CC BY
37
УДК 616-002
Mикроскоnические исследования для выявления H. pylori из желчного пузыря и желчевыводящих путей у больных с желчекаменной болезнью с явлениями холангита
Кязимов И.Л., Тахмазова Ч.Т.
Научный центр хирургии им.М.А. Топчибашева Баку Азербайджан
Актуальность проблемы. К настоящему времени имеются единичные сообщения об обнаружении ДНК хеликобактеров в органах гепатобилиарной системы при различных патологиях.(1.2.5.7.11.14.15) Также имеются данные о выделении культур бактерий из желчевыводящих путей.(3.6.8.9.) Интерес к изучению роли Н. pylori в развитии гепатобилиарной патологии постоянно увеличивается, о чем свидетельствует тот факт, что в конце прошлого века было проведено три международных симпозиума, посвященных данной проблеме(3.4.10.12.13.
Целью исследования
явилось выявление из желчного пузыря и желчевыводящих путей H. pylori у больных с желчекаменной болезнью с явлениями холангита.
Материалы и методы исследования
В отделение хирургии печени, желчного пузыря и поджелудочной железы Научного центра хирургии им.М.А. Топчибашева с 2012-2014 обследованы 67 больных(26 мужчин, 41 женщин) ) в возрасте от 18 до 78 лет (средний возраст 47,7±1,8 лет), с желчекаменной болезнью с явлениями холангита. Больные были подразделены на две группы.
Основная группа была подразделена на 4 подгруппы.
1 - подгруппа больных с желчекаменной болезнью 15 человека (4 мужчин, 11 женщин, средний возраст 58,4±2,5 лет). материал для исследования - биоптаты слизистой оболочки желчного пузыря и пузырные порции желчи, полученные при холецистэктомии;
2 - подгруппа больных с острым осложненным хроническим калькулезным холециститом 9 человек (2 мужчин, 7 женщин, средний возраст 65,7±2,6 лет). исследованы 4 образцов желчи внутрипеченочных протоков, полученные после холецитэктомии и 5 образцов пузырной желчи, из внутрипеченочных протоков в асептических условиях;
3 - подгруппа больных с хроническим некалькулезным холециститом 21 человека (11 мужчина, 10 женщины, средний возраст 47±2,02 лет). материал для исследования - образцы желчи ( порции А.В.С) полученные при проведении дуоденального зондирования;
4 - подгруппа больных с хроническим гастродуоденитом, сочетающимся с некалькулезным холециститом 8 человек (2 мужчин, 6 женщин, средний возраст 39,5±3,7 лет). материалом для исследования служили биоптаты слизистой оболочки желудка, полученные при фиброэзофагогастродуоденоскопии и образцы желчи ( порции A, B, C) полученные при проведении
дуоденального зондирования;
- Контрольная группа, организованная из больных без патологии гепатобилиарной системы 14 пациентов(4 мужчин, 10 женщин, средний возраст 35,5±1,9 лет). материалом для исследования служили образцы желчи (порции A, B, полученные при проведении дуоденального зондирования. Отбор больных в группы производили на основании: анамнеза, указывающего на соответствующую патологию; данных физикального обследования; клинико-лабораторных и инструментальных исследований; критериями отбора служили: диагноз, подтвержденный клиническими и лабораторными исследованиями; добровольное согласие пациента на участие в проведении исследования.
Перед началом исследования биоптатов готовили мазки - отпечатки и окрашивали их по грамму либо разведенным фуксином, для этого на предметное стекло помещали исследуемый материал и стерильной петлей размазывали по стеклу с последующей окраской. Окраска водным фуксином включает нанесение красителя на мазок на 2-3 мин с последующей промывкой водой и иммерсионной микроскопией. окраска по грамму включает нанесение генцианового фиолетового через фильтровальную бумагу на 2 мин. После удаления бумаги наносили раствор люголя на 1 мин , затем обесцвечивали 96% этиловым спиртом, после промывания водой докрашивали водным фуксином в течение 2-3 мин. Краситель смывали, высушивали фильтровальной бумагой и микроскопировали в светооптической иммерсионной системе. При исследовании желчи готовили два мазка: нативный и окрашенный по грамму и микроскопировали в окрашенных мазках бактерии имели S-образную форму, по грамму окрашивались отрицательно.
В качестве материала для исследования служили биоптаты желчного пузыря, полученные после холецистэктомии и из внутрипеченочных протоков в асептических условиях, а также биоптаты из слизистой желудка, отобранные при проведении ФГДС биоптаты (3x3 мм) отбирали в количестве 2 шт. от каждого больного (один для первичной микроскопии и биохимического исследования, другой - для выделения и идентификации культур). Биоптаты помещали в 3-5 мл полужидкой тиогликолевой транспортной среды для сохранения аэробной и микроаэрофильной микрофлоры и доставлялись в лабораторию не позднее 2—3 часов. В лаборатории каждый биоптат взвешивали на торсионных весах в асептических условиях и полученные результаты использовали при расчетах уровней обсемененности. перед посевом их помещали в стерильные фарфоровые ступки и растирали в 1 мл физиологического раствора.
24
Вестник хирургии Казахстана №3, 2014
Полученный гомогенат засевали на плотные питательные среды в количестве одной капли (0,05мл). В качестве плотных питательных сред использовали 3 среды: кровяной агар с амфотерицином , и эритрит — кровяной агар с амфотерицином. Амфотерицин в (змкг/мл) вносили для подавления роста грибов. использовали кровь барана, т.к. кровь человека часто содержит антитела к H. pylori Посевы культивировали 5 суток в микроаэрофильных условиях при 37°С. Микроаэрофильные условия создавали, помещая чашки в эксикатор, на дно которого ставили зажженную парафиновую свечу, стаканчик с 10% серной кислотой и пакетик с бикарбонатом натрия, закрепленный на краю стаканчика. на 1 л объема эксикатора брали 10 мл раствора серной кислоты и 1 г nahcc. эксикатор герметизировали с помощью пластилина. после затухания свечи, эксикатор осторожно встряхивали, чтобы пакетик падал в стаканчик с серной кислотой, после чего бурно выделяется в морфологическую идентификацию H. pylori проводили по характерному виду колоний, по изучению морфологии бактерий в мазках из колоний, окрашенных по грамму и фуксином. для определения характерной «винтообразной подвижности» готовили препараты «раздавленная капля» и изучали с помощью фазово- контрастной микроскопии. Биохимическую идентификацию н. pylori проводили определением оксидазной, каталазной и уреазной активностей. наличие оксидазной активности определяли нанесением капли 1% водного раствора тетраметилпарафенилендиамина гидрохлорида на исследуемую колонию. при положительном результате через 20-30 сек. колонии окрашивались в темный цвет. В качестве контроля служили суточные агаровые культуры escherichia coli (негативный контроль) и pseudomonas aerugenosa (позитивный контроль).
Каталазную активность определяли на предметных стеклах, на которые наносили 2-3 капли взвеси бактерий и каплю н2с. при положительном результате через 3-5 сек образуются пузырьки газа, позитивным контролем служила суточная культура is. coli, негативным — streptococcus pyogenes, уреазную активность определяли с использованием clo- теста. для этого готовили реакционную смесь, содержащую 10 мг мочевины, 10 ед тетрациклина и 8 - 10 кристаллов фенолового красного в 1 мл. готовую смесь можно хранить месяц при +4 с и разводить непосредственно перед постановкой теста. при ph 6,8 индикатор имеет желтый цвет, при ph 8,4 -малиново — красный. учет результатов проводили через 1, 3, 6 час и окончательно через сутки. время изменения окраски учитывали для косвенного определения уровней обсемененности:
(+) - низкая обсемененность (малиновое окрашивание появляется через 24 часа);
(++) - умеренная обсемененность (малиновое окрашивание появляется через 3 часа);
(+++) - высокая обсемененность (малиновое окрашивание появляется в течение одного часа);
- отрицательный результат (изменение окраски среды не происходит).
Следует помнить, что определение присутствия н. pylori нельзя основывать только на положительных результатах clo-теста (при отсутствии других признаков), т.к. уреазной активностью обладают и другие микроорганизмы - протеи, стафилококки, кандиды и т.д.Затем подсчитывались количество колоний н. pylori с пересчетом на биоптат. при этом исходили из следующих
расчетов: кусочек биоптата весит 5 мг его растирали в присутствии 1 мл жидкости, то есть получали разведение 1:200, засевали на питательные среды по 1 капле (0,05 мл) суспензии.
Выделение helicobacter pylori из желчи полученные порции желчи отбирали в асептических условиях в сухие стерильные пробирки и быстро доставляли в лабораторию. посев проводили внесением 1 капли осадка желчи (0,05мл) на поверхность плотной среды, затем стерильной петлей рассевали по поверхности чашки во всех направлениях. в работе использовали те же среде, что и при посеве биоптатов. культивирование посевов проводили в микроаэрофильных условиях с последующей идентификацией культур способом. Степень микробной обсемененности выражали в кое/мл (для пересчета на 1 мл желчи) по формуле: а : 20, где а - количество выросших колоний, 20 - количество капель в 1 мл.Факт обнаружения н pylori определяли по совокупности положительных результатов бактериоскопического, бактериологического и биохимического исследований. как положительный результат рассматривали свойства культур (тип колоний, морфологию бактерий, характерную подвижность, биохимические признаки) и наличие уреазной активности в clo-тесте. Наибольшие уровни обсемененности Н. pylori были обнаружены в посевах образцов порций А и В, посеянных на ЭКАА. В тоже время обсемененность протоковой желчи была ниже, чем в порция А на ЭКАА и КАА, что достигало границ статистической достоверности (р=0,003). В свою очередь в образцах порций А уровень обсемененности был выше, чем в желчи порции В.
Результаты исследования
Исследования контрольной группы, включающей 14 пациентов, нестрадающих заболеваниями желчевыводящих путей, выявили инфицированность желчи Н. pylori у 2 обследованных (14,2±7,5)%. При посевах образцов на ЭКАА базальной желчи было выделено 2 штаммов Н. pylori (14,2±7,5)%, на КАА - 3 изолятов (21,4±6,4)%. При посеве пузырной порции желчи на ЭКАА было выделено 1 штамм (7,1±5,6)%, на КАА - 1 изолят (7,1±8,8)%. В порции протоковой желчи был выделен 1 штамм на ЭКАА, в на КАА не было выделено ни одного штамма Н. pylori.Анализ исследования частоты обнаружения Н. pylori в порциях желчи контрольной группы показал, что в порциях В и С она ниже, чем в этих же порциях группы больных хроническим некалькулезным холециститом (р=0,005)
Сравнительный анализ уровней обсемененности порций желчи больных контрольной группы и группы больных хроническим некалькулезным холециститом выявил, что уровень обсемененности контрольной группы на питательных средах ЭКАА и КАА ниже чем в порциях желчи больных хроническим некалькулезным холециститом - Средний уровнь обсемененности Н. pylori порций желчи больных хроническим некалькулезным холециститом и контрольной группы.
Таким образом, частота обнаружения Н. pylori в пузырной порции желчи больных страдающих ЖКБ составила 29,6±8,8%. Обсемененность пузырной желчи исследуемой группы составила 1,8x103 КОЕ/мл на ЭКАА и 1,5x103 КОЕ/мл на КАА. Изучение уровней обсемененности исследованных образцов желчи больных желчекаменной болезнью и пациентов с некалькулезным холециститом показало, что они достоверно превышают таковые лиц из контрольной группы (р=0,005) Аналогичные находки
были сделаны и при обследовании пузырной желчи и желчи внутрипеченочных протоков (полученые при холедохотомии). При исследовании порций желчи из внутрипеченочных протоков, полученных от трех женщин, страдающих сахарным диабетом (средний возраст 64,5±3,7 года), в двух образцах был выделен Н pylori и в одном - культура хеликобактеров, уреазонегативных в CLO—тесте. Этот образец также отличал низкой микробной обсемененностью, составившую, в среднем (0,49±0,1)х103 КОЕ/мл.
Следует отметить, что помимо Н. pylori, из желчевыводящих путей человека могут присутствовать другие уреазопозитивные и уреазонегативные хеликобактеры: Н. pullorum, Н canis, Н cholecys-tus, Н. rappini, Н. hepaticus и Н. bilis. Для многих из них прямо показана связь с развитием патологий гепатобилиарной системы. [Fox J.G. et al., 2009]. При этом большинство из них отличает устойчивость к действию солей желчных кислот. Кроме того, они включают как уреазанегативные, так и уреазапозитивные виды. Для подтверждения факта достаточно высокой колонизации Н. pylori желчевыводящих путей, были выявленные нами бактериологическим методом,
Литература
1.Fox J. G. The non-H.pylori helicobacters: their expanding role in gastrointestinal andsystemic diseases / J. G. Fox // Gut. -2002. - Vol. 50, N 2. - P. 273-283.
2.H. pylori are associated with chronic cholecystitis /D. F. Chen [et al.]// World. J. Gastroenterol. - 2007. - Vol. 13, N 7. - P. 1119-1122.
3.Helicobacter bilis colonization of the biliary system in patients with pancreaticobiliary maljunction / T. Kosaka [et al.]//Br. J. Surg. - 2010. - Vol. 97, N 4. - P. 544-549.
4.Helicobacter DNA in bile: correlation with hepato-bilary diseases / C. A. Fallone [et al.]//Aliment. Pharmacol. Ther. - 2003. - Vol. 17, N 3. - P. 453-458.
5.Helicobacter hepaticus cytolethal distending toxin causes cell death in intestinal epithelial cells via mitochondrial apoptotic pathway /N. P. Liyanage [et al.]//Helicobacter. - 2010. - Vol. 15, N
2. - P. 98-107.
6..Helicobacter infection and cirrhosis in hepatitis C virus carriage: is it an innocent bystander or a troublemaker? /A. Ponzetto [et al.]// Med. Hypotheses. - 2000. - Vol. 54, N 2. - P. 275-277.
7..Helicobacter infection in hepatocellular carcinoma tissue /S. Y. Xuan [et al.]// World J. Gastroenterol. - 2006. - Vol. 12, N 15. -P. 2335-2340.
8.Helicobacter pylori accelerates the biliary epithelial cell proliferation activity in hepatolithiasis / T. Kuroki [et al.]// Hepatogastroenterology. - 2002. - Vol. 49, N 45. - P. 648-645.
9.Helicobacter pylori and Helicobacter heilmannii in children. A Bulgarian study/L. Boyanova [et al.]//Diagn. Microbiol. Infect. Dis. - 2003. - Vol. 46, N4.-P. 249-252.
10.Identification of helicobacter species in human liver samples from patients with primary hepatocellular carcinoma / Y. Huang [et al.]// J. Clin. Pathol. - 2004. - Vol. 57, N 12. - P. 12731277.
11.Helicobacter pylori DNA in gallbladder tissue of patients with cholelithiasis and cholecystitis /K. Yucebilgili [et al.]// J. Infect. Dev. Ctries. - 2009. - Vol. 3, N 11. - P. 856-859.
12.Helicobacter species identified in liver from patients with cholangiocarcinoma and hepatocellular carcinoma /H. O. Nilsson [et al.]// Gastroentrol. - 2000. - Vol. 120, N 1. - P. 323-324.
13.Ивашкин В. Т. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии: научное издание /В. Т. Ивашкин, Ф. Мегро, Т. Л. Лапина. - М.: Триада-Х, 1999. - 258 с.
14.Аруин Л. И. Helicobacter pylori: начало второго десятилетия /Л. И. Аруин //Архив патологии. - 1995. - №
3. - С. 15.Helicobacter pylori may play a contributory role in the pathogenesis of primary sclerosing cholangitis / A. M. Krasinskas [et al.]//Dig. Dis. Sei. - 2007. - Vol. 52, N 9. - P. 2265-2270.
