CC BY
35
УДК 616. 33 - 008.3 : 616 - 071 Харченко А.В.
КОМПЛЕКСНАЯ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ПРЕДОПУХОЛЕВЫХ ПРОЦЕССОВ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА
ПНПУ имени В.Г. Короленко, г. Полтава
В участках дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка выявлена повышенная пролиферативная активность эпителия, которая подтверждена иммуногистохимически повышенной экспансией маркера Ki-67(IM>30,0%). Показатели митотического режима эпителия слизистой оболочки желудка преобладают в участках дисплазии. Проводимая диагностика показала изменения ДНК эпителия слизистой оболочки желудка, характерные для дисплазии эпителия разной степени тяжести. В случаях с указаными дисплазиями произошли изменения в виде увеличения размеров ампликонов, характерных для каждой из групп. Указаные изменения носят характер микросателлитных экспансий. Существует сильная кореляционная связь между степенью дисплазии определяемой по фенотипическим признакам и показателями характерными для ДНК-типирования эпителия слизистой оболочки желудка. Коэфициент кореляции Пирсона rxy. составил соответственно 0,863 и 0,917. Общий результат свидетельствует о существовании статистически достоверной зависимости с вероятностью 0,99.
Ключевые слова: ДНК, ампликоны, фенотип.
Исследование является фрагментом научно-исследовательской работы Харьковского национального медицинского университета «Формирование современных методов хирургического лечения и профилактики осложнений заболеваний и травм органов грудной клетки и брюшной полости» (№ госрегистрации 0110U002649).
Вступление
Диагностика дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка, как предопухолевых изменений является актуальной, всёже только метода биопсии с последующим гистологическим исследованием биоптатов недостаточно для разрешения этой важной диагностической проблемы [2, 4]. Тяжелая дисплазия характеризована клеточной атипией, анизокариозом, гиперхроматозом ядер, резким увеличением ядерно-цитоплазматических
соотношений и распространенной
псевдостратификацией. Среднее содержание ДНК и число клеток в фазе синтеза ДНК резко увеличено [5].
что злокачественная
имеет определённые геноме клеток, это, в свою быть выявлено при анализе
Известно, трансформация перестройки в очередь, может
геномной ДНК [3, 4].
Гистологический метод является
обязательным методом морфологической диагностики злокачественных опухолей, но при разрешении диференциально-диагностической проблемы между дисплазией и раком желудка его разрешающей способности недостаточно.
PCR является универсальной техникой, которую активно используют с середины 80-х годов. Среди многочисленных маркеров, основанных на использовании PCR, особое место занимают те, которые являются фрагментами ДНК, размещёнными между локусами инвертных повторов ДНК: ISSR (Inter simple sequence repeats). Использованию этих маркеров предшествует открытие того факта, что эукариотные геномы в среднем на 30-90%
представлены високо полиморфными повторяющимися последовательностями.
Повторяющаяся ДНК выполняет своеобразную функцию по абсорбции мутаций в геноме[6].
Относительная насыщенность геномов теми или иными микросателлитными
последовательностями является результатом действия многих факторов, среди которых одним из основных является уровень стабильности микросателлитной ДНК. Интенсивное удлиннение микросателлитных последовательностей за счёт репликационных ошибок имеет название микросателлитной экспансии[7].
Большенство микросателлитных мутаций связаны с инсерциями или делециями некоторых повторов, которые совершаются во время репликации.Такое нарушение стабильности микросателлитов чаще всего происходит благодаря образованию петель на ДНК во время репликации(<^Ирраде») [8].
Характер и закономерности распределения в генгоме микросателлитов имеет особый интерес благодаря той роли, которую они играют в развитии онкологических заболеваний [7, 10].
Целью нашего исследования является обнаружение диспластических изменений в слизистой оболочке желудка при помощи иммуногистохимического и молекулярно-биологического метода у пациентов с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки.
Материалы и методы исследования
В работу положено результаты исследований 50 наблюдений слизистой оболочки желудков, которые резецированы по поводу хронической
язвы двенадцатиперстной кишки. Фиксатором служил 10% раствор нейтрального формалина. Объём фиксирующей жидкости в 30 раз превышал объём материала. После промывки под проточной водой в течении 12 часов препараты слизистой оболочки желудка заливали в парафин по общепринятым схемам. Срезы получали из парафиновых блоков на микротоме МПС-2.
Иммуногистохимическое выявление
пролиферации эпителия слизистой оболочки желудка проводили при помощи маркера Ki-67 на депарафинированых срезах толщиной 4-5 мм., с предварительной демаскировкой антигена в цитратном буфере (рН 6,0) в микроволновой печи в течении 1о мин. В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела к Ki-67 (клон М1В-1). Инкубацию с первичными антителами проводили в течении 18 часов. Идентификация реакции проводилась при помощи хромогена 3,3'= диаминобензидин тетрахлорида (DAB, Dako Cytomation). Срезы контрастировали при помощи гематоксилина-эозина.
Для молекулярно-биологического
исследования брали образцы слизистой оболоцки желудка с признаками дисплазии разной степени, в которых изучали изменения ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (PCR) [8; 9].
Индивидуальное ДНК-типирование
(генотипирование) образцов слизистой оболочки желудка проводили путём амплификации ДНК в PCR с исполдьзованием ISSR - праймера S2, который имел структуру: (AGC)6G [8].
Амплификацию проводили в 25 мкл реакционной смеси, которая содержала 1* реактивный буфер с трифосфатами, праймер приведённой структуры, Тад-полимеразу («Тапотили», ВНИИ генетики, Россия), ДНК добавляли в количестве 10 - 20 нг на реакцию. Температура оджига праймера составляла 57°C, синтез фрагментов ДНК проходил в 30 циклах амплификации на термоциклере (амплификаторе) «Терцик» ТП4-ПЦР 01 («ДНК - технология», Россия) в режиме: I - 95°-2мин., II - 94°-30мин, 57°-2мин, 72°-2мин, III - 72°-10мин. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации проводили в 2%-м горизонтальном агарозном геле (Вагофор, Латвия) в 1* TBE-буфере с последующим их окрашиванием в течении 10 мин в 0,5мкг/мл растворе бромистого этидя и многоразовой промывкой в проточной воде. Визуализацию электрофореграмм проводили на трансилюминаторе в ультрафиолетовом свете с длиной волны 365 нм с последующим фотографированием. Определение размеров ампликонов выполняли при помощи маркера молекулярной массы 1000вр DNA-Ledder, pUC 19 DNA/ Msp I («Fermentas», Литва) [1].
Результаты исследования и их обсуждение
Рис.1 Высокая пролиферативная активность покривно-ямочного эпителия в участке слабой дисплазии его, а
также в центре лимфоидного фолликула и распространённых в строме клеток воспалительного инфильтрата. Маркер К-67. Увеличение 100.
У пациентов больных хронической язвой двенадцатиперстной кишки, на фоне вираженых форм хронического атрофического и атрофически-гиперпластического гастрита в слизистой оболочке желудка пилорического отдела и малой кривизны показатель митотического индекса был почти одинаковым (рис.2).
□П ШМК ЩТ
Рис.2. Митотический режим эпителия слизистой оболочки желудка у больных хронической язвой двенадцатиперстной кишки. П - пилорический отдел желудка. МК - малая кривизна. Т - тело. 1кв -митотический индекс %. 2кв - количество митозов (%) в метафазе. 3кв - количество патологических митозов (%).
Показатель митотического индекса в теле желудка (7,8±1,6%о) был достоверно(р<0,01) ниже чем в пилорическом отделе (16,5±4,2%) и на малой кривизне(16,0±2,4%) (рис.2).
Между показателями количества митозов в метафазе пилорического отдела (37,8±7,8%) и малой кривизны (38,8±3,7%) достоверной разницы не было.
В теле желудка количество митозов в метафазе (20,0±3,1%) было достоверно ниже (р<0,01) чем в пилорическом отделе (37,6±7,8%) и на малой кривизне (38,8±3,7%).
Что касается патологических митозов (рис.3.), то отмечается их достоверное снижение (р<0,01) в теле желудка (3,7±1,5%) в
1 кв
2 кв
3 кв
сравнении с пилорическим отделом (10,6+1,3%) и малой кривизной (9,0+1,4%) и не было достоверной разницы между пилорическим отделом и малой кривизной.
Рис.3. Патологические митозы в глубине ямок желудка. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение 600.
Высокая пролиферативная активность эпителия слизистой оболочки желудка подтверждается экспансией маркера Ю-67 с индексом метки (ИМ) >30,0% (рис. 1).
Генотипирование эпителия слизистой оболочки желудка пациентов больных хронической язвой двенадцатиперстной кишки, обнаружило разнообразные амплификационные профили ДНК слизистой оболочки желудка.
Среди разнообразия образцов удалось сгрупировать ДНК-профили соответственно к фенотипическим признакам и выделить ПЦР-типы (рис. 4).
Профили маркера слизизистой оболочки желудка в норме содержали фрагменты размером 190, 180, 160, 140, 120, 110, 90, 70, 60 п.н.(пар нуклеотидов) и были идентичны в пределах своей группы, однако существенно отличались от ДНК-профилей других исследуемых групп. ДНК-профили размером 220, 210, 200, 190, 180, 160, 140, 120, 110, 100, 90 п.н. соответствовали фенотипу дисплазии первой степени (Д-1). А фенотипы дисплазии второй степени (Д-11) в 90% случаев имели вариант ДНК-профилей размером 300, 260, 240, 220, 210, 190, 180, 160, 140, 120, 100 п.н.(первый вариант), остальные же имели ДНК-профили (второй вариант) 500, 480, 440, 400, 360, 300, 240, 200, 140, 110, 100 п.н.(рис. 5), фенотипы дисплазии третьей степени (Д-Ш) имели ДНК-профили только одного варианта размером 520, 500, 480 460, 440, 420, 410, 380, 360,340,320 п.н.(рис.6).
4С
ХВДПК
[□Д1 ПДИ РДИ' РДИ1 |
Рис. 4. Распределение ДНК-профилей слизистой оболочки желудка у больных с хронической язвой д венадцатиперстной кишки.
ДНК-профили слизистой оболочки желудка, которые соответствовали фенотипу Д-1 имели определённое сходство (63,6%) с маркером нормы.
Фенотипу Д-11 соответствовали два варианта ДНК-профилей с присутсвием ампликонов размером в пределах 500 п.н. и без них. Последние имели значительное подобие на уровне 36,4% с ДНК-профилями слизистой оболочки желудка типа Д-Ш. Это свидетельствует, что ДНК-профили Д-11 изменяются и имеют переходные формы к пЦр типу Д-Ш.
4
■
I
Рис. 5 Электрофореграмы продуктов амплификата образцов ДНК слизистой оболочки желудка Д-11:
1, 4 - амплификационные профили Д-11 первого варианта;
2,3 - амплификационные профили Д-11 второго варианта;
М - маркер размера фрагментов ДНК.
ДНК профили слизистой оболочки желудка с Д-Ш содержали ампликоны размером 520 п.н. и имели генетическое отличие от других групп наблюдения, но были подобны в пределах своей группы. ДНК-профили по результатам проведения типирования методом ISSR-PCR в каждом случае выявляются по максимальному проявлению дисплазии. Если фенотипически в
слизистой оболочке выявлена одновременно дисплазия от Д-1 до Д-111, то результат генотипирования будет отвечать
максимальному показателю Д-111 с ДНК-профилями, котрые имеют ампликоны размером 520 п.н. Амплификационные профили Д-11 имеют два варианта, однако втрой вариант имеет определённое сходство с профилем Д-111.
1,2 - профили Д-111; М - маркер размера фрагментов ДНК.
С целью определения определённой зависимости между показателями ДНК-типирования образцов слизовоТ оболонки по методу ISSR-PCR и степенью выраженности дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка больных с хронической язвой двенадцатиперстной кишки по фенотипическим признакам, а также между степнью выраженности последней и показателями митотического режима, а также маркера Ю-67 проведен кореляционный анализ. (табл.).
Рис. 6. Электрофореграмы продуктов амплификата образцов ДНК слизистой оболочки желудка:
Таблица
Результаты кореляционного анализа между показателями дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка по фенотипическим признакам и показателями по результатам генотипирования у больных с хронической язвой
двенадцатиперстной кишки.
Степень дисплазии- ДНК-тип min Степень дисплазии - ДНК-тип max
Коэфициент кореляции Пирсона Гху 0,863 0,917
Теснота связи сильная очень сильная
Коэфициент детерминации й=гхул2 0,744 0,842
Критическое значение коэфициента кореляции с вероятностью 0,95 0,2732 0,2732
Критическое значение коэфициента кореляции с вероятностью 0,99 0,3511 0,3511
Сравнение коэфициента кореляции гху с критическим (табличным) значением гсГ для значимости 0,95 Гху>Гсг Гху>Гсг
Сравнение коэфициента кореляции гху с критическим (табличным) значением гсГ для значимости 0,99 Гху>Гсг Гху>Гсг
Коэфициент ковариации 78,673 100,898
Общий результат статистически достоверная зависимость с вероятностью 0,99 статистически достоверная зависимость с вероятностью 0,99
Между степень дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка по фенотипическим признакам и показателями ДнК-типирования образцов слизистой оболочки желудка коэфициент кореляции Пирсона гху сосставляет соответственно 0,863 i 0,917, что означает сильную и очень сильную по тесноте связь между показателями. Коэфициент детерминации D=rxyл2 сорставил 0,744 i 0,842 соответственно. Критическое значение коэфициента кореляции с вероятностью 0,95 было 0,2732. Критическое значение коэфициента кореляции с вероятностью 0,99 было 0,3511. Сравнение коэфициента кореляции гху с критическим (табличным) значением гсг для значимости 0,95
соответствовало гху>гсг. Сравнение коэфициента кореляции гху с критическим (табличным) значением гсг для значимости 0,99 соответствовало гху>гсг. Коэфициент ковариации был 78,673 и 100,898 соответственно, что даёт возможность сделать вывод статистически достоверной зависимости между указаными показателями с вероятностью 0,99 (табл.).
Выводы
В участках дисплазии эпителия слизистой оболочки выявляется повышенная
пролиферативная активность эпителия, что подтверждено иммуногистохимически
повышенной экспансией маркера Ю-67(1М>30,0%). Показатели митотического режима эпителия слизистой оболочки желудка
преобладают в участках дисплазии.
Дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка у больных с хронической язвой двенадцатиперстной кишки по результатам генотипирования эпителия слизистой оболочки желудка при помощи реакции ISSR-PCR имеют характерные изменения, которые находятся в соответствующей зависимости с их ДНК-профилями.
Амплификационный ДНК-профиль нормы имеет спектр ампликонов розмером в пределах от 190 - 60 п.н., дисплазия (Д-1) слабо вираженая имеет амплификационный ДНК-профиль со спектром ампликонов розмером от 220 до 60 п.н., дисплазия (Д-11) умеренно выраженная в 90% имеет амплификационные ДНК-профили со спектром ампликонов размером 300 - 100 п.н. (I - вариант) и в 10% ДНК-профили 500 - 100 п.н. (II - вариант), что свидетельствует о генетической
неоднородности дисплазий второй степени. Дисплазия Д-Ш имеет один вариант амплификационного ДНК-профиля со спектром ампликонов 520 - 320 п.н. Реакция ISSR-PCR выявляет удлиннение микросателлитных последовательностей ДНК.
По результатам генотипирования эпителия слизистой оболочки желудка мы наблюдаем микросателлитные экспансии. Удлиннение микросателлитных последовательностей за счёт репликационных ошибок называется микросателлитными экспансиями.
Существует сильная по тесноте связь между степенью дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка по фенотипическим признакам и показателями ДНК-типирования образцов слизистой оболочки желудка, коэфициент кореляции Пирсона гху. составил соответственно 0,863 и 0,917. Общий результат свидетельствует о существовании
статистически достоверной зависимости с вероятностью 0,99.
ISSR-PCR является информативным методом для выявления изменений генетической структуры эпителия слизистой оболочки желудка. Учитывая доступность, относительную простоту и возможность визуального считывания результатов без применения специальной апаратуры, с успехом применён при изучении ДНК-типирования эпителия слизистой оболочки жеклудка с фенотипами дисплазий эпителия и позволяет выявить изменения, которые в них происходят.
Перспективы дальнейших исследований
В дальнейшем маркер ISSR-PCR планируется исследовать на практике с целью диагностики неопластических изменений эпителия слизистой оболочки желудка у больных с другими заболеваниями желудка.
Литература
10.
Абрамов Д.Д. Точность метода полимеразной цепной реакции «в реальном времени» / Д.Д.Абрамов, Д.Ю.Трофимов, Д.В Ребриков // Прикл. биохимия и микробиология. - 2006. Т.42. С.485 - 488.
Аруин Л.И. Новая Международная классификация дисплазий слизистой оболочки желудка / Л.И. Аруин // Росс. журн. гастроэнтерол., гепатол., колонопроктол. - 2002. - №3. - С.15 -17.
Канцерогенез / Под ред Д.Г.Заридзе. - Москва: Медицина, 2004. - 576 с.
Карселадзе А.И. Некоторые основополагающие понятия онкоморфологии в свете достижений современной молекулярной биологии / А.И. Карселадзе // Арх. пат. - 2009. -Вып.5. - С.17-21.
Серов В.В. Ранний рак желудка: морфология, гисто- и морфогенез / В.В.Серов, В.Б.Золотаревский, А.В. Берестова // Арх. патол.- 1990.- №5. - С. 70 - 74.
Baldi P. Sequence analysis by additive scales: DNA structure for sequences and repeats lengths / P. Baldi, P.F. Baisnee // Bioinformatics. - 2000. - V. 16. - P. 865 - 889. Freimer N.B. Microsatellites: evolution and mutational process / N.B. Freimer, M. Slatkin // Ciba Found Symp. - 1996. - №197. -Р. 51 - 67
Mullis K.B. Specific syntesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction / K.B.Mullis, F.Faloona // Meth. Ensymol.
- 1987. - №155. - C.335 - 350.
Tsanev R. Molecular mechanisms of cancer cells survival / R.Tsanev // J.BUON. - 2005. - №10. P.309 - 318. Wooster R. Instability of short tandem repeats (microsatellites) in human cancers / R.Wooster, A.M.Cleton-Jansen, N.Collins, J.Mangion, R.S.Cornelis, C.S.Cooper, B.A.Gusterson, B.A.Ponder, A.von Deimling, O.D.Wiestler // Nat Genet. - 1999. - №6. - Р.152
- 156.
2
3
4
5
6
7
8
9
Резюме
КОМПЛЕКСНА ИМУНОГ1СТОХ1М1ЧНА I МОЛЕКУЛЯРНО-БЮЛОГ1ЧНА Д1АГНОСТИКА ПЕРЕДПУХЛИННИХ ПРОЦЕС1В СЛИЗОВО1 ОБОПОНКИ ШЛУНКА Харченко А.В.
Ключовi слова: ДНК, амплкони, фенотип.
В осередках дисплази еп1тел1ю слизово''' оболонки шлунка виявлена пщвищена прол1феративна активн1сть, яка пщтверджена имуног1стох1м1чно п1двищеною експанс1ею маркеру №-67(1М>30,0%). Показники м1тотичного режиму еп1тел1ю слизово''' оболонки шлунка переважають в осередках дисплази.
Д1агностика, яка проводилась, показала змши ДНК еп1тел1ю слизово' оболонки шлунка, характеры для дисплази еп1тел1ю р1зного ступеня тяжкост1. У випадках з указаними дисплаз1ями в1дбулися змши у вигляд1 зб1льшення розм1р1в ампл1кон1в, характерних для кожно''' з груп. Указан! змши мають характер м1кросател1тних експансш. 1снуе сильний кореляц1йний зв'язок м1ж ступенем дисплази, що визначаеться за фенотип1чними ознаками i показниками характерними для ДНК-типування еттелш слизово' оболонки шлунка. Коефiцiент кореляци Пiрсона rxy. склав вiдповiдно 0,863 i 0,917. Загальний результат свщчить про iснування статистично достовiрноl залежност з вiрогiднiстю 0,99.
Summary.
IMMUNOHISTOCHEMICAL AND MOLECULAR-BIOLOGICAL DIAGNOSIS OF PRETUMOROUS PROCESSES OF GASTRIC
MUCOSA
Kharchenko A.V.
Key words: DNA, amplicones, phenotype.
In the foci of epithelial dysplasia of gastric mucosa there has been revealed increased proliferative activity, which is confirmed by the increased immunohistochemical expansion of the Ki-67 marker (MI> 30.0%). The parameters of mitotic mode of gastric epithelial mucosa cells predominate in dysplasia.
Diagnostic procedures have shown DNA changes in gastric epithelium which are typical for epithelial dysplasia of varying severity. In the cases of dysplasia mentioned above the changes are manifested by the increased in size amplicones specific to each of the group. Above mentioned changes are mainly presented by the microsatellite expansion nature. There is a strong correlation between the severity of dysplasia that is determined by phenotypic characteristics and parameters specific to DNA typing of epithelial gastric mucosa. Pearson correlation coefficient rxy was 0.863 and 0.917 respectively. The overall result indicates the existence of statistically significant dependence of 0.99 likelihood.
