negative). Частота встречаемости мутации CALR при ПМФ была практически сопоставима, за исключением мутации CALR 2-го типа, которая в 2 раза чаще наблюдалась при ЭТ, чем при ПМФ: 17,1 % против 9,6 %, р = 0,178 (табл. 1).
Частота обнаружения JAK2 была несколько выше в группе с ПМФ - 53,4 % против 46,1 % (р = 0,368), а частота обнаружения CALR ниже — 35,6 % против 44,7 % (р = 0,256). Примечательно, что уровень экспрессии гена JAK2 среди 7АК2-позитивн^1х лиц с ПМФ был выше по сравнению с ЭТ — 54,0 ± 36,5 % против 36,5 ± 27,2 %, р = 0,023.
' ' '1 m—u '
При анализе встречаемости генетических мутаций выявлены гендерные особенности структуры популяции при ПМФ в отличие от ЭТ (табл. 2). Медиана периода наблюдения пациентов с ЭТ составила 50 ± 38 мес. У 4 пациентов с мутацией JAK2 и 1 пациента с мутацией CALR (1-й тип — инсерция) констатирована трансформация во вторичный миелофиброз. Анализ гематологических показателей выявил более высокий уровень лейкоцитов у пациентов с 1-м типом мутации (р = 0,043), уровень гемоглобина при данном варианте оказался ниже (р = 0,009). У 21 % больных (n = 16) зарегистрированы тромботические осложнения, и они встречались чаще среди носителей мутации JAK2V617F (p <0,05) (табл. 3). При этом медиана уровня тромбоцитов несколько ниже у пациентов с мутацией JAK2 (p = 0,074), а уровень лейкоцитов при JAK2 выше, чем при мутации CALR: 8,4 и 6,55 х 109/л (p = 0,067).
Медиана периода наблюдения пациентов с ЭТ с 1-м типом мутации составила 36 мес (3—87), со 2-м типом — 22 мес (2—90). Размер селезенки по данным ультразвукового исследования на момент диагностики при 1-м типе составлял 106,5 мм, при 2-м типе — 119,6 мм (р = 0,076). Тип мутации не оказал влияния на распределение пациентов по степени риска согласно шкале IPSET (International Prognostic Score WHO for ET — шкала риска развития тромбозов ВОЗ при эссенциальной тромбоцитемии), также нами не выявлены значимые отличия при оценке терапии.
CV со
es
cv со
Таблица 1. Встречаемость генетических мутаций при эссенциальном тромбоцитозе и первичном миелофиброзе, % (абс.) Table 1. The frequency of genetic mutations in essential thrombocytosis and primary myelofibrosis, % (abs.)
Генетический маркер Первичный миелофиброз, n = 73 Эссенциальный тромбоцитоз, n = 76 рх2
JAK2 53,4 (39) 46,1 (35) 0,368
CALR, всего CALR, total 35,6 (26) 44,7 (34) 0,256
CALR, 1-й тип CALR, 1st type 24,7 (18) 25,0 (19) 0,962
CALR, 2-й тип CALR, 2nd type 9,6 (7) 17,1 (13) 0,178
CALR, тип не уточнен CALR, type unspecified 1,4 (1) 2,6 (2) 0,584
MPL 2,7 (2) 1,3 (1) 0,536
Тройной негативный статус Triple negative 8,2 (6) 7,9 (6) 0,942
cv cv
es
cv cv
Примечание: р — критерий хи-квадрат. Note: р — chi-square test.
Таблица 2. Встречаемость генетических мутаций при эссенциальном тромбоцитозе и первичном миелофиброзе у мужчин и женщин, % (абс.) Table 2. The frequency ofgenetic mutations in essential thrombocytosis and primary myelofibrosis in men and women, % (abs.)
Первичный миелофиброз Primary myelofibrosis р Эссенциальный тромбоцитоз Essential thrombocytosis р
Генетический маркер цщ
Мужчины, n = 30 Женщины, n = 43 Мужчины, n = 22 Женщины, n = 54
Men, n = 30 Women, n = 43 Men, n = 22 Women, n = 54
JAK2 40,0 (12)
CALR 46,7 (14)
MPL 0 (0)
Тройной негативный
статус 13,3 (4)
Triple negative
Примечание: р — t-критерий Стьюдента. Note:р — Student's t-test.
62.8 (27)
27.9 (12) 4,7 (2)
4,7 (2)
0,055 0,100 0,231
0,184
45,5 (10) 45,5 (10) 0 (0)
9,1 (2)
46.3 (25)
44.4 (24) 1,9 (1)
7,4 (4)
0,947 0,936 0,521
0,805
Медиана периода наблюдения пациентов с ПМФ с 1-м типом мутации составила 46 мес (3—133), со 2-м типом — 77 мес (4—115) (табл. 4). При ПМФ медиана уровня гемоглобина оказалась наименьшей в группе «тройных негативных» пациентов, а уровень лейкоцитов — выше в группе «тройных негативных» пациентов, чем в группе с мутациями CALR (р = 0,014). При сравнении уровня тромбоцитов в исследуемых группах этот показатель был наименьшим в группе «тройных негативных» пациентов (р = 0,025). В группе CALR-позитивных пациентов уровень тромбоцитов оказался более высоким у пациентов с ПМФ при мутациях CALR 2-го типа (р = 0,014).
При анализе динамики развития анемического синдрома получены следующие данные. Среди JAK2-позитивных пациентов 28 % имели трансфузи-онную зависимость на момент диагностики заболевания. Среди больных ПМФ с мутацией CALR медиана времени до развития анемии (менее 100 г/ л) составила 37 мес, при этом на момент диагностики она была выявлена у 5 (из 22) и была трансфузионно зависимой у 3 пациентов (13 %). В группе без мутаций у 4 пациентов из 10 анемия констатирована на момент диагностики заболевания, при этом у 3 — гемотрансфузионно зависимая (30 %). Медиана времени до развития клинически значимой анемии
Таблица 3. Клинико-лабораторные особенности пациентов с эссенциальным тромбоцитозом в зависимости от генетических мутаций Table 3. Clinical and laboratory features of essential thrombocytosis patients depending on genetic mutations
Мутации P
Показатель Criteria 1 2 3
JAK2, n = 35 CALR, n = 32 Тройной негативный статус, n = 6 Triple negative, n = 6 1-2 1-3 2-3
Возраст средний (диапазон), лет Age average (range), years 48 (20-70) 51 (16-76) 45,5 (17-68) 0,363 0,867 0,501
Мужской пол, % Male, % 28,6 29,4 33,3 33,3 33,3 33,3
Гемоглобин, г/л Hemoglobin, g/L 135 (100-168) 130,1 (102-142) 133 (110-140) 0,150 0,749 0,560
Тромбоциты, х109/л Platelets, x109/L 920 (611-1638) 944 (603-3209) 1069 (652-1414) 0,074 0,378 0,749
Лейкоциты, x109/j Leukocytes, x109/L 8,4 (4,6-22,1) 6,55 (3,9-24,0) 6,77 (4,6-9,8) 0,067 0,085 0,587
Лейкоциты >11, x109/j Leukocytes >11, x109/L 20 11,8 0 0,274 0,508 0,299
Длинник селезенки, мм Spleen size, mm 116 (85-300) 108,5 (84-200) 97 (93-100) 0,407 0,150 0,110
Срединный размер печени, мм Median liver size, mm 119,8 ± 31,8 131,1 ± 12,2 123,5 ± 6,4 0,237 0,875 0,414
Портальная гипертензия, % Portal hypertension, % 14,3 0 0 0,022 0,335 1,000
Тромбозы в течение наблюдения, % Thrombosis during follow-up, % 37,1 (13) 8,8 (3) 16,7 (1) 0,005 0,341 0,567
Тромбозы на момент диагностики Thrombosis at the time of diagnosis 22,9 (8) 6,3 (2) 0 (0) 0,057 0,706 0,246
Риск тромбозов по шкале IPSET, балл Risk of thrombosis on the IPSET scale, score 1,49 ± 0,56 0,29 ± 0,52 0,67 ± 0,82 <0,001 0,004 0,149
cv со
cs
cv со
Примечание. IPSET — шкала риска развития тромбозов ВОЗ при эссенциальном тромбоцитозе, р — t-критерий Стьюдента. Note. IPSET — International Prognostic Score WHO for essential thrombocytosis, р — Student's t-test.
в группе «тройных негативных» пациентов составила 34,3 мес.
Тромботические осложнения при ПМФ зарегистрированы за период наблюдения при мутациях 1АК2 и CALR соответственно в 20,5 % (п = 8) и в 19,2 % случаев (п = 5), а в группе с «тройным негативным» молекулярным статусом тромботические осложнения не встречались.
Трансформация ПМФ в острый миелоидный лейкоз/смерть больных развивались с одинаковой частотой во всех трех исследованных группах: 1АК2 (п = 3), CALR (п = 3) и 1АК2/CALR-негативные (п = 2). Тип
мутации CALR не оказал влияние на распределение пациентов с ПМФ в зависимости от групп риска по классификации систем IPSS и DIPSS. В группе пациентов с мутацией CALR 1-го типа (делеция) 4 пациента вышли из наблюдения по причине летального исхода (трансформация в ОМЛ).
Обсуждение
Мы последовательно исследовали драйверные мутации у пациентов с ПМФ и ЭТ, учитывая тот факт, что данные мутации были описаны как взаимоисключающие [19, 20]. Наши наблюдения совпадают с иссле-
Таблица 4. Клинико-лабораторные особенности пациентов с первичным миелофиброзом в зависимости от генетических мутаций Table 4. Clinical and laboratory features of primary myelofibrosis patients depending on genetic mutations
cv cv
CS
cv cv
Мутации р
1 2 3
Criteria JAK2, n = 39 cALR, n = 26 Тройной негативный статус, n = 6 n = 6 1-2 1-3 2-3
Возраст средний (диапазон), лет Age average (range), years 55 (20-81) 55,5 (35-76) 61 (18-76) 0,862 0,972 0,909
Гемоглобин, медиана (диапазон), г/л Hemoglobin, median (range), g/L 121 (54-173) 114 (79-140) 100 (83-114) 0,228 0,069 0,065
Тромбоциты, медиана (диапазон), х109/л Platelets, median (range), x109/L 493 (28-2326) 458 (120-1149) 198 (80-260) 0,717 0,102 0,025
Лейкоциты, медиана (диапазон), х109/л Leukocytes, median (range), x109/L 14,7 (3,4-67) 8,8 (3,7-22,6) 22 (80-260) 0,017 0,261 0,014
Размеры селезенки по УЗИ (длинник), см Spleen size, cm 169,56 ± 32,81 178,27 ± 38,77 178 ± 40,46 0,343 0,575 0,988
Портальная гипертензия (по УЗИ) Portal hypertension (ultrasound) 0,44 ± 0,5 0,35 ± 0,49 0,17 ± 0,41 0,445 0,209 0,409
Тромботические осложнения Thrombotic complications 20,5 (8) 19,2 (5) 0 0,78 0,209 0,256
Лейкоцитоз более >25 х109/л Leukocytes >25 x109/L 0,25 ± 0,44 0,19 ± 0,4 0,33 ± 0,52 0,599 0,676 0,468
Появление бластных клеток (1—5 %) в периферической крови Blast cells (1—5 %) in peripheral blood 0,42 ± 0,5 0,58 ± 0,5 0,83 ± 0,41 0,219 0,061 0,256
Трансформация в ОМЛ AML transformation 0,03 ± 0,17 0,04 ± 0,2 0,33 ± 0,52 0,834 0,007 0,025
Время до трансформации в ОМЛ, мес Time to AML transformation, months 83 98 46 ± 25,46 <0,001 0,446 0,344
Примечание. ОМЛ — острый миелоидный лейкоз. Note. AML — acute myeloid leukemia.
дованиями, проведенными на больших когортах пациентов в отношении лабораторных особенностей при различном молекулярном профиле миелопроли-феративного заболевания: носители мутации в гене CALR имеют более низкий уровень лейкоцитов и более высокое содержание тромбоцитов по сравнению с группой больных, имеющих мутацию в гене JAK2 [19, 32, 33, 43]. В отношении концентрации гемоглобина в нашем исследовании у С^^-позитивных пациентов с ЭТ выявлено его более низкое содержание, чем в группе с мутацией JAK2 и «тройным негативным» молекуляр-
ным статусом, однако при использовании 95 % доверительного интервала не получена статистическая значимость. Одним из важнейших наблюдений стало подтверждение более редкой частоты встречаемости тромбозов (венозных и артериальных) при CALR-поло-жительном ЭТ. Более частая встречаемость портальной гипертензии при 7^К2-положительном ЭТ обусловлена, вероятно, высокой частотой тромботических осложнений в сосудах портальной системы.
Что касается ПМФ, то мы не выявили значимых различий в частоте развития тромботических ослож-
нений в зависимости от мутационного статуса. Уровень лейкоцитов при ПМФ у CALR-позитивных пациентов оказался ниже, чем у носителей мутации JAK2 и группы пациентов с молекулярным профилем «triple negativе». Уровень тромбоцитов у больных без драй-верных мутаций был ниже, чем у пациентов с мутацией в гене CALR.
Профиль драйверной генетической мутации не только определяет фенотипические проявления миелопролиферативного заболевания и имеет диагностическую значимость [31], но и отражается на прогностических факторах и рисках в его течении. Случаи с «тройным негативным» молекулярным статусом являются наиболее неблагополучными по выживаемости.
Выводы
1. Риск тромбозов выше среди пациентов с .МО-позитивных ЭТ по сравнению с пациентами с CALR-позитивных ЭТ.
2. Более высокий уровень тромбоцитов, характерный для пациентов с CALR-позитивным ЭТ, не приводит к увеличению риска тромботических осложнений.
3. При ПМФ не выявлено значимых отличий по частоте развития тромботических осложнений в исследуемых группах.
4. Пациенты с ПМФ с мутацией CALR имеют более низкий уровень лейкоцитов в сравнении с группой пациентов .МО-положительных и с «тройным негативным» молекулярным статусом.
CV со
es
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interests. Authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания Минздрава России 2015—2017 гг. «Риск-адаптированные подходы к терапии на основе новых молекулярных факторов прогноза при лимфо- и миело-пролиферативных заболеваниях» (платформа «Онкология и радиационные технологии»). Financing. Work performed under the state order of Ministry of Health of Russia 2015-2017 yy. «Risk-adapted therapy approaches based on new molecular prognosis factors for lympho- and myeloproliferative diseases» (platform «Oncology and Radiation Technologies»).
cv со
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Baxter E.J., Scott L.M., Campbell P.J. et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet 2005;365:1054-1056.
DOI: 10.1016/S0140-6736(05)71142-9. PMID: 15781101.
2. James C., Ugo V., Le Couedic J.P. et al. A unique clonal JAK2 mutation leading
to constitutive signaling causes polycythae-mia vera. Nature 2005;434(7037):1144-1148. DOI: 10.1038/nature03546. PMID: 15793561.
3. Levine R.L., Wadleigh M., Cools J. et al. Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis. Cancer Cell 2005;7(4):387-397. DOI: 10.1016/j. ccr.2005.03.023. PMID: 15837627.
4. Kralovics R., Passamonti F., Buser A.S.
et al. A gain-of-function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders. N Engl J Med 2005;352(17):1779-1790. DOI: 10.1056/NEJMoa051113. PMID: 15858187.
5. Levine R.L., Belisle C., Wadleigh M. et al. X-inactivation-based clonality analysis and
quantitative JAK2V617F assessment reveals a strong association between clonality and JAK2V617F in PV but not ET/MMM, and identifies a subset of JAK2V617F-negative ET and MMM patients with clonal hema-topoiesis. Blood 2006;107(10):4139-4141. DOI: 10.1182/blood-2005-09-3900. PMID: 16434490.
6. Antonioli E., Guglielmelli P., Pancrazzi A. et al. Clinical implications of the JAK2 V617F mutation in essential thrombocythemia. Leukemia 2005;19:1847-1849. DOI: 10.1038/sj.leu.2403902.
PMID: 16079890.
7. Campbell P.J., Scott L.M., Buck G. et al. Definition of subtypes of essential thrombo-cythaemia and relation to polycythaemia vera based on JAK2 V617F mutation status:a prospective study. Lancet 2005;366:1945-1953. DOI: 10.1016/ S0140-6736(05)67785-9. PMID: 16325696.
8. Jones A.V., Kreil S., Zoi K. et al. Widespread occurrence of the JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders. Blood 2005;106(6):2162-2168. DOI: 10.1182/blood-2005-03-1320. PMID: 15920007.
9. Wolanskyj A.P., Lasho T.L., Schwager S.M. et al. JAK2 mutation in essential thrombo-cythaemia: clinical associations and long-term prognostic relevance. Br J Haematol 2005;131(2):208-213. DOI: 10.1111/j. 1365-2141.2005.05764.x. PMID: 16197451.
10. Campbell P.J., Griesshammer M., Dohner K. et al. V617F mutation in JAK2 is associated with poorer survival in idiopathic myelofibrosis. Blood 2006;107:2098-2100.
DOI: 10.1182/blood-2005-08-3395. PMID: 16293597.
11. Tefferi A., Lasho T.L., Schwager S.M. et al. The JAK2(V617F) tyrosine kinase mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia: lineage specificity and clinical correlates. Br J Haematol 2005;131(3):320-328. DOI: 10.1111/j.1365-2141.2005.05776.x. PMID: 16225651.
12. Passamonti F., Elena C., Schnittger S. et al. Molecular and clinical features of the my-eloproliferative neoplasm associated with JAK2 exon 12 mutations. Blood 2011;117(10):2813-6. DOI: 10.1182/ blood-2010-11-316810. PMID: 21224469.
13. Kisseleva T., Bhattacharya S., Braunstein J., Schindler C.W. Signaling through the JAK/
сч сч
es
cv cv
STAT pathway, recent advances and future challenges. Gene 2002;285(1-2):1-24. PMID: 12039028.
14. Sandberg E.M., Wallace T.A., Godeny M.D. et al. Jak2 tyrosine kinase: a true jak of all trades? Cell Biochem Biophys 2004;41(2):207-232. PMID: 15475610.
15. Zhao R., Xing S., Li Z. et al. Identification of an acquired JAK2 mutation in polycythemia vera. J Biol Chem 2005;280(24):22788-22792. DOI: 10.1074/ jbc.C500138200. PMID: 15863514.
16. Staerk J., Lacout C., Sato T. et al. An am-phipathic motif at the transmembrane-cy-toplasmic junction prevents autonomous activation of the thrombopoietin receptor. Blood 2006;107(5):1864-1871.
DOI: 10.1182/blood-2005-06-2600. PMID: 16249382.
17. Pikman Y., Lee B.H., Mercher T. et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med 2006;3(7):e270. DOI: 10.1371/journal.pmed.0030270. PMID: 16834459.
18. Pardanani A.D., Levine R.L., Lasho T.
et al. MPL515 mutations in myeloprolifera-tive and other myeloid disorders: a study of 1182 patients. Blood 2006;108(10):3472-6. DOI: 10.1182/blood-2006-04-018879. PMID: 16868251.
19. Klampfl T., Gisslinger H., Harutyunyan A.S. et al. Somatic Mutations of Calreticulin
in Myeloproliferative Neoplasms. N Engl J Med 2013;369(25):2379-2390. DOI: 10.1056/NEJMoa1311347. PMID: 24325356.
20. Nangalia J., Massie C.E., Baxter E.J. et al. Somatic CALR Mutations in Myeloprolif-erative Neoplasms with Nonmutated JAK2. N Engl J Med 2013;369(25):2391-2405. DOI: 10.1056/NEJMoa1312542. PMID: 24325359.
21. Rumi E., Pietra D., Ferretti V. et al. Associ-azione Italiana per la Ricerca sul Cancro Gruppo Italiano Malattie Mieloprolifera-tive Investigators. JAK2 or CALR mutation status defines subtypes of essential throm-bocythemia with substantially different clinical course and outcomes. Blood 2014;123(10):1544-1551. DOI: 10.1182/ blood-2013-11-539098. PMID: 24366362.
22. Cabagnols X., Defour J.P., Ugo V. et al. Differential association of calreticulin type 1 and type 2 mutations with myelofi-brosis and essential thrombocytemia: relevance for disease evolution. Leukemia 2015;29:249-252. DOI: 10.1038/ leu.2014.270. PMID: 25212275.
23. Chachoua I., Pecquet C., El-Khoury M. et al. Thrombopoietin receptor activation by myeloproliferative neoplasm associated
calreticulin mutants. Blood 2016;127(10):1325-35. DOI: 10.1182/ blood-2015-11-681932. PMID: 26668133.
24. Araki M., Yang Y., Masubuchi N. et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Blood 2016;127(10):1307-1316. DOI: 10.1182/ blood-2015-09-671172. PMID: 26817954.
25. Abdel-Wahab O., Manshouri T., Patel J. et al. Genetic analysis of transforming events that convert chronic myeloprolifera-tive neoplasms to leukemias. Cancer Res 2010;70(2):447-452. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-09-3783. PMID: 20068184.
26. Delhommeau F., Dupont S., Della Valle V. et al. Mutation in TET2 in myeloid cancers. N Engl J Med 2009;360(22):2289-2301. DOI: 10.1056/NEJMoa0810069. PMID: 19474426.
27. Zhang S.J., Rampal R., Manshouri T. et al. Genetic analysis of patients with leukemic transformation of myeloproliferative neoplasms shows recurrent SRSF2 mutations that are associated with adverse outcome. Blood 2012;119(19):4480-4485.
DOI: 10.1182/blood-2011-11-390252 PMID: 22431577.
28. Tefferi A., Lasho T.L., Finke C.M. et al. CALR vs JAK2 vs MPL-mutated or triple-negative myelofibrosis: clinical, cytogenetic and molecular comparisons. Leukemia 2014;28(7):1472-1477. DOI: 10.1038/ leu.2014.3. PMID: 24402162.
29. Rampal R., Ahn J., Abdel-Wahab O. et al. Genomic and functional analysis of leukemic transformation of myeloproliferative neoplasms. Proc Natl Acad Sci USA 2014;111(50):E5401-E5410.
DOI: 10.1073/pnas.1407792111. PMID: 25516983.
30. Skoda R.C., Duek A., Grisouard J. Pathoge-nesis of myeloproliferative neoplasms.
Exp Hematol 2015;43(8):599-608. DOI: 10.1016/j.exphem.2015.06.007. PMID: 26209551.
31. Arber D.A., Orazi A., Hasserjian R. et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood 2016;127(20):2391-2405. DOI: 10.1182/ blood-2016-03-643544. PMID: 27069254.
32. Rumi E., Pietra D., Pascutto C. et al. Clinical effect of driver mutations of JAK2, CALR, or MPL in primary myelofibrosis. Blood 2014;124(7):1062-9. DOI: 10.1182/ blood-2014-05-578435. PMID: 24986690.
33. Tefferi A., Wassie E.A., Lasho T.L. et al. Calreticulin mutations and long-term survival in essential thrombocythemia. Leukemia 2014;28(12):2300-3. DOI: 10.1038/ leu.2014.148. PMID: 24791854.
34. Andrikovics H., Krahling T., Balassa K.
et al. Distinct clinical characteristics of my-eloproliferative neoplasms with calreticulin mutations. Haematologica 2014;99(7):1184-1190. DOI: 10.3324/hae-matol.2014.107482. PMID: 24895336.
35. Roques M., Park J.H., Minello A. et al. Detection of the CALR mutation in the diagnosis of splanchnic vein thrombosis.
Br J Haematol 2015;169(4):601-603. DOI: 10.1111/bjh.13235. PMID: 25413838.
36. Turon F., Cervantes F., Colomer D. et al. Role of calreticulin mutations in the aetio-logical diagnosis of splanchnic vein thrombosis. J Hepatol 2015;62(1):72-74. DOI: 10.1016/j.jhep.2014.08.032. PMID: 25173966.
37. Sazawal S., Singh N., Mahapatra M. et al. Calreticulin mutation profile in Indian patients with primary myelofibrosis. Hematol-ogy 2015;20(10):567-570.
DOI: 10.1179/1607845415Y.0000000018. PMID: 25959795.
38. Tefferi A., Lasho T.L., Finke C. et al. Type 1 vs type 2 calreticulin mutations in primary myelofibrosis: differences in phenotype and prognostic impact. Leukemia 2014;28(7):1568-1570. DOI: 10.1038/ leu.2014.83. PMID: 24569778.
39. Tefferi A., Wassie EA., Guglielmelli P.
et al. Type 1 versus Type 2 calreticulin mutations in essential thrombocythemia: a collaborative study of 1027 patients. Am J Hematol 2014;89(8):E121-E124. DOI: 10.1002/ajh.23743. PMID: 24753125.
40. Tefferi A., Vardiman J.W Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: the 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algorithms. Leukemia 2008;22(1):14-22.
DOI: 10.1038/sj.leu.24049550. PMID: 17882280.
41. Cervantes F., Dupriez B., Pereira A. et al. New prognostic scoring system for primary myelofibrosis based on a study of the International Working Group for Myelofibrosis Research and Treatment. Blood 2009;113(13):2895-901.
42. Passamonti F., Cervantes F., Vannucchi A.M. et al. A dynamic prognostic model to predict survival in primary myelofibrosis:a study by the IWG-MRT (International Working Group for Myeloproliferative Neoplasms Research and Treatment). Blood 2010;115(9):1703-8.
43. Al Assaf C., Van Obbergh F., Billiet J. et al. Analysis of phenotype and outcome
in essential thrombocythemia with CALR or JAK2 mutations. Haematologica 2015;100(7):893-897. DOI: 10.3324/hae-matol.2014.118299. PMID: 25934766.
Статья поступила: 10.08.2017. Принята в печать: 31.08.2017. Article received: 10.08.2017. Accepted for publication: 31.08.2017.
