CC BY
6
можно^ проследить по уравнениям авторов. Превращение же принятых в Советском Союзе размерностей (миллиграммы на 1 м3) в величине рргп (частей на миллион) при корреляционном анализе не имеет смысла, так как они отличаются от миллимолей на 1 м3 только коэффициентом, на который умножается каждая используемая в уравнении величина.
Поступила 9/Х1 1977 г.
УДК 614.777-078:628.1.03:576.851.214
Проф. Г. П. Калина
КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ ЭНТЕРОКОККОВ МЕТОДОМ МЕМБРАННЫХ
ФИЛЬТРОВ
Московский научно-исследовательский институт гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана
Проблема специальных сред для мембранного метода учета энтерококков не может считаться окончательно решенной. До недавнего времени средами, применявшимися за рубежом, были М-энтерококковый агар (Slanetz и Bartley) и агар KF (Kenner и соавт.). Однако недостатки среды KF. о которых указывалось в предыдущем сообщении, не устраняются, а, наоборот, аккумулируются при мембранном методе. На фильтре на среде KF вырастают микрококки, псевдомонады и другие грамотрицательные бактерии (Slanetz и соавт., 1965) и процент неэнтерококковых колоний доходит до 46 (Brodsky и Schiemann). На малую селективность М-энтерококкового агара (МЭА) указывают Mesrobeanu и соавт. и Daoust и Litsky. В «Унифицированных методах исследования качества вод СЭВ», рекомендующих эту среду, отмечается, что на фильтрах, помещенных на нее, следует различать бактерии Сланеца — Бертли; к ним относятся все выросшие на фильтре колонии независимо от окраски (редукции трифенилтетразолхлорида — ТТХ), из которых выделяются и подсчитываются отдельно окрашенные в разные оттенки красного цвета колонии — энтерококки. Следовательно, допускается рост и неэнтерококков (бесцветные колонии), а поскольку Str. faecium не редуцирует ТТХ и может давать слегка розовые или бесцветные колонии, возможность их учета затрудняется.
В последние годы предприняты попытки использовать для мембранного метода среду PSE (Daoust и Litsky), однако основной признак энтерококков на этой среде — черная зона вокруг колоний — теряется, поскольку преципитат эскулина не проходит через мембрану. Для устранения этого необходимо заливать фильтр той же средой («сандвич»), хотя Brodsky и Schiemann считают, что.среда настолько селективна, что можно подсчитывать все колонии, выросшие на фильтре, поскольку 86% выросших колоний оказываются энтерококками. Levin и соавт. модифицировали эту среду и считают ее высокоспецифичной, однако ее использование усложняется тем, что фильтр после инкубации приходится переносить на агар с эскулином и цитратом железа, а 11,7% ложноотрицательных и 10% ложноположительных реакций делают среду недостаточно чувствительной. Среда, представляющая интерес (бульон Тодда — Гевитта с высоким содержанием аминного азота, декстроза, азид натрия, хлорид натрия и феноловый красный), была предложена Abshire, однако о возможности ее применения для мембранных фильтров только упоминается и, зная ее состав, трудно допустить, что она обладает высокой селективностью.
Поскольку МЭА уже используется в СССР, необходимо было проверить его эффективность. Для проверки были взяты нативные хозяйственно-бытовые сточные жидкости, и хотя применение мембранных фильтров для этого объекта излишне, обилие и разнообразие микрофлоры делали последний наиболее подходящим для жесткой проверки метода. Разведения от Ю-1 до 10~4 в стерильной водопроводной воде фильтровали через фильтры
Исследование колоний, выросших на фильтрах на среде МЭА
Колонии Число колоний
общее энтерококков неэнтерококков
всего 81г. (аеса11з [асс1иш
Красные 106 82 (77,3) 49 (46,2) 33 (31,1) 24 (22,7)
Розовые 72 59 (82,0) 37 (51,4) 22 (30,6) 13 (18,0)
Красные и розовые (вме- 86 (48,3)
сте) 178 141 (79,2) 55 (30,9) 37 (20,8)
Бесцветные 43 35 (81,4) 15 (34,9) 20 (46,5) 8 (18,6)
Итого ... 221 176 (79,2) 101 (45,7) 75 (33,9) 45 (20,4)
П р и'м е ч а н и е. В скобках указан процент.
№ 3 Мытищинского завода, каждое разведение в 2 повторностях. Фильтры помещали на среду МЭА в прописи Американского стандарта (1972). Инкубацию проводили при 37°С в течение 24 ч. Фильтрация 0,1 мл дала сплошной рост, Ю-2 — обильный рост, 10~3 — 21 колонию, все они были изучены. Кроме того, с фильтров Ю-2 снято 200 колоний, т. е. всего исследована 221 колония (см. таблицу).
Если исходить из рекомендаций СЭВ и считать, что энтерококки образуют красные и розовые колонии различной интенсивности и, следовательно, бесцветные колонии образованы неэнтерококками (бактерии Сланеца — Берт-ли), то на фильтрах был получен ложноположительный результат в 20,8% (красные и розовые колонии были образованы неэнтерококками), а из 176 колоний, при проверке оказавшихся энтерококками, 35 (19.9%) были бесцветными, т. е. дали ложноотрицательный результат. Мы не можем делать решающих выводов из этой работы, однако, учитывая литературные данные и наличие в составе среды азида натрия, взрывчатость и токсичность которого делают нежелательным его использование в практических лабораториях, следует считать целесообразным разработку более приемлемой среды для применения при мембранном методе.
Нами были проверены следующие варианты элективных сред для мембранных фильтров: подтверждающая среда (Г. П. Калина, 1965), плотная щелочно-полимиксиновая среда (ЩЭС), модификация плотной ЩЭС с заменой глюкозы сорбитом (щелочно-сорбитный агар) для возможной дифферен-цировки разных видов энтерококков с разным содержанием карбоната и хлорида натрия, молочно-ингибиторная среда с теллуритом калия (Г. П. Калина, 1972) — МИС. Не приводя подробностей этих изысканий, укажем основные выводы из них:
— полимиксин при применении мембранного метода не препятствует развитию протеев, которые иногда роятся и покрывают фильтр сплошным налетом;
— если при прямом посеве или высеве со среды накопления грамполо-жительные микробы не развиваются на полимиксиновых средах с кристаллическим фиолетовым, то на фильтрах нередко обнаруживаются их колонии. Видимо, в данных условиях концентрация его недостаточна для их торможения, а увеличение ее приводит к торможению развития энтерококков;
— на фильтрах, главным образом при заливке их слоем среды для устранения развития строгих аэробов, и особенно на теллуритовых средах в обилии развиваются грибы. Поэтому следовало изыскать пути устранения развития протеев, отдельных грамположительных микробов и грибов.
Из всех сред наиболее успешно «работала» МИС с теллуритом калия, и последующие изыскания проводились на ее основе. Легче всего удалось избавиться от грибов, введя в состав среды нистатин в концентрации 800 ЕД/мл. После многочисленных попыток устранить развитие колоний
протея мы остановились на неомицине активном для протеев антибиотике (И. Г. Швиденко), в концентрации 10 ЕД/мл, рекомендованной В. И. Седовым. Биомицин был предложен раньше, однако Burkwall и Hartman показали его недостаточную активность в отношении кишечной группы. Учитывая это, мы не заменили полимиксин неомицином, как это рекомендует В. И. Седов, а ввели в среду оба антибиотика. Таким образом, включение в МИС с теллуритом калия (который сам по себе ингибиторен для грам-отрицательных бактерий) 3 антибиотиков и кристаллического фиолетового позволило создать среду, на которой при прямом посеве сточных жидкостей, при высеве из ЩЭС и особенно при использовании для метода мембранных фильтров практически вырастала чистая культура энтерококков. Так, при проверке среды из 46 колоний, снятых с фильтра, лишь одна, легко отличимая по величине и форме (крупная, плоская, с неровными краями) колония оказалась колонией грамотрицательных бактерий. Следовательно, 95,7% колоний, выросших на фильтре, были энтерококками. Если Brodsky и Schiemann считают возможным обходиться без дальнейшего подтверждения при наличии 86% колоний энтерококков, то полученный нами результат тем более допускает подсчет всех выросших черных и серых колоний на фильтре без последующего подтверждения (может быть только выборочная микроскопия и отсев на той же чашке, на свободном от фильтра участке отдельных подозрительных необычных колоний). Эти результаты позволяют рекомендовать предлагаемую среду (условное название МИС-3) для широкой проверки.
Состав среды: 80 мл питательного агара, 20 мл молока, 1,25 мл 0,01% водного раствора кристаллического фиолетового, 200 ЕД/мл полимиксина, 10 ЕД/мл неомицина, 800 ЕД/мл нистатина (1 таблетка содержит 250 000 ЕД, разведение ее в 3 мл воды дает в 1 мл 83 333 ЕД, которые и следует прибавить к 100 мл среды) и 0,01 г теллурита калия. К растопленному агару прибавляют стерильное молоко и остальные ингредиенты в указанном порядке, все хорошо смешивают и разливают в чашки.
Выводы
1. МЭС Сланеца — Бертли обладает низкой селективностью, дает в среднем до 20% ложноположительных и ложноотрицательных результатов.
2. Разработана и рекомендована для широкой проверки (специально для метода мембранных фильтров) МИС с 3 антибиотиками (МИС-3), на которой в среднем получается до 95% положительных результатов (95% выросших колоний оказываются энтерококками).
ЛИТЕРАТУРА. Калина Г. П. — Вопр. питания, 1972, № 2, с. 86— 89. — К а л и н а Г. П. — Гиг. и сан., 1965, № 10, с. 68—71. —Седов В. И. — Ла-бор. дело, 1977, № 1, с. 56—57. — Швиденко И. Г. — Антибиотики, 1977, № 5, с. 440—443. — Abshire R. — Appl. environ. Microbiol., 1977, v. 33, p. 1149—1155.— Brodsky M., Schiemann D. — Ibid., 1976, v. 31, p. 695—699. - Burk-wall M., Hartman P. — Appl. Microbiol., 1964, v. 12, p. 18—23. — D а о u s t R., Litsky W. — Ibid., 1975, v. 29, p. 584—589. — Ke n n e г В., С 1 a r k H., Kahler P. — Ibid., 1961, v. 9, p. 15—20. — L e v i n M. et al. — Ibid., 1975, v. 30, p. 66— 71.—M e s г о b e a n u L. et al. — Arch, rourn. Path. exp. Microbiol., 1970, v. 29, p. 67—73.— SI a netz L., Bartley С. — Am. J. publ. Hlth, 1964, v. 54, p. 609— 614. — SlanetzL., Bartley C. — J. Bact., 1957, v. 74, p. 591—595. — S 1 a -netzL., Bartley C., M e t с a 1 f T. — In: Advances in Water Pollution Research. Proceedings of the 2d International Conference. London, 1965, v. 3, p. 27—35.
Поступила 30/XI 1977 r.
