CC BY
28
МОРФОЛОГ1ЧН1 АСПЕКТИ
© Харченко О.В.
УДК 616.33 - 006 : 616 - 07
КОМПЛЕКСНА Д1АГНОСТИКА ВИРАЗКОВО-1НФ1ЛЬТРАТИВНОГО РАКУ ШЛУНКА*
Харченко О.В.
Полтавський нацюнальний педагопчний унiверситет iменi В.Г.Короленка, м. Полтава
Комплексная диагностика, проведённая при помощи гистологического метода с определением митотического режима, иммуногистохимического маркера К-67 (клон М1В-1) и маркера генотипирования 1ББЯ-РСЯ показала изменения эпителия слизистой оболочки желудка характерные для неоплазии слизистой оболочки желудка у пациентов с язвенно-инфильтративным раком желудка. Экспансия маркера генотипирования 1ББЯ-РСЯ свидетельствует о его высокой чувствительности и информативности. Существует кореляционная связь между показателями гистологического, иммунногистохимического и показателями генотипирования при помощи реакции НБЯ-РСЯ. Коэ-фициент кореляции Пирсона гху между показателями митотического режима, пролиферативной активности эпителия слизистой оболочки желудка маркера К-67 и показателями генотипирорвания эпителия слизистой оболочки желудка составляет соответственно 0,197, 0,607и 0,881, что свидетельствует о существовании соответственно умеренной и значительной по тесноте связи между показателями. Общий результат свидетельствует о существовании статистически достоверной зависимости с вероятностью 0,99.
Ключевые слова: митотический режим, маркер К1-67, генотипирование.
Вступ
Основною причиною смерт1 в розвинутих краТнах по-ряд 1з смертнютю вщ серцево-судинних процеав I Тх ускладнень е смертнють вщ злоякюних пухлин. Рак шлу-нка щороку вражае 750 - 870 тис. чолов1к в свт, на його частку припадае 10% вщ летальних випадгав, обумовле-них пухлинною патолопею. В УкраТы в 2009р. рак шлун-ка займав 3-е (9,0%) мюце в структур! онкопатологп чо-ловшв I 6-е (5,6%) мюце у ж1нок; в структур! онкосмерт-ност1 в1н посщае 2-ге (11,8 I 9,3%) мюце в обох групах [5, 10].
Передумовами розвитку раку шлунка з хронычно'Т виразки шлунка прийнято вважати дослщжуваы в на-вколишнм ТТ слизовм оболонц1 зм1нення типу хроычного гастриту, що супроводжуеться дисрегенераторними процесами з утворенням дисплаз1й еп1тел1ю [1, 3, 6]. Останы, особливо тяжкого ступеня, часто бувають маркером юнування поблизу раковоТ пухлини [11].
Складними для д1агностики е виразково-1нф1льтративн1 раки шлунка. Вказана форма раку на ранн1х стад1ях може симулювати звичайну виразку, це утруднюе ТТ диференц1йну д1агностику з останньою [4, 6]. Виразкова ракова пухлина шлунка може, як I звичайна виразка загоюватись. Але загоювання знову змЫюеться на виразкування I тага цикли можуть повторюватись неодноразово. Через те, що рак шлунка розвиваеться по-р1вняно пов1льно тага цикли можуть повторюватись неодноразово [6, 12].
Метою даного дослщження е комплексна д1агностика передпухлинних зм1н в слизов1й оболонц1 шлунка та ви-явлення раку шлунка за допомогою г1столог1чного, 1муно-г1стох1м1чного та молекулярно-бюлопчного метод1в.
Матерiал та методи дослщжень
В роботу покладено результати дослщження 50 спостережень виразковочнфтьтративного раку шлунка. Оперативно видален шлунки досл1джен1 з метою виявлення морфолопчних особливостей стану слизо-воТ оболонки шлунка.
Отриман зразки слизовоТ оболонки шлунка досль джували загальног1столог1чним методом за стандарт-ними схемами, що включае ф1ксац1ю тканини в нейтральному формалшк Матер1ал обробляли у парафь нов1й заливц1. Зр1зи забарвлювали гематоксилЫом-еозином I п1крофуксином за ван-Пзоном.
1муног1стох1м1чне виявлення прол1ферац1Т еп1тел1ю слизовоТ оболонки шлунка проводили за допомогою маркеру К1-67 на депарафшованих зр1зах товщиною 45 мм., 1з попередньою демаск1ровкою антигену в цит-ратному буфер! (рН 6,0) у м1крохвильовш печ1 протя-гом 10 хв. В якост1 первинних антитт використовува-ли моноклональн1 антитта до К1-67 (клон М1В-1). 1нку-бац1ю з первинними антит1лами проводили протягом 18 годин. 1дентиф1кац1я реакци проводилась за допомогою хромогену 3,3'= д1ам1нобензидин тетрахлори-ду(DAB, Dako Cytomation). Зр1зи контрастували за допомогою гематоксил1на-еозина.
* Цитування при атесгацП кадр/в: Харченко О.В.. Комплексна д/агностика виразково-нфльтративного раку шлунка // Проблеми еколопИ медицини. - 2014. - Т. 18, № 1-2. - С. 56 -58
Паралельно проводили дослщження слизовоТ оболонки шлунка за допомогою полiмеразноТ ланцю-говоТ реакцп. Застосовували ISSR-PCR метод з вико-ристанням ISSR - праймеру S2, який мае структуру: (AGC)aG [7, 8, 9, 13].
Амплiфiкацiю проводили в 25 мкл реакцiйноТ сумшк ДНК додавали в кiлькостi 10 - 20 нг на реакцю. Температура вщпалу праймера становила 57°C, синтез фрагменпв ДНК проходила в 30 циклах амплiфiкацiТ [8].
Електрофоретичне роздтення продуктiв амплiфiкацiТ проводили в 2%-му горизонтальному агарозному гелi (Вагофор, Латвiя).
Вiзуалiзацiю електрофореграм проводили на трансiлюмiнаторi в ультрафiолетовому свiтлi довжи-ною хвилi 365 нм з наступним фотографуванням.
Визначення розмiрiв амплiконiв виконували за допомогою маркера молекулярноТ маси 1000вр DNA-Ledder, pUC 19 DNA/ Msp I («Fermentas», Л™а)[8, 13].
Для оцiнки вираження порушень мiтозу використо-вували визначення мтотичного режиму за прийнятою методикою. Пщрахунок мiтозiв проводили пiд iмерсiй-ним збiльшенням мiкроскопу в 10о полях зору. Визна-чали мтотичний iндекс (М1) - ктьгасть мiтозiв на 1000 клiтин, визначених у промтях(°%о), кiлькiсть мiтозiв яга знаходяться в метафазi в процентах(%), кiлькiсть па-тологiчних мiтозiв в процентах(%) [2].
Результати iмуногiстохiмiчних реакцм оцiнювали шляхом пiдрахунку вiдсотка позитивних штин iз рiз-ною Ытенсивнютю, яку оцiнювали вiзуально. Аналiзу-вали 800-1000 епiтелiальних клiтин в кожному випад-ку. Пролiферативний потенцiал (шдекс пролiферацiТ) визначали при пiдрахунку галькост клiтин, що експре-сують Ki-67. При 1М (iндекс мiтки) Ki-67<10,0% - низь-ка, 1М Ki-67>30,0% - висока пролiферативна активнiсть.
Достс^рнють рiзницi середнiх порiвнюваних показникiв оцЫювали за критерiями (t) Ст'юдента. Рiзниця мiж порiвнюваними величинами вважалась значимою, як що допустима помилка (p) була менша за 0,05.
Кiлькiсна оцiнка кореляцшного зв'язку оцiнювалась за значеннями коефiцiентiв кореляцiТ у межах вiд -1 до +1. Вщ'емш значення коефiцiентiв указують на зворотний зв'язок, додатн - на прямий. Нульове значення може свщчити про вщсутнють зв'язку. Iнтенсивнiсть зв'язку (слабкий зв'язок - помiрний -суттевий - сильний) оцЫювали за абсолютним зна-ченням коефiцiентiв кореляцiТ.
Результати та ix обговорення
У пацiентiв, хворих на виразково-iнфiльтративний рак шлунка, що розвинувся на фон виражених форм хрошчного атрофiчного i атрофiчно-гiперпластичного гастриту в слизовм оболонцi шлунка навколо пухли-ни, пiлоричного вiддiлу i малоТ кривизни достовiрноТ рiзницi показника м^отичного iндексу (М1) не знайде-но (рис. 1).
Показник мтотичного iндексу в тiлi (Т) шлун-ка(15,5+4,2°%о) був достовiрно нижче (р<0,05) нiж на дiлянцi навколо пухлини(НП)(33,1+11,8°%о), пторично-му(П) вiддiлi (27,5+5,8%) i на малш кривиз-ш(МК)(25,5+3,90%о) (рис. 1).
Мiж показниками кiлькостi мiтозiв метафази в rn-лоричному вщдл (51,5+3,3%), на малiй кривиз-
ы(51,9+2,2%) та навколо пухлини(56,9+5,8%) достовь рноТ рiзницi не знайдено (р>0,05).
56,9 "151,5 S1.9
33,1
л 27,5 1—:25,!
15,5
□ НП ПП ПМК ОТ
Рис. 1. Мтотичний режим ептелю слизовоТ оболонки шлунка хворих на виразковочнфльтративний рак шлунка.
1кв - мтотичний ¡ндекс(%о). 2кв - юльюсть мiтозiв у метафазi(%). 3кв - юльюсть патологiчних мiтозiв(%).
В то шлунка гальгасть мiтозiв в метафа-з^44,9+2,8%) була достовiрно нижчою(р<0,01) нiж на дтянц навколо пухлини(56,9+5,8%) та в Ыших репо-нах слизовоТ оболонки шлунка.
Дослщжеш патологiчнi мiтози (рис.1), вщзначались достовiрним зниженням (р<0,001) в то шлунка (5,4+1,1%) вiдносно дтянки навколо пухлини (37,2+3,5%), пiлоричного вщдту (35,1+2,7%) та малоТ кривизни (25,3+3,3%), а також вiдмiчена достовiрна рiзниця мiж пiлоричним вiддiлом (35,1+2,7%) i малою кривизною(25,3+3,3%) (р<0,05).
За допомогою маркеру Ю-67(клон М1В-1) виявлена висока пролiферативна активнють епiтелiю слизовоТ оболонки шлунка з Ыдексом мiтки >30,0% (рис.2).
Ж « f , '
* V*; • " f- -
*vf i ';
Ш А . т i 'J^ i к | • *1 ж
Л» » VTAíJÍ..v - ?
ú. i . V/ I. 1 jS' А 'Л »S <1
4* / i * A h *
i r ) с f 'i \ W
• •• * /»5 »V X I 1 - I t I'1
' 4
_ _ •
l« »v' . i 7 JF
Рис.2. Висока пролiферативна активнють в еттелп ямок Í3 дисплазieю на фонi хронiчного гастриту. Маркер Ki-67(клон М1В-1).
Спостер^аеться залежнють мiж показниками галь-костi патологiчних мiтозiв, мiтозiв на стадiТ метафази, мтотичного iндексу з вираженням пролiферативноТ активнос^ епiтелiю слизовоТ оболонки в рiзних топо-графо-анатомiчних вiддiлах шлунка.
В то шлунка де, в порiвняннi з iншими регiонами, показники м^отичного режиму нижчi, достовiрно рiд-ше виявляеться виражена пролiферативна активнiсть еттелп з дисплазiею слизовоТ оболонки шлунка (р<0,001).
Зростання кiлькостi патологiчних мiтозiв, мiтотич-ного iндексу, та мiтозiв на стадiТ метафази в пторич-ному вiддiлi, на малiй кривизш i навколо пухлини ко-релюе iз збiльшенням пролiферативноТ активностi
Том. i8, N 1-2 2014 р.
1 кв
2 кв
3 кв
еп1тел1ю слизовоТ оболонки шлунка з шдексом м1тки >30,0%.
II 1 I 2 I з ННЬ^: ! . м
. г- . :
Рис. 3. Електрофореграми продуктiв амплiфiкату зразюв
ДНК слизово)' оболонки шлунка хворих на виразково-
нфльтративний рак шлунка: 1,2,3 - ДНК-профiлi вiдповiдають маркеру пухлини; М -маркер розмiру фрагментiв ДНК.
Генотипування еп1тел1ю слизовоТ оболонки шлунка пац1ент1в хворих на виразковочнфтьтративний рак шлунка виявило досить стабтьы ДНК-профл представлен! експанс1ею фрагмент1в розм1ром 520 та 620 п.н.(пар нуклеотид1в) в ус1х спостереженнях (рис. 3) I мали повну вщм1ннють вщ проф1лю маркеру норми.
1з зб1льшенням показник1в м1тотичного режиму збь льшуеться прол1феративна активн1сть покривно-ямкового еттел1ю I еп1тел1ю залоз. В т1л1 шлунка, де показники м1тотичного режиму найменш1 в пор1внянн1 з шшими рег1онами шлунка, достов1рно рщше (р<0,001) виявляеться прол1феративна активн1сть епь тел1ю I зазначена 1ндексом м1тки <10,0%.
Зважаючи на те, що у вс1х спостереженнях, за результатами генотипування, були одержан! ДНК-проф1л1 де була явна експанс1я фрагмент1в розм1ром в1д 520 до 620 п.н. 1х можна вважати за маркер наяв-ност1 в патента пухлини.
М1ж показниками м1тотичного режиму слизовоТ оболонки шлунка, вираженням прол1феративноТ акти-вност1 дисплаз1Т еттелю слизовоТ оболонки шлунка за маркером К1-67 хворих на виразково-1нф1льтративний рак шлунка та показниками генотипування еп1тел1ю слизовоТ оболонки коефЩ1ент кореляц1Т П1рсона rxy склав в1дпов1дно 0,197, 0,607 та 0,881, що свщчить
про юнування вщповщно слабкого, значного та сильного за тюнотою зв'язку. КоефЩ1ент детерм1нац1Т D=rxyЛ2 дор1внював вщповщно 0,039, 0,369 та 0,776. Критичне значення коефщ1ента кореляцп з в1рогщню-тю 0,95 дор1внюе 0,2732. Критичне значення коефщ1е-нта кореляц1Т з в1рогщнютю 0,99 дор1внюе 0,3511. По-р1вняння коеф1ц1ента кореляц1Т rxy з критичним зна-ченням rcr для значущост1 0,95 в1дпов1дало в1дпов1дно Ъу<Гст та rxy>rcr. Пор1вняння коеф1ц1ента кореляцп ^ з критичним значенням для значущост1 0,99 вщповь дало вщповщно Ъу<гст та rxy>rcг. КоефЩ1ент ковар1ац1Т склав в1дпов1дно 0,389, 3,442 та 0,859. М1ж показниками м1тотичного режиму, прол1феративноТ активност1 дисплазп еп1тел1ю та показниками генотипування слизовоТ оболоки шлунка виявлена статистично достовь рна залежнють з ймов1рнютю 0,99.
Висновки
За допомогою пстолопчного методу встановлено, що при виразковочнфтьтративному раку шлунка ви-явлен1 висок показники м1тотичного режиму еп1тел1ю слизовоТ оболонки.
Тенденц1я зростання показник1в м1тотичного режиму у вщдтах шлунка в1дбуваеться в напрямку Т^МК^П^НП.
При виразково-1нф1льтративному раку шлунка ге-нотипуваання слизовоТ оболонки шлунка виявило стабтьш ДНК-проф1л1 представлен! експансюю ампль кон!в розм!ром 520 та 620 п.н.(пар нуклеотид!в) в ус1х спостереженнях. Це св!дчить про Тх генетичну одно-типн!сть, злоякюнють ! можлив!сть використовувати як маркер мал1гн1зацп.
Застосування методу ISSR-PCR дае можливють ранньоТ д!агностики раку шлунка з матер!алу слизовоТ оболонки.
Показники ¡мунопстох!ммного методу корелюють 1з гютолопчним методом I показниками генотипування за реакц1ею ISSR-PCR. Коеф1ц1ент кореляц1Т П1рсона rxy м1ж показниками м1тотичного режим, прол1ферати-вноТ активност1 еп1тел1ю слизовоТ оболонки шлунка за маркером К1-67 I показниками генотипування еттелю слизовоТ оболонки шлунка дор1внюе в1дпов1дно 0,197,
0.607.та 0,881, що вказуе на юнування вщповщно по-м1рного та значного за тюнотою зв'язку м1ж показниками з ймов1рнютю 0,99.
Морфолопчна д1агностика раку шлунка повинна базуватись на комплексна оц1нц1 ознак, в1др1зняючих його дисплаз1Т еттелю та 1нших зм1н що симулюють пухлину, сп1вставляючи результати патог1столог1чних, 1муногютох1м1чних досл1джень I генотипування.
Перспективи подальших дослiджень
В подальшому комплексн1 досл1дження плануеться провести на практиц1 з метою д1агностики неопласти-чних змш еп1тел1ю слизовоТ оболонки шлунка у хворих з хроычними захворюванями шлунка.
Л^ература
1. Аруин Л.И. Международная классификация хронического гастрита: что следует принять и что вызывает сомнения / Л.И.Аруин, А.В.Кононов, С.И.Мозговой // Арх. пат. - 2009. - Вып.4. - С. 11 - 18.
2. Казанцева И.А. Патология митоза в опухолях человека / И.А. Казанцева - Новосибирск.: Наука, 1981. - 144 с.
3. Кононов А.В. Морфогенез атрофии слизистой оболочки желудка как основа фенотипа хронического гастрита / А.В.Кононов, С.И.Мозговой, М.В. Маркелова, А.Г.Шиманская // Арх. пат. - 2011. - Вып.3. - С. 26 -31.
4. Марковський В.Д. Комплексна патоморфолопчна ди-ференцмна дiагностика передпухлинних процесiв i раку шлунка / В.Д.Марковський, О.В. Харченко// Патоло-гiя. - 2012. №3. - С.15 - 18.
5. Рак в УкраМ, 2009 - 2010. Захворюванють, смертнють, показники дiяльностi онкологiчноï служби // Бюл. нац. канцерреестру Украïни. - 2011. - Т.12., № 1. - С. 22, 37
- 38.
6. Садчиков В.Д. Хроническая язва и рак желудка / В.Д.Садчиков, А.С.Дудниченко, М.В.Садчикова // Проблеми медично!' науки та освiти. - 2000. - №3. - С. 17 -20.
7. Харченко О.В. Перспективи методу ISSR-PCR та мор-фолопчних методiв при вивченн функцюнального он-когеному та фенотипу злоягасних пухлин / О.В.Харченко, В.М.Балацкий, О.В.Москаленко// Вюник морфологiï (Reports of Morphology). - 2007. - Т.13, №1.
- С. 204 - 206.
8. Харченко О.В. ISSR-PCR в дослщжены злоягасно!' пе-ребудови ДНК слизово!' оболонки шлунка / О.В.Харченко // Сучасн проблеми патолопчно!' анато-мiï: Матерiали VIII мiжнародного конгресу патолопв
УкраТни, 21 - 23 травня 2008 р. - Полтава, 2008. -С.19.
9. Харченко О.В. Динамка проявiв фенотипу дисплазм еттел^ слизовоТ оболонки шлунка у вщповщност з Тх генотипом на матерiалi вивчення свiтловоТ мiкроскопiТ та ДНК-типування за методом ISSR-PCR / О.В.Харченко // Вюник морфологи (Reports of Morphology). - 2009. -Т. 15, №2. - С. 396 - 402.
10. Янкин А.В. Скрининг рака желудка / А.В.Янкин // Практ. Онкология. - 2010. - №11(2). - С.96 - 101.
11. Farinati F. Early and advanced gastric cancer during Follow-up of apparently benign gastric ulcer: Significance of the presence of epithelial dysplasia / F. Farinati, F. Cardin, F. Di Mario //J.Surg.Oncol. - 1987. - Vol.36, №4. - P. 263 - 267.
12. Nagayo T. Histogenesis and precursors of human gastric cancer. Research and practice./ NagayoT. - Berlin: Springer-Verlag. - 1988. - 190p.
13. Пат.76768 UA, МПК А61В 10/00. Споаб дiагностики Ы-фтьтративно-виразкового раку шлунка: Пат.76768 UA, МПК А61В 10/00 / О.В.Харченко (UA); В.Д.Марковський (UA); В.М.Балацький(иА). №u201209011; За-явл.23.07.2012; Опубл. 10.01.2013; Бюл.№1. -3 с.
ENGLISH VERSION: COMPLEX DIAGNOSTICS OF ULCEROINFILTRATIVE GASTRIC CANCER*
Kharchenko O. V.
Poltava National Pedagogical University named after V.G.Korolenko, Poltava
Complex diagnostics, made by the histological method, specifying the mitotic regimen, immunohistochemical Ki-67 marker (MIB-1clone) and ISSR-PCR marker of genetic typing showed lesions in gastric mucosa epithelium, specific to gastric mucosa epithelium neoplasia in patients with ulceroinfiltrative gastric cancer. Expansion of ISSR-PCR marker of genetic typing indicates its high sensitivity and informativeness. There is a strong correlation between the indices of histological, immunohistochemical and indices of genetic typing, detected by the ISSR-PCR method. Between the indices of mitotic regimen, proliferative activity of gastric mucosa epithelium of Ki-67 marker and indices of genetic typing of gastric mucosa epithelium, the Pearson's correlation coefficient, rxy, constitutes 0,197, 0,607 and 0,881, respectively, corresponding to the existence of moderate and considerable relationship between indices. The overall result shows statistically significant dependence with probability of 0,99.
Key words: mitotic regimen, Ki-67 marker, genetic typing.
Introduction
The main cause of death in developed countries, along with mortality from cardiovascular processes and their complications, is mortality from malignant tumors. Every year gastric cancer affects 750 - 870 thousand people in the world; it accounts for 10% from fatal outcomes, caused by neoplastic pathology. In 2009 gastric cancer in Ukraine took the 3rd (9.0%) place in the structure of male oncopathology and the 6t (5.6%) place in the female one; in the structure of oncomortality it takes the 2nd (11.8 and 9.3%) place in both groups [5, 10].
Lesions in mucosa, surrounding gastric ulcer, e.g., chronic gastritis, which are followed by dysregenerative processes with the development of epithelial dysplasia [1, 3, 6] are strongly believed to be predictors of gastric cancer development. The latter, especially the severe ones, are often identified as the marker of cancer, growing nearby [11].
Ulceroinfiltrative gastric cancers are complicated for diagnostics. At early stages this form of cancer may stimulate typical ulcer, making it difficult to make differentiated diagnostic with the latter [4, 6]. Ulcerated gastric cancer, as well as typical ulcer, may be healed. But, again, the process of healing is replaced by ulceration
and such cycles may occur repeatedly. Due to the fact that gastric ulcer develops comparatively slowly, such cycles may occur repeatedly [6, 12].
The purpose of the research is complex diagnostics of pretumor changes in gastric mucosa and diagnosis of gastric cancer by histological, immunohistochemical and molecular- biological methods.
Materials and Methods
The paper considers findings of 50 examinations of ulceroinfiltrative gastric cancer. Surgically extracted stomachs have been examined with the purpose to detect morphological features of gastric mucosa condition.
The obtained samples of gastric mucosa have been studied by conventional histological method according to standard regimen, including fixation of tissue in neutral formalin. The material was processed in paraffin coating. Sections were colored in hematoxylin-eosin and picro-rosein according to Van-Gison.
Immunohistochemical detection of proliferation of gastric mucosa epithelium has been performed by Ki-67 marker on deparaffined sections of 4-5 mm thick with prior antigen damasking in citrate buffer (pH 6,0) in microwave oven during 10 min. Monoclonal antibodies have been applied to Ki-67 (MIB-1clone) as primary ones. In-
* To cite this English version: Kharchenko O. V. Complex diagnostics of ulceroinfiltrative gastric cancer / / Problemy ekologii ta medytsyny. - 2014. - Vol 18, № 1-2. - P. 59 -62.
Том. i8, N 1-2 2014 р.
