CC BY
64
3. Кветной И.М., Ингель И.Э. Гормональная функция неэндокринных клеток: роль нового биологического феномена в регуляции гомеостаза // Бюл. экспер. биол. и мед. 2000. Т. 130, № 11. С. 483-487.
4. Любовцева Л.А., Ефремова О.А., Голубцова Н.Н. Свойства гранулярных люминесцирующих клеток // Международный журнал по иммунореабилитации. 2009. Т. 11, N° 1. С. 25-26.
5. Ноздрин В.И., Барашкова С. А., Семченко В.В. Кожа и ее производные. Омск: Омск. гос. мед. акад., 2005. 210 с.
6. Смирнова И.О., Кветной И.М., Князькин И.В. Нейроэндокринология кожи и молекулярные маркеры ее старения. СПб.: ДЕАН, 2005. 210 с.
7. Fraser R.G., Pare J.A.P., Pare P.D. et al. Diagnosis of Diseases of the Chest (3rd ed.). Philadelphia: Saunders, 1989. P. 1476-1494.
8. KulreM.H., MayerR.J. Carcinoid tumors // New Engl. J. Med. 1999. Vol. 340. P. 858.
9. Zancanaro C., Merigo F., Creso C. et al. Immunohistochemical evidence suggests intrinsic regulatory activity of human eccrine sweat glands // J Anat. 1999. Vol. 194 (Pt 3). P. 433-444.
ЕФРЕМОВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА - ассистентка кафедры цитологии, эмбриологии, гистологии, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары ([email protected]).
EFREMOVA OLGA ALEXANDROVNA - assistant lecturer of Cytology, Histology, Embryology Department, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
ГУРЬЯНОВА ЕВГЕНИЯ АРКАДЬЕВНА - кандидат медицинских наук, доцент кафедры восстановительной медицины, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары ([email protected]).
GURIANOVA EVGENIYA ARKADYEVNA - candidate of medical sciences, assistant professor of Regenerative Medicine Department, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
ЛЮБОВЦЕВА ЛЮБОВЬ АЛЕКСЕЕВНА - доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой цитологии, эмбриологии, гистологии, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары.
LUBOVTSEVA LUBOV ALEKSEEVNA - doctor of biology sciences, professor, head of Cytology, Histology, Embryology Department, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
ЛЕОНОВА ЛЮДМИЛА КОНСТАНТИНОВНА - кандидат медицинских наук, доцент кафедры цитологии, эмбриологии, гистологии, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары.
LEONOVA LUDMILA KONSTANTINOVNA - candidate of medical sciences, assistant professor of Cytology, Histology, Embryology Department, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.
УДК 616.36:579.84
Г.Ш. ИСАЕВА
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ШТАММОВ HELICOBACTER PYLORI, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ С ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ГЕПАТОБИЛИАРНОЙ СИСТЕМЫ
Ключевые слова: Helicobacter pylori, генотипы, гепатобилиарная система.
Образцы ДНКH.pylori, выделенные от 83 больных хроническими воспалительными заболеваниями гепатобилиарной системы, были проанализированы на присутствие vacA, cagA, babA генов. Генотипирование 31 изолята H.pylori показало их гетерогенность. В колонизации печени и желчного пузыря патогенетическую роль могут играть штаммы H.pylori cagА, babA-негативные, vacA-позитивные c незначительным уровнем токсической активности.
G.Sh. ISAEVA
GENETIC HETEROGE^ITY OF STRAINS HELICOBACTER PYLORI ISOLATED FROM PATIENTS WITH HEPATOBILIARY SYSTEM’S DISEASES Key words: Helicobacter pylori, genotypes, hepatobiliary system.
DNA samples of H.pylori isolated from 83 patients with hepatobiliary system’s diseases were analyzed for the presence of vacA, cagA, babA genes. The genotyping study of 31 isolates H.pylori demonstrated their heterogeneity. Strains H.pylori cagА, babA-negative and vacA-positive with low level of toxic activity сan play pathogenic role in the colonization of the liver and the gallbladder.
Штаммы H.pylori отличает огромное генетическое разнообразие. Как известно, штаммы H.pylori разделены на два основных генотипа: тип I - имеющие cagA и экспрессирующие CagA и VacA цитотоксины и тип II - не экспрессирующие их. С определенным генотипом может быть связана различная колони-
зирующая способность штаммов H.pylori. В печати в последние годы появились сообщения об обнаружении этих бактерий у больных с заболеваниями гепатобилиарной системы, но вопрос об их роли окончательно не изучен.
Целью исследования стало изучение генотипов изолятов H.pylori, выделенных от больных с воспалительными заболеваниями гепатобилиарной системы.
Материал и методы. Было обследовано 42 пациента (средний возраст 38,6 года) с диагнозом хронический некалькулезный холецистит (ХНХ); 30 пациентов (средний возраст 58,3 года) с диагнозом хронический калькулезный холецистит (ХКХ); 11 пациентов с циррозом печени (ЦП) (средний возраст 57,1 года). Материалом для исследования служили образцы желчи, слизистой оболочки желчного пузыря, желчных протоков, ткани печени. Выделение ДНК из биопроб производили с использованием набора «Хеликопол» (НПФ «Ли-тех», г. Москва) в соответствии с рекомендациями производителя.
Амплификацию специфических фрагментов генома H.pylori производили по методике, предложенной НПФ «Литех» (г. Москва). Определяемыми фрагментами ДНК являлись гомологичные участки гена ureC H.pylori. Кроме того, проводился анализ положительного и отрицательного (деионизированная вода) контрольных образцов для оценки чистоты эксперимента и исключения возможности контаминации. В готовую реакционную смесь вносили по 5 мкл анализируемого образца, тщательно перемешивали и проводили амплификацию по следующей программе: 94°С - 60 с, 94°С - 30 с, 60°С - 30 с, 72°С - 30 с в течение 5 циклов; 92°С - 5 с, 50°С - 10 с, 72°С - 15 с в течение 40 циклов.
Для генотипирования штаммов H.pylori в отношении cagA, babA2 и vacA использовали набор реагентов НПФ «Литех»: «Хеликопол CA» и «Хеликопол VA», «Хеликопол BA» (Москва) согласно инструкции фирмы-изготовителя. Реакционная смесь в объеме 30 мкл содержала 1мкг ДНК H.pylori, 50мМ Kcl, 10мМ Tris НСЬ pH 8,8, 1,5мМ Mg2+, 0, 08% Nonidet P40, по 20 пкМ каждого праймера, по 200 мкМ каждого дНТФ и 2,5 ед Taq-полимеразы. Типирование клинических изолятов осуществляли в следующих условиях: 94°С - 1 мин; 94°С - 1 мин, 52°С - 1 мин, 72°С - 2 мин в течение 35 циклов; 72°С - 5 мин.
Размеры полос в положительных пробах при электрофорезе были следующие: ureC - 492 п.н., cagA - 404 п.н., vacAsl - 259 п.н., vacAs2 - 286 п.н., vacAml - 290 п.н., vacAm2 - 352 п.н., babA2 - 800 п.н.
Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводили в 2%-ном агарозном геле («Хеликон», Москва) при напряжённости электрического поля 5-8 В/см. Использовали трис-ацетатный буфер (40мМ Трис-ацетат; рН 7,6; 0,02 М ацетат натрия; 0,002 М ЭДТА-Na). О ходе электрофореза судили по миграции бромфенолового синего.
В качестве маркера молекулярных масс использовали фрагменты ДНК GeneRules™ 100 bp (base pairs - пар нуклеотидов, п.н.) DNA Ladder Plus («Fermentas», Литва). Результаты документировали с помощью видеосистемы для регистрации гелей «DNA Analyzer» (НПФ «Литех», Россия).
Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия х2 и компьютерной программы Exсel.
Результаты исследования. В результате тестирования клинических образцов с помощью ПЦР на наличие ureC гена H.pylori был обнаружен у 31 больного, из них у 21 пациента - ХНХ, у 2 пациентов ХКХ и у 8 пациентов - ЦП. Образцы ДНК H.pylori были проанализированы на присутствие vacA, cagA, babA генов (результаты представлены в табл. 1).
Цитотоксичность - важнейший фактор патогенности H.pylori. Последние исследования показывают, что этот микроорганизм вызывает повреждение эпителиальных клеток посредством выработки цитотоксинов VacA (vacuolating-associatted cyto-toxin) и CagA (cytotoxin-asso-ciated gene). Вакуолизирую-щий (VacA) токсин изменяет работу протонных насосов и влияет на поток ионов, вызывая при этом накопление вакуолей в клетках. Возможно, что образующиеся вакуоли защищают H.pylori от бактерицидного действия лизосом, что способствует персистенции бактерии [8]. Вакуолизирующий токсин кодируется геном vacA, существующим в двух аллельных вариантах. Уровень секреции вакуолизирующего токсина определяется мозаичной структурой vacA гена. Регион vacA s существует в двух аллельных типах: si и s2. В si идентифицированы подтипы: sla, sib, sic. Средний регион m существует в двух аллельных вариантах: ml и m2 [2]. Штаммы H.pylori, имеющие генотипы slml и sim2, обладают максимальным или средним уровнем секреции цитотоксина, тогда как штаммы s2m2 проявляют незначительную токсическую активность [3]. Генотипирование выделенных изолятов от больных хроническим холециститом (XX) показало наличие той или иной аллели гена vacA во всех образцах. Так, vacA si генотип присутствовал у 16 изолятов, vacAs2 -у 9 изолятов. В шести случаях был верифицирован смешанный генотип vacAsi/s2, указывающий на присутствие более чем одного штамма H.pylori. Средний регион m был выявлен в обоих аллельных вариантах, но с различной частотой встречаемости: mi - в 4 случаях, m2 - в 10 случаях. В обследуемой нами выборке у 69,6% больных ХХ обнаружен ген vacAsi. У 75% больных ЦП изо-ляты H.pylori имели vacA ген, при этом у большинства изолятов (50%) он был представлен vacAs2 аллельным вариантом, поровну - по 12,5% - вариантом va-cAsi и смешанным генотипом vacAsi/s2. Регион m был выявлен только в одном аллельном варианте m2.
Белок CagA является маркером присутствия cag-PAl (Pathogenicity Island, остров патогенности). Ген cagA кодирует белки IV секреторной системы H.pylori, функция которой состоит в транспортировке эффекторных молекул бактерии к эукариотическим клеткам [5]. Ген cagA, по результатам нашего исследования,
Таблица 1
Определение генов патогенности H. pylori в клинических изолятах, выделенных от больных с заболеваниями гепатобилиарной системы
Генотипы H.pylori Холецистит n,% Цирроз печени n,% P X2 ГБС n,%
n = 23 8 31
vacA mi+ 4(17,4) 0 0,515 0,42 4(12,9)
vacA mi 19(82,6) 8(100,0) 0,515 0,42 27(87,2)
vacA m2+ 10(43,5) 4(50) 0,926 0,01 14(45,2)
vacA m2 13(56,5) 4(50,0) 0,926 0,01 13(54,8)
vacAsi+ 16(69,6) 1(12,5) 0,017 5,67 17(54,8)
vacA si- 7(30,4) 7(87,5) 0,017 5,67 14(45,2)
vacA s2+ 9(39,1) 4(50,0) 0,904 0,01 13(41,9)
vacA s2 14(60,9) 4(50,0) 0,904 0,01 18(58,1)
vacAsi+/s2+ 6(26,1) 1(12,5) 0,764 0,09 7(22,6)
cagA+ 9(39,1) 3(37,5) 0,734 0,12 12(38,7)
cagA- 14(60,9) 5(62,5) 0,734 0,12 19(61,3)
babA2+ 5(21,7) 1(12,5) 0,960 0,00 6(19,4)
babA2 18(70,6) 7(87,5) 0,960 0,00 25(80,6)
обнаруживали в геноме лишь некоторых штаммов H.pylori. В большинстве случаев - в 60,9% при хроническом холецистите и в 62,5% случаев ЦП - изоляты были cagA-негативными Белки ВаЬ (blood group antigen-binding adhesion - адге-зин, ассоциированный с группой крови), гены которых (babA и babB) присутствуют в виде несколько аллелей [4], обуславливают адгезию H.pylori с системой антигенов Lewis на эпителиальных клетках желудка. В нашем исследовании, так же как и в случае с геном cagA, большинство изолятов являлись babA2-негативными: в 70,6% случаев при ХХ и в 87,5% случаев при ЦП.
Наши данные коррелируют с ранее проведенными зарубежными исследованиями. E. Apostolov и соавт. (2005) демонстрировали присутствие цитотоксинов CagA и VacA в эпителиальных клетках желчного пузыря при хроническом воспалении [1]. P. Stalke и соавт (2005) выявили высокую частоту инфицирования H.pylori в печени и желудке с использованием иммуногисто-химических и молекулярных методов. При этом CagA штаммы в печени выявляли значительно реже, чем в желудке, что позволило предположить возможную роль cagA-негативных штаммов в развитии заболеваний печени [7]. Сходные данные были получены T. Pirouz и соавт. (2009), которые обнаружили ДНК H.pylori в 17 образцах печени 46 больных, при этом все изоляты H.pylori были cagA-негативными [6].
Таблща 2 Исследование генотипов изо-
лятов H.pylori, выделенных от Комбинации генов патогенности м
vacA, cagA и babA2 в клинических изолятах б°льных хр°ническими воспали-
H. pylori, выделенных от больных тельными заболеваниями ГБС,
хр°ническим холециститом и цирр°з°м печени показало их гетерогенность (дан-
ные представлены в табл. 2). Преобладания какого-либо генотипа выявлено не было. Несмотря на это, можно отметить наличие особенностей генотипов H.pylori, колонизирующих ГБС: в колонизации печени и желчного пузыря патогенетическое значение могут иметь штаммы H.pylori преимущественно cagА, babA-негативные, vacA-позитивные, но отличающиеся преобладанием m2 аллельного варианта, имеющего незначительный уровень токсической активности.
Литература
1. Apostolov E., Abu Al-Soud W., Nilsson I. et al. Helicobacter pylori and other Helicobacter species in gallbladder and liver of patients with chronic cholecystitis detected by immunological and molecular methods // Scand J Gastroenterol. 2005. Vol. 40. P. 96-102.
2. Atherton J.C., Cao P., PeekR.M.J. et al. Mosaicium in vacuolating cytotoxin alleles of Helicobacter pylori. Association of specific vacA types with cytotoxin production and peptic ulceration // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 28, № 270(30). P. 17771-17777.
Генотипы H.pylori Холе- цистит n,% Цирроз n,% P X2 ГБС n,%
n = 23 8 31
cagA+vacAsi 4 (17,4) 0 0,515 0,42 4 (12,9)
cagA+vacAsimi 1 (4,3) 0 0,574 0,32 1 (3,2)
cagA+vacAsi/s2 2 (8,7) 0 0,979 2 (6,5)
cagA+vacAsim2 3 (13,0) 0 0,703 0,14
cagA+vacAsi/mi/m2 1 (4,3) 0 0,574 0,32 2(6,5)
cagA+vacAs2 0 2(25,0) 0,100 2,70 2(6,5)
cagA+vacAs2m2 0 1(12,5) 0,574 0,32 1 (3,2)
cagA+vacAsi babA2 1 (4,3) 0 0,574 0,32 1 (3,2)
cagA-vacAsis2 3 (13,0) 0 0,703 0,14 3 (8,0)
cagA-vacAsis2/m2 1 (4,3) 1(12,5) 0,979 0,00 2 (6,5)
cagA-vacAsi/m2 1 (4,3) 0 0,574 0,32 1 (3,2)
cagA-vacAs2m2 2 (8,7) 0 0,979 0,00 2 (6,5)
cagA-vacAsis2 babA2 1 (4,3) 0 0,574 0,32 1 (3,2)
cagA-vacAsim2 babA2 2 (8,7) 0 0,979 0,00 1 (3,2)
cagA-vacAmi babA2 1 (4,3) 0 0,574 0,32 1 (3,2)
cagA-vacAm2 babA2 1 (4,3) 0 0,574 0,32 1 (3,2)
3. Cover T.L., Blaser M.J. Purification and characterization of the vacuolating toxin from Helicobacter pylori // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267. P. 10570-10575.
4. Ilver D., Arnqvist A., Ogren J. et al. Helicobacter pylori adhesin binding fucosylated histo-blood group antigens revealed by retagging // Science. 1998. Vol. 279. P. 373-377.
5. Odenbreit S., Puls J., Sedlmaier B. et al. Translocation of Helicobacter pylori CagA into gastric epithelial cells by type IV secretion // Science. 2000. Vol. 287. P. 1497-1500.
6. Pirouz T., Zounubu L., Keivani H. et al. Detection of Helicobacter pylori in paraffin-embedded specimens from patients with chronic liver diseases using the amplification method // Dig Dis Sci. 2009. Vol. 54(7). P. 1456-1459.
7. Stalke P., Abu Al-Soud W., Bielawski K.P. et al. Detection of Helicobacter species in liver and stomach tissues of patients with chronic liver disease using polymerase chain reaction- denauring gradient gel electrophoresis and immunohistochemistry // Scand. J. Gastroenterol. 2005. Vol. 40. P. 1032-1041.
8. Terebiznik M.R., Vazquez C.L., Torbicki K. et al. Helicobacter pylori VacA toxin promotes bacterial intracellular survival in gastric epithelial cells // Infect Immun. 2006. Vol. 74. P. 6599-6614.
ИСАЕВА ГУЗЕЛЬ ШАВХАТОВНА - кандидат медицинских наук, доцент кафедры микробиологии, Казанский государственный медицинский университет, Россия, Казань ([email protected]).
ISAEVA GUZEL SHAVKHATOVNA - candidate of medical sciences, assistant professor of Microbiology Department, Kazan State Medical University, Russia, Kazan.
УДК 613.73-05.3.6(470.344)
Т.М. КОЖЕВНИКОВА
ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ВЫСОКОКВАЛИФИЦИРОВАННЫХ СПОРТСМЕНОВ ПОДРОСТКОВОГО ВОЗРАСТА ЧУВАШСКОЙ РЕСПУБЛИКИ
Ключевые слова: подростки, спортсмены, физическое развитие, Чувашская Республика.
Изучены особенности роста и развития спортсменов-подростков Чувашии. Удельный вес практически здоровых спортсменов составил 25,0%о, в группе сравнения — 22,8%. У школьников преобладает сочетанная патология систем и органов, в то время как у высококвалифицированных спортсменов подросткового возраста в основном выявлены отдельные заболевания, преимущественно костно-мышечной системы, органов дыхания и нервной системы.
T.M. KOZHEVNIKOVA FEATURES OF THE DEVELOPMENT OF ELITE ATHLETES ADOLESCENCE CHUVASH REPUBLIC
Key words: adolescents, athletes, physical development, Chuvash Republic.
The features of growth and development of adolescent athletes Chuvashia. Specific weight apparently healthy athletes was 25,0% in the comparison group 22,8%. Schoolchildren prevails combined pathology systems and organs, while highly skilled athletes adolescence mostly identified certain diseases, primarily of the musculoskeletal system, respiratory and nervous system.
Подростковый возраст является одним из критических этапов в жизни человека [1]. В этот период завершается становление ряда морфологических, физиологических и психологических функций, существенно отличающих подростков от детей и взрослых. В настоящее время в связи с явлениями де-целерации физического развития в сочетании с ухудшением состояния здоровья детей в последние десятилетия число здоровых подростков, занимающихся спортом, уменьшается год от года [2]. Нами обследованы две группы подростков Чувашии. В первой, основной, группе обследовано 146 спорт-сменов-подростков, учащихся 8-11 классов и I-III курсов Училища олимпийского резерва г. Чебоксары, имеющих высокую спортивную квалификацию (от первого взрослого разряда до мастера спорта международного класса). Средний возраст спортсменов 15,5±0,03 года. Вторую группу (сравнения) составили 130 старшеклассников средних общеобразовательных школ № 38,
