CC BY
61
карбоксипептидаза N является одним из ферментов процессинга энкефалинов [16], то дальнейшее снижение ее активности через 24 и 72 ч может, по всей видимости, приводить к снижению уровня опиоидных пептидов при воздействии атропина.
1.2 -1
05 ч 4 ч 24 ч 72 ч
Рис. 3. Активность КПЫ при действии атропина в сыворотке крови крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, М±т, п=4+6). Здесь: □ - контроль, Ц - атропин 2,5 мг/кг. * - р < 0,05, ** - р < 0,01, *** - р < 0,001 относительно контроля
Таким образом, полученные в работе данные позволяют предположить, что вызванные введением атропина изменения в активности основных карбоксипеп-тидаз являются одним из факторов, обусловливающих снижение уровня регуляторных пептидов при действии токсических доз атропина.
список ЛИТЕРАТУРЫ
1. Судаков С. К. Клеточные и нейрохимические механизмы действия холинотропных препаратов // Успехи совр. биол. 1968. Т. 105. № 1. С. 100-106.
2. Laubie M., Schmitt H. Sites of action of clonidine: centrally mediated increase in vagal tone, centrally mediated hypotensive and sympatho-inhibitory effects // J. Pharmacol. 1985. Vol. 16. P. 69-94.
3. Malcolm P., Caulfield, Nigel J.M. Classification of Muscarinic Acetylcholine Receptors // Pharm. Reviews. 1998. Vol. 50. P. 279-290.
4. Крылов С. С., Ливанов Г. А., Петров А. Н., Семенов Е. В., Спринц А. М., Бучко В. М. Клиническая токсикология
лекарственных средств. Холинотропные препараты. СПб.: Лань, 1999. 160 с.
5. Громов Л. А., Жила В. А. Влияние центральных холи-нолитиков на содержание опиоидных нейропептидов в мозгу животных // Укр. биохим. журн. 1986. Т. 58. № 6. С. 61-63.
6. Beinfeld M. C. Prohormone and proneuropeptide processing. Recent progress and future challenges // Endocrine. 1998. Vol. 8. P. 1-5.
7. Вернигора А. Н., Генгин М. Т. Протеолитические ферменты: субклеточная локализация, свойства и участие в обмене нейропептидов // Биохимия. 1996. Т. 61. № 5. С. 771-785.
8. Fricker L.D., Snyder S.H. Purification and characterization of enkephalin convertase, an enkephaline-synthesizing carboxypeptidase // J. Biol. Chem. 1983. Vol. 258. P. 10950-10955.
9. Hendriks D., Sande M., Scharpe S. Colorimetric assay for carboxypeptidase N in serum // Clin. Chim. Acta. 1986. Vol. 157. P. 103-108.
10. Hendriks D., Scharpe S., van Sande M., Lommaert M.P. Characterisation of a carboxypeptidase in human serum distinct from carboxypeptidase N // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1989. Vol. 27. P. 277-285.
11. Lee P. N., Takahaski T. N. An improved colorimetric determination of amino acid with the use of ninhydrine // Analyt. Biochem. 1966. Vol. 14. P. 71-77.
12. Lowry O. H., Rosebrought N. J., Farr A. G., Randall R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. № 1. P. 265-275.
13. Громов Л. А., Лохвицкая К. Н. Влияние амизила на медиаторный обмен мозга // Фармакология и токсикология. 1971. Т. 6. С. 24-26.
14. Andersson K., Eneroth P., Fuxe K., Harfstrand A. Effects of Intravenous Cocaine and Cigarette Smoking on Luteinizing Hormone, Testosterone, and Prolactin in Men // Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 1998. Vol. 337. P. 131-139.
15. Pitkinen A., Beal M.F., Sirvits J., Swartz K.J., Minnist P.T., Riekkinen P.J. Somatostatin, neuropeptide Y, GAB A and cholinergic enzymes in brain of pentylenetetrazol-kindled rats // Neuropeptides. 1989. Vol. 14. P. 197-207.
16. Лишманов Ю. Б., Трифонова Ж. В., Цибин А. Н. Бета-эндорфин и стресс-гормоны плазмы крови при состояниях напряжения и адаптации // Бюлл. эксперим. биол. медицины. 1987. Т. 103. № 4. С. 422-424.
УДК. 577.1
КОМЕТАБОЛИЗМ ЭДТА И ГЛЮКОЗЫ БАКТЕРИАЛЬНОГО ШТАММА LPM-4
Е. И. ЮДИНА, Э. Г. ДЕДЮХИНА, В. А. СМЕТАНИН Пензенский государственный педагогический университет им. В. Г. Белинского
кафедра биохимии
Мониторинг окружающей среды показывает, что в ней происходит постоянное накопление ЭДТА. Многочисленные исследования показали, что деградации ЭДТА в очистных сооружениях не происходит, а в природе существует лишь один значимый способ деградации ЭДТА - разложение комплекса Fe (Ш)EDTA под действием УФ лучей, который происходит лишь на поверхности воды [2]. Накопление ЭДТА в воде приводит к ухудшению качества питьевой воды, так
как ЭДТА способствует переходу в растворенное состояние ионов металлов (в том числе тяжелых и токсичных). Следует обратить внимание на то, что здоровью человека в первую очередь угрожают комплексы ЭДТА с токсичными металлами, а не ЭДТА как химическое соединение.
В настоящее время известно несколько смешанных культур и всего три чистые культуры ЭДТА-де-
градирующих бактерий: Agrobacteriumsp. ATCC 55002, потребностью в ЭДТА [1]. Данный штамм является
грам-отрицательный изолят BNC 1, грам-отрицатель- уникальным т. к. способен расти только на средах, со-
ные бактерии DSM 9103 и Pseudomonas sp. LPM-410 держащих ЭДТА, и способен метаболизировать глюко-
[7]. В лаборатории физиологии микроорганизмов зу только в его присутствии. Целью настоящей работы
ИБФМ РАН был выделен новый ЭДТА-разрушаю- было исследование совместного метаболизма ЭДТА и
щий бактериальный штамм LPM-4 со специфической глюкозы у бактериального штамма LPM-4.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
условия культивирования
Посев штамма LPM - 4 на ЭДТА - содержащий агар
4
Смыв культуры
4
Засев в жидкую среду с ЭДТА
4
Культивация в течение 3-4 суток
4
Перенесение инокулята в колбы
4
Культивирование на качалке при 200 об/мин при температуре 30°С 10 суток
4
Перенос в среду
^ \ \ X X
ЭДТА ЭДТА + ЭДТА ЭДТА ЭДТА ЭДТА ЭДТА ЭДТА глюкоза 4 4 4 4 4 4
\ 1 сутки 2 сутки 3 сутки 4 сутки 5 сутки 6 сутки
дополнит. внесение 4 4 4 4 4 4
глюкозы на 8 сутки До бавление глюкозы
методы анализа
Пробы из колб отбирали один раз в сутки и проводили измерения рн, биомассы, концентрации глюкозы, ЭДТА и аммония.
Содержание биомассы определяли спектрофотометрически на приборе Specol 221 (Germany) при 546 нм после подкисления анализируемой пробы 5 % раствором HN03 до рН=2,0 для растворения солей, выпадающих в осадок в процессе культивирования [5].
Концентрацию ЭДТА определяли высокоэффективной жидкостной хроматографией на хроматографе HPLC (Waters. Great Britan), оснащенном колонкой Nukleosil 100 (Machery und Nagel, Germany) при 285 нм [2].
Концентрацию глюкозы определяли энзиматичес-ки с применением глюкозооксидазы и пероксидазы [6].
Содержание ионов аммония определяли потенциометрическим методом с помощью иономера Экотест-
120 (ИЭЛРАН НПП ЭКОНИКС) и ионселективного электрода “Эком^Н4” [7].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Показано, что штамм ЬРМ-4 способен совместно метаболизировать ЭДТА и глюкозу, что является случаем кометаболизма. Штамм ЬРМ-4 способен к такому типу кометаболизма, в ходе которого процессы ассимиляции неростовых субстратов сопряжены с использованием ростовых субстратов, в результате чего соединения углерода включаются в компоненты клетки [3, 4].
Во всех вариантах опыта деградация ЭДТА отмечалась уже на 1 сутки роста и заканчивалась на 3 сутки, независимо от присутствия глюкозы в среде. Вероятно, что присутствие косубстрата (глюкозы) не оказывало влияния на деградацию ростового субстрата (ЭДТА).
При внесении глюкозы в среду до посева бактерий потребление глюкозы началось только на 3 сутки роста, после полной деградации ЭДТА, и закончилось на 8 сутки роста (рис. 1). Можно предположить, что энергия, образующаяся в процессе деградации ЭДТА, используется клетками для индукции ферментов метаболизма глюкозы или для ее транспорта. Потребление глюкозы сопровождалось увеличением плотности биомассы в два раза по сравнению с контролем.
Чтобы проверить, сохраняется ли способность клеток к дальнейшей ассимиляции глюкозы после ее исчерпания, на 8 сутки в среду дополнительно внесли глюкозу. Как видно на рис. 1, потребление глюкозы началось сразу же после ее повторного внесения и привело к дальнейшему приросту биомассы до полного потребления глюкозы. Следовательно, индуцированная способность клеток к ассимиляции глюкозы сохраняется в течение длительного времени.
5
1_
<
4
О
га
м
е
52
с
0,
Время, сутки
Ж Глюкоза —•—ЭДТА, контроль
О ЭДТА, опыт —•—Биомасса, контроль
О Биомасса, опыт
Рис. 1. Динамика роста и потребления глюкозы и ЭДТА при добавлении глюкозы до посева бактерий (вариант 2).
При внесении глюкозы в среду на 1 сутки роста бактерий (вариант 3) динамика ее ассимиляции была такой же, как в варианте 1. Потребление глюкозы началось после исчерпания ЭДТА из среды (3 сутки), закончилось на 8 сутки культивирования и привело к двукратному увеличению плотности биомассы (рис. 2).
Иная картина ассимиляции глюкозы наблюдалась при ее внесении в среду на 2 сутки роста бактерий, когда остаточная концентрация ЭДТА снизилась в 1,7 раза (вариант 4). Потребление глюкозы началось только на 4 сутки, затем наблюдалась длительная лаг-фаза, когда концентрация глюкозы в среде не изменялась. Это объясняется тем, что энергии, образовавшейся при деградации ЭДТА, было уже недостаточно для индукции ферментов метаболизма глюкозы. Интенсивная ассимиляция глюкозы происходила с 6 до 10 суток культивирования (рис. 3). Вероятно, связано это с накоплением в среде ионов аммония - продуктов деградации ЭДТА.
Время, сутки
-Глюкоза, г/л -ЭДТА, контроль - Биомасса, опыт
-ЭДТА, опыт -Биомасса. контроль
Рис. 2. Динамика роста и потребления глюкозы и ЭДТА при добавлении глюкозы на 1 сутки роста бактерий (вариант 3).
При внесении глюкозы в среду на 3 сутки роста клеток, когда деградация ЭДТА закончилась (вариант 5), глюкоза не потреблялась в течение 6 суток и только с 9 суток началась ее интенсивная ассимиляция (рис. 4). Таким образом, при внесении косубстрата в период, когда закончен метаболизм ростового субстрата, индукция ассимиляции косубстрата требует длительной лаг-фазы.
При внесении глюкозы в среду на 4-6 сутки культивирования (варианты 6, 7 и 8), т.е. через 1, 2 и 3 суток после полного потребления ЭДТА, не обнаружено ее ассимиляции (рис. 5-7), так как в среде уже не было энергии для индукции ферментов метаболизма глюкозы.
Концентрация аммония в среде увеличивается по мере деградации ЭДТА, поскольку ионы аммония - продукты деградации ЭДТА. Во всех вариантах концентрация аммония достигает максимального значения и остается на постоянном уровне в течение нескольких дней (рис. 8). Снижение концентрации аммония в среде с ЭДТА объясняется улетучиванием аммиака из среды при ее защелачивании. При добавлении глюкозы уменьшение концентрации ионов аммония начинается раньше, чем в контроле, это, возможно, связано с тем, что аммоний используется для роста клеток в присутствии глюкозы.
ВЫВОДЫ
Показано, что ассимиляция глюкозы бактериальным штаммом ЬРМ-4 индуцируется в процессе деградации ЭДТА и сохраняется в течение длительного времени. При этом потребление бактериями глюкозы сопровождалось увеличением плотности биомассы. Но при внесении глюкозы через 3, 4, 5 и 6 суток после потребления ЭДТА ассимиляции ее бактериями не обнаружено. Кроме того, кометаболизм ЭДТА и глюкозы
Время, сутки
П5
о
ш
Время, сутки
П5
о
г
о
S
Ш
Глюкоза
■Биомасса, контроль —в—Биомасса, опыт
Ж Глюкоза —♦— ЭДТА, контроль
—6—ЭДТА, опыт —•— Биомасса,контроль
О Биомасса, опыт
Рис. 5. Динамика роста и потребления глюкозы при добавлении глюкозы на 4 сутки роста бактерий (вариант 6).
Рис. 3. Динамика роста и потребления глюкозы и ЭДТА при добавлении глюкозы на 2 сутки роста бактерий (вариант 4).
6 9
Время, сутки
о
о
П5
S
ш
12
5
|_
СО
со
s
2
с
4
6
Глюкоза
Время, сутки
-Биомасса, контроль
10
-Биомасса, опыт
Рис. 6. Динамика роста и потребления глюкозы при добавлении глюкозы на 5 сутки роста бактерий (вариант 7).
0
2
8
0
3
Глюкоза —•—Биомасса,контроль —©—Биомасса, опыт
Рис. 4. Динамика роста и потребления глюкозы при добавлении глюкозы на 3 сутки роста бактерий (вариант 5).
у штамма ЬРМ-4 не оказывает влияния на деградацию ЭДТА.
Таким образом, мы убедились, что увеличение плотности биомассы штамма ЬРМ-4, вызванное потреблением глюкозы, не влияет на скорость и качество деградации ЭДТА. Поэтому работа по исследованию деградации ЭДТА не заканчивается. Дальнейшие исследования должны быть направлены на подбор
других веществ, которые способны к совместному метаболизму с ЭДТА и влиянию на деградацию этого вещества. Только тогда мы сможем решить проблему загрязнения питьевой воды ЭДТА и ее комплексов с металлами.
список литературы
1. Chistyakova T. I., Dedyukhina E. G., Satroutdinov A. D., Kaparullina E. N., Gavrish E. Yu., Eroshin V. K. EDTA-dependent bacterial strain // Process Biochem. 2005. V. 40. № 2. P. 601-605.
2. Kari F.G., Giger W. Modeling the photochemical degradation of ethylenediaminetetraacetate in the river Glatt // Environ. Ski Technol. 1995. V. 29. P. 2814-2827.
Время, сутки
Глюкоза Биомасса, контроль —©—Биомасса, опыт
Рис. 7. Динамика роста и потребления глюкозы на 6 сутки роста бактерий (вариант 8).
3. Malashenco Yu. R. Syntabolism, the transformation of non-growth substrates up to biomass by obligate methane-oxidizing bacteria // 4th Int. symp. Microbial growth on C1- compounds (Minneapolis, Sept., 1983): Abstrs. Minneapolis, 1983. Thes. 2-10.
4. Малашенко Ю. Р., Соколов И. Г., Романовская В. А. Микробный метаболизм неростовых субстратов. Киев: Наукова думка, 1987.
5. Минкевич И. Г. Материально-энергетический баланс и кинетика роста микроорганизмов. Москва-Ижевск: НИЦ “Регулярная и хаотическая динамика”, 2005. 352 с.
Время,сутки
-•-1 -Я-2 -Д-3 -Ж-4 -0-5
Рис. 8. Накопление аммония в процессе роста штамма LPM-4 на среде с (1) ЭДТА и на средах с добавлением глюкозы (2) до посева; (3) 1 сутки; (4) 2 сутки; (5) 3 сутки роста бактерий.
6. Satroutdinov A. D., Dedyukhina E. G., Chistyakova T. I., Witschel M., Minkevich I. G., Eroschin V. K., Egli T. De-gradanion of metal-EDTA complexes by resting cells of the bacterial strain DSM-9103 // Environ. Sci. Technol. 2000. V. 34. P. 1715-1720.
7. Witschel M., Nagel S., Egli T. Identification and characterization of the two-enzyme system catalyzing the oxidation of EDTA in the EDTA-degrading bacterial strain DSM-9103 // J.Bacteriol. 1997. V. 179. P. 6937-6943.
физико-математические науки
УДК517.55
оператор ¥аЬ в пространстве са и ьр
А. В. ГУЛЯЕВ, Е. В. СЕРГЕЕВА Пензенский государственный педагогический университет им. В. Г. Белинского кафедра математического анализа
В работе изучаются свойства оператора
Fa bf = — i>+bdT dn c >1
a,bJ 2ra'J Jn-A
Лп!_ dn c >1 (*)
b
n-т z Y 1
в пространствах Са и Ьр . Установлено, что этот оператор всюду непрерывен, отображает пространство Ьр на пространство Са , 0< а <1, с >1.
