CC BY
63
ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИОННЫХ РАБОТ
ГШ ИСАЕВА УДК 616-022.7.31-07/ 616.З66-002
Казанский государственный медицинский университет
Комплексная диагностика Helicobacter pylori инфекции у больных хроническим холециститом
I Исаева Гузель Шавхатовна
кандидат медицинских наук, доцент кафедры микробиологии
420140, г. Казань, ул. Айтматова, д. 6, кв. 9, тел. 8-917-936-66-46, e-mail: [email protected]
Проведено изучение эффективности различных методов обнаружения H.pylori в желчи у 50 больных хроническим холециститом. H.pylori обнаружены в 50-52% случаев цитологическим методом, ПЦР для детекции ureC гена H.pylori, проведенная с помощью коммерческого набора, была позитивной в 50% случаев (n=38). Ген 16S рДНКрода Helicobacter был обнаружен в 50% образцов желчи, при этом ДНК H.pylori выявлена в 25% образцов, столько же образцов были положительными в отношении H.rappini. Все образцы в отношении генов cdtB H.pullorum и cdtB H.bilis были негативными. Для диагностики H.pylori у больных хроническим холециститом можно рекомендовать комплексный метод, включающий морфологические и молекулярно-генетические исследования.
Ключевые слова: Helicobacter pylori, диагностика, холецистит.
G.S. ISAYEVA
Kazan State Medical University
Complex diagnostics of Helicobacter pylori infection in patients with chronic cholecystitis
The study of the effectiveness of different methods for detection of H.pylori in the bile in 50 patients with chronic cholecystitis was conducted. H.pylori were found in 50-52% of the cytological method, PCR for the detection of ureC gene H.pylori, carried out using a commercial kit was positive in 50% of cases (n = 38). Gene 16S rDNA Helicobacter genus was detected in 50% of the samples of bile, H.pylori DNA was found in 25% of the samples, the same samples were positive for H.rappini. All samples for gene cdtB H.pullorum and cdtB H.bilis were negative. For the diagnosis of H.pylori in patients with chronic cholecystitis can be recommended a comprehensive approach that includes morphological and molecular genetic studies.
Keywords: Helicobacter pylori, diagnosis, cholecystitis.
Helicobacter pylori как наиболее изученный и известный представитель рода Helicobacter признан возбудителем воспалительных гастродуоденальных заболеваний (гастрита, гастродуоденита, язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки). Установление связи между инфицированностью Н.руЬп и раком желудка дало основание Международному агентству по изучению рака отнести его к канцерогенам I группы. Но в научных докладах последних лет все активнее обсуждается вопрос об участии этих бактерий в воспалительных заболеваниях гепатобилиарной системы [8, 18].
Хронический холецистит — одно из наиболее распространенных заболеваний в различных популяциях индустриально развитых стран [7]. Существует несколько теорий возникно-
вения воспалительных заболеваний билиарной системы. Согласно одной из них, основная роль принадлежит инфекции. У здоровых людей микроорганизмы в желчном пузыре обычно отсутствуют. В желчи больных с патологией билиарной системы обнаруживаются патогенные (сальмонеллы, лептоспиры и др.) и условно-патогенные (кишечная палочка, клебсиеллы, протей, энтеробактер, стафилококки, энтерококки и др.) бактерии, вирусы гепатита А, грибы рода Кандида, возбудители протозойных и глистных инвазий. В печати последних лет появились сообщения об обнаружении бактерий рода Helicobacter у больных хроническим холециститом в органах гепатобилиарной системы [3, 4, 10, 11, 15]. Расшифровка патогенетических механизмов с участием этих микроорганизмов открывает перспективу
применения противохеликобактерной терапии для лечения и профилактики заболеваний желчного пузыря и печени, а также предотвращения персистенции хеликобактеров в желчных путях и повторной колонизации слизистой оболочки желудка при забросе желчи при желчном рефлюкс-гастрите.
Отсутствие «золотого» стандарта микробиологического подтверждения об обнаружении хеликобактеров в тканях печени, желчного пузыря и желчи может оказывать сдерживающий эффект в исследованиях по изучению этиологической значимости этих бактерий в патогенезе заболеваний гепатобилиарной системы. Кроме того, существует проблема дифференцировки H.pylori от других бактерий рода Helicobacter, особенно энте-рогепатических видов, колонизирующих желчный пузырь животных и человека, в частности Helicobacter bilis, Helicobacter hepaticus, Helicobacter pullorum, Helicobacter muridarum, Helicobacter rappini и других. Поэтому назрела необходимость в разработке алгоритма комплексного метода диагностики H.pylori инфекции у больных хроническим холециститом.
Цель исследования — оценка эффективности различных методов обнаружения H.pylori в органах гепатобилиарной системы больных хроническим холециститом.
Материал и методы исследования
Обследовано 50 больных хроническим некалькулезным холециститом, обратившихся в лечебные учреждения г. Казани (мужчин — 12, женщин — 3S). Средний возраст пациентов составил 42,5 года. Всем больным было проведено дуоденальное зондирование с отбором порций желчи, отражающих содержимое желчного пузыря и желчных протоков (В и С). После отбора материала пробирки сразу же отправляли в лабораторию. Пробы желчи были использованы для цитологического и молекулярно-генетического исследований. Из образцов желчи готовили мазки, фиксировали в 96%-ном этиловом спирте и окрашивали катионовым синим О (основным) [2]. Бактерии
Таблица 1.
Праймеры и условия ПЦР для различных ДНК-мишеней
Название Ген Условия ПЦР* Размер ампликона (п.о.) Источники
F2-16S-CHPEC R4-16S-CHPEC Универсальная 16S rRNA (940C; 30 сек, 600C; 30 сек, 720C; S0 сек)х40 1456 Rocha М. и соавт. (2005) [20]
С97 С98 Род HeIicobacter 16S rRNA (940C; 30 сек, 540C; 90 сек 720C; 60 сек)х35 39S Fox J.G. и соавт. (1998) [9]
HPY S HPY A HeIicobacter pyIori 23S rRNA (940C; 1 мин,550C;1 мин, 720C; 1 мин)х40 267 A. Menard и соавт. (2002) [12]
F1-cdtB-puIIorum F2-cdtB-puIIorum R2-cdtB-puIIorum HeIicobacter puIIorum cdtB 940C; 30 сек, 600C; 1 мин, 720C; 20 сек)х40 140 14S Rocha М. и соавт. (2005) [20]
F2-cdtB-biIis R2-cdtB-biIis HeIicobacter biIis cdtB (940C; 30 сек, 600C; 1 мин, 720C; 30 сек)х40 151 Rocha М. и соавт. (2005) [20]
F1-ureB-rappini R2-ureB-rappini HeIicobacter rappini ureB (940C; 30 сек, 600C; 30 сек, 720C; 10 сек)х40 101 Rocha М. и соавт. (2005) [20]
* После 4 минут первоначальной денатурации при 94°C каждая реакционная смесь была амплифицирована при указанных условиях. После окончания последнего цикла производили финальный синтез в течение 7 минут при 72°С. Реакцию ПЦР проводили в общем объеме 25 мкл в смеси, содержащей 1*реакционный буфер, 0,2 мМ смеси диоксинуклеозид трифосфатов, 2,5 мМ MgCl2, 0,5 ед. Taq полимеразы, по 0,5 мкМ каждого праймера и 10 нг ДНК в амплификаторе MJ Mini (BioRad). Выявление амплифицированных фрагментов осуществляли путем их электрофоретического разделения в 2%-ном агарозном геле с добавлением 1%-ного раствора бромистого этидия и визуализации в виде светящихся полос под действием ультрафиолетового свечения. Результаты документировали с помощью видеосистемы для регистрации гелей Gel Imager 2 (Helicon).
H.pylori обнаруживали по типичной морфологии — с-образно изогнутые палочки спиралевидной формы. Степень обсеменен-ности в мазках определяли по параметрам, установленным Сиднейской системой.
Рисунок 1.
Детекция ДНК Helicobacter pylori в клинических образцах с помощью ПЦР. 1-3 — исследуемые образцы; К— — отрицательный контроль; К+ — положительный контроль; М — маркер
М 12 3 К- К.+
Выделение ДНК из биопроб (100 мкл желчи) проводили сорбционным способом с использованием набора «Хеликопол» (НПФ «Литех», г. Москва) в соответствии с рекомендациями производителя. Амплификацию специфических фрагментов генома H.pylori проводили по методике, предложенной НПФ «Литех» (г. Москва). Определяемыми фрагментами ДНК яв-
лялись гомологичные участки гена ureC H.pylori. Кроме того, проводился анализ положительного и отрицательного (деионизированная вода) контрольных образцов для оценки чистоты эксперимента и исключения возможности контаминации. В готовую реакционную смесь вносили по 5 мкл анализируемого образца, тщательно перемешивали и проводили амплификацию по следующей программе: 94°С — 60 сек., 94°С — 30 сек., 60°С— 30 сек., 72°С — 30 сек. в течение 5 циклов; 92°С — 5 сек., 50°С — 10 сек., 72°С — 15 сек. в течение 40 циклов. Выявление амплифицированных фрагментов осуществляли путем их электрофоретического разделения в 2% геле с добавлением 1% раствора бромистого этидия и визуализации в виде светящихся полос, соответствующих 492 п.н.о., под действием ультрафиолетового свечения. Результаты документировали с помощью видеосистемы для регистрации гелей DNA Analyzer (НПФ «ЛИТЕХ», Россия) (рис. 1).
Для детекции ДНК бактерий рода Helicobacter использовали молекулярно-генетический метод, состоящий из несколько этапов. Первый этап включал проведение универсальной ПЦР F2/R4 для амплификации фрагмента 16S рРНК. Следующим этапом было проведение родоспецифической ПЦР C97/C98 с позитивными в реакции F2/R4 образцами ДНК для выявления фрагмента 16S рРНК бактерий рода Helicobacter. Затем образцы ДНК, имеющие положительный результат в специфической ПЦР для рода Helicobacter, подвергали видоспецифической ПЦР с целью детекции четырех видов хеликобактеров H.bilis, H.pullorum, H.pylori и H. (Flexispira) rappini. Праймеры, условия ПЦР и размеры ампликонов представлены в таблице 1.
Результаты и их обсуждение
Цитологическое исследование выявило с-образно-изогнутые палочки в 50% образцов пузырной желчи (порция В) и 52,3% образцов протоковой желчи (порция С). При этом в обеих порциях преобладала умеренная обсемененность. Специфической окраски для обнаружения H.pylori не существует, хотя некоторые из методик являются более предпочтительными. Наименее подходящей является окраска гематоксилин-эозином из-за слабого контраста между слизью и бактерией, но из-за простоты и дешевизны этот метод нашел широкое применение. Наилучшая визуализация бактерий может быть достигнута при окраске по Вартину-Старри, но эта техника трудна в исполнении, требует приготовления реактивов ex tempore, что ограничивает ее широкое использование. Окраска по Гимзе дает также хороший контраст и лишена минусов окраски по Вартину-Старри, что делает ее популярной в лабораторной практике. В качестве альтернативного метода окраски предложены импрегнация серебром — НРвв (H.pylori silver stain), окраска метиленовым синим, смесью карболового фуксина с альциановым голубым. Несмотря но то, что все бактерии рода Helicobacter относятся к извитым, морфологически они отличаются друг от друга размерами, количеством завитков, жгутиков, их расположением, наличием или отсутствием пе-риплазматических волокон. Морфологически H.pylori отличим от энтерогепатических хеликобактеров, и его диагностика не вызывает затруднений у опытного цитолога, но в сомнительных случаях, особенно при наличии кокковидных форм, можно прибегнуть к иммуноцитохимической окраске с использованием специфических антител против поверхностных протеинов H.pylori.
ПЦР — детекция ureC гена H.pylori с использованием коммерческого набора показала, что ДНК этой бактерии была выявлена из образцов протоковой порции желчи у 19 больных из 38 случаев (50%). При сравнительном изучении различных порций желчи было установлено, что во всех случаях ДНК H.pylori была выделена только из порции С, тогда как все образ-
цы порции В, отражающей содержимое желчного пузыря, были H.pylori — негативными. На результаты также не оказывало влияние разведения желчи. Разведения желчи 1:10 были сделаны для удаления возможных ингибиторов реакции, но результаты реакции не зависели от разведения: они были одинаковыми как в образцах цельной, так и в разведенной желчи.
При ПЦР-исследовании образцов желчи, отобранных от 12 пациентов, универсальная F2/R4 реакция была положительной в 7 случаях. Последующая реакция С97/С98 выявила ДНК бактерий рода Helicobacter в желчи 6 пациентов (50%), из них в одном образце порции В и 5 образцах порции С. Положительные в отношении бактерий рода Helicobacter образцы ДНК были последовательно протестированы с помощью видоспецифических праймеров H.bilis, H.pullorum, H.pylori и H.rappini. В 3 случаях образцы были позитивными в отношении гена 23S рРНК H.pylori и столько же в отношении гена ureB H.rappini. Все образцы в отношении генов cdtB H.pullorum и cdtB H.bilis были негативными.
Таблица 2.
Сравнение различных методов для диагностики H.pylori-инфекции у больных с заболеваниями билиарной системы
Метод диагностики Цитологический Бактериологический Молекулярно- генетический
Чувствительность +++ + +++
Специфичность ++ +++ +++
Количественная оценка +++ +++ +
Быстрота +++ + ++
Доступность +++ + +
Необходимость дополнительных исследований +/— (дополнительно иммуноцитохимический) + (дополнительно ПЦР и/или секвенирование) -
Примечание:
+++ — высокая оценка; ++ — средняя оценка; + — низкая оценка
Анализ опубликованных работ по молекулярной детекции ДНК бактерий рода Helicobacter в желчном пузыре у больных хроническим холециститом указывает на противоречивость полученных результатов. Chen W. (2003) с соавт. в образцах желчи, полученной при холецистоэктомии, ДНК хеликобактеров выявили в 50% случаев, при этом в 56 из 61 положительных проб ДНК соответствовала H.pylori [5]. По данным исследований, проведенном в Бразилии в 2002 году, ДНК хеликобактеров
была обнаружена в 31,3% тканей желчного пузыря и 49,9% пузырной желчи [22], а по данным более позднего исследования у бразильских больных хроническим холециститом ДНК бактерий рода Helicobacter была выявлена в 61,8% случаев в образцах пузырной желчи [15]. В исследовании ДНК H.pylori была выделена из желчи у 51,5% больных калькулезным холециститом (Италия), при этом была отмечена корреляция между присутствием H.pylori в желчи, колонизацией в слизистой оболочке желудка и присутствием антигена в фекалиях [17]. В исследовании тканей желчного пузыря, полученных от 68 пациентов при холецистоэктомии (Турия), ДНК H.pylori была обнаружена в 15 образцах (22%), но бактериологически эти бактерии не выделены [24]. В то же время в более ранних исследованиях, проведенных в Германии [21] и Мексике [13], сообщается о неудачных попытках обнаружения хеликобактерной ДНК в желчи и слизистой оболочке желчного пузыря при заболеваниях билиарного тракта. В южно-корейском исследовании с участием 43 пациентов ни в одном случае с помощью ПЦР не удалось выявить ДНК H.pylori ни в желчи, ни в тканях желчного пузыря [16]. Невысокий процент положительных проб был получен другими южно-корейскими исследователями: ДНК H. pylori была обнаружена в 6 из 48 образцов желчи [11]. В исследовании Кагадт P. (2010) только у 7 из 100 больных хроническим и острым холециститом была обнаружена ДНК Helicobacter, при этом в шести случаях секвенирование доказало принадлежность ДНК H.pullorum и только в одном случае — H.pylori [10]. Такой разброс результатов молекулярно-генетических исследований можно объяснить применением различных методик по экстракции ДНК из образцов, обладающих различной эффективностью, и отсутствием единых методологических подходов на всех этапах молекулярно-генетического анализа. В нашем исследовании при использовании одинаковой методики выделения ДНК из образцов мы получили результаты, указывающие на присутствие генов хеликобактеров в 50% случаев при применении различных методик детекции. Но при этом ПЦР, проведенная с помощью коммерческого набора, была позитивной в отношении H.pylori в 50% случаев, а по результатам многоступенчатой ПЦР детекции H.pylori и энте-рогепатических хеликобактеров только половина выделенной ДНК принадлежала H.pylori, что составило 25%, в остальных случаях — энтерогепатическим хеликобактерам, в частности H.rappini. Молекулярная биология является бесценным инструментом для идентификации микроорганизмов. Полимеразноцепная реакция и/или секвенирование может стать «золотым» стандартом детекции бактерий рода Helicobacter. Анализ опубликованных докладов и результатов, полученных в данном исследовании, указывает на необходимость стандартизации методов генетической детекции бактерий рода Helicobacter и разработки коммерческих наборов, доступных для практических лабораторий.
Сообщения об успешном выделении бактерий рода Helicobacter из органов гепатобилиарной системы единичны [1, 6, 14, 23]. Трудности бактериологического метода исследования могут быть обусловлены различными факторами. Возможно, что исследуемый материал содержит ингибиторы роста хеликобактеров (желчные кислоты, ферменты и т.д.), либо это связано с недостатками технического исполнения (длительная транспортировка, замораживание образцов и т.д.), а также с особенностями микроорганизмов (некоторые виды энтерогепатических хеликобактеров относятся к некультиви-руемым, и получение культуры возбудителя возможно только биологическим методом). Методика идентификации чистой культуры H.pylori, выделенной из органов гепатобилиарной системы, отличается от стандарта, принятого для штаммов, выделенных из слизистой оболочки желудка. Эта особенность
заключается в необходимости генетического подтверждения принадлежности полученного изолята к данному виду, так как в желчном пузыре могут обитать другие представители бактерий рода Helicobacter, обладающие сходной с H.pylori биохимической активностью. К таковым, в частности, относятся
Н.bilis, H.hepaticus, H.trogontum, H.muridarum, хотя остальные представители энтерогепатических хеликобактеров являются уреазоотрицательными. Так, в исследовании Pradhan S.B. (2009) в 76,7% образцов слизистой оболочки желчного пузыря была получена культура грамотрицательных оксидаза-, ката-лаза-, уреаза-положительных бактерий. Гистологическое исследование показало их принадлежность к H.hepaticus [19]. Стандартная биохимическая идентификация H.pylori по трем ферментам (тест на каталазу, оксидазу и уреазу) недостаточна для подтверждения видовой принадлежности штаммов, выделенных из биологического материала внежелудочной локализации. Разработка коммерческих мультимикротестов, включающий более широкий набор определяемых ферментов, может значительно облегчить биохимическую идентификацию бактерий этого рода.
Для определения эффективности различных методов диагностики H.pylori- инфекции у больных с заболеваниями гепатобилиарной системы, по результатам собственных исследований и опубликованных работ, была проведена сравнительная оценка микроскопического, бактериологического, молекулярногенетического методов по следующим критериям: специфичность, чувствительность, возможность количественной оценки обсемененности H.pylori, быстрота получения результатов, доступность и необходимость проведения дополнительных исследований (таблица 2).
Таким образом, ни один из существующих методов диагностики H.pylori у больных гепатобилиарными заболеваниями не является универсальным. Пределы возможностей ограничены не только их чувствительностью и специфичностью, но и зависят от множества факторов: особенностей микроорганизма, его количественного содержания, неравномерности распределения бактерий в слизистой оболочке и тканях и других факторов. Для диагностики H.pylori у больных с заболеваниями гепатоби-лиарной системы можно рекомендовать комплексный метод, включающий морфологический и молекулярно-генетический методы исследования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Исаева Г.Ш., Абузарова Э.Р, Валеева Ю.В. и др. Helicobacter pylori у больных с заболеваниями гепатобилиарной системы // Журнал микробиологии эпидемиологии иммунобиологии. — 2009. — № 2. — С. 96-101.
2. Исаева ГШ., Ефимова Н.Г., Хайрутдинова Г.Н. Окраска ка-тионовым синим О для цитологического выявления Helicobacter pylori // Клиническая лабораторная диагностика. — 2009. — № 5. — С. 19-20, 37.
3. СЬюп D.F., Hu L., Yi P., Fang D.C. et al. H.pylori exist in the gallbladder mucosa of patients with chronic cholecystitis. // W. J. Gastroenterol. — 2007. — Vol. 13, № 10. — P. 1608-1611.
4. СЬюп D.F., Hu L., Yi P., Liu W.W., Fang D-Ch., Cao H. H.pylori are associated with chronic cholecystitis // W. J. Gastroenterol. — 2007. — Vol. 13, № 7. — P. 1119-1122.
5. Chen W., Li D., Cannan R.J., Stubbs R.S. Common presence of Helicobacter DNA in the gallbladder of patients with gallstone diseases and controls // Dig. Liver Dis. — 2003. — Vol. 35. — P. 237-243.
Полный список литературы на сайтах www.mfvt.ru,www.pmarchive.ru
