CC BY
11
туры, поверхностные водоемы и др. При проведении санитарного надзора целесообразно составлять картограммы, содержащие сведения о площади хлопковых полей, находящихся в пределах СЗЗ, а так-
же о планах применения пестицидов в этой зоне и в целом по хозяйству. Все это помогает совершенствовать контроль за применением пестицидов в хлопководстве.
Поступила 2/Х 1979 г.
УДК 614.77-078:576.851.49.07
Г. В. Меренюк, Л. С. Усатая
КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ САЛЬМОНЕЛЛ В ПОЧВЕ
Молдавский научно-исследовательскнй институт гигнены и эпидемиологии, Кишинев
Проведенные в лаборатории опыты свидетельствуют о возможности количественного учета содержания энтеропатогенных бактерий в почве. В качестве основы предлагаемого количественного метода учета сальмонелл в почве взят известный способ определения наиболее вероятного числа клеток в инокулуме, пищевых продуктах, воде, основанный на посеве определенных объемов или навесок в жидкие среды накопления, инкубации посевов, высеве из каждого посева на плотные дифференциальные диагностические питательные среды, идентификации выделенных культур, определении количества и соотношения положительных посевов. В качестве прототипа был выбран способ определения наиболее вероятного числа (НВЧ) клеток в инокулуме, в частности использована трехрядная схема, предложенная Мае Сгас1у и обоснованная I. Нозктэ, которая вошла в ГОСТ 17.1.03-77 «Правила выбора и оценки качества источников хозяйственно-питьевого водоснабжения» для определения индекса кишечных палочек в воде. Схема предусматривает посев трех объемов (10, 1 и 0,1 мл, исследование 33,3 мл) в трех повторностях и установление НВЧ в пределах от 3 до 1100 клеток в 100 мл. ГОСТ предусматривает посев 100, 10 и 1 (333) мл или 10, I и 0,1 (33,3) и даже 1, 0,1 и 0,01 (3,33) мл воды с соответствующими пересчетами на 1 л. В наших исследованиях мы придерживались этого же принципа, производя посев почвы в тех же весовых количествах — вместо 10 мл — 10 г и т. д., т. е. исследовались навески почвы, равные 33,3 и 3,33.
Пробы почвы в количестве 100 г хорошо перемешиваются. В стерильные флаконы из каждой пробы отвешивают 4 навески по 10 г, в 3 из которых добавляется жидкая питательная среда в количестве 100 мл и тщательно взбалтывается в течение 15 мин с целью десорбции клеток микроорганизмов. В 4-й флакон до 100 мл добавляется стерильная водопроводная вода и также шутеллируется 15 мин. После этого производится посев почвенной болтушки по 10 мл в 3 флаконах, содержащих 50 мл среды накопления (посев 1 г почвы), по 1 мл в 3 пробирках с 9 мл стерильной водопроводной воды. Из последней пробирки производится посев по 1 мл в 3 пробирках с 9 мл питательной среды (посев
0,01 г почвы). Посевы инкубируются при 37ЭС. Через 18—20 ч инкубации из всех флаконов и пробирок производится высев на плотные дифференциально-диагностические питательные среды. Чашки инкубируются в течение 18—20 ч (чашки с вис-мут-сульфит агаром 48 ч) при температуре 37°С. После просмотра чашек подозрительные колонии отвиваются на среде Олкеницкого с последующей идентификацией по общепринятой методике (определение серологических и биохимических свойств). Опыты поставлены с 3 видами сальмонелл — Sal т. typhiinurium, Salm. enteritidis и Salm. paratyphi В на средах Мюллера и магниевой.
Первый этап работы заключался в проверке идентичности распределения сальмонелл как в инокулуме, так и в почве, в определении возможности количественного учета их содержания по!| выбранной схеме исследования (33,3). Поставлена серия опытов (82 пробы почвы) с искусственно зараженной Salm typhimurium стерильной почвой. Средние дозы заражения колебались от 4 до 833 клеток на 100 г почвы. Анализ полученных данных показывает, что даже на уровне единичных клеток на 100 г почвы 45% исследованных образцов оказались положительными. При увеличении доз заражения до нескольких десятков и более клеток все изученные образцы были положительными. Это свидетельствует о высокой чувствительности методики исследования. Параллельно с этим удалось учесть от 2 до 497 клеток сальмонелл на 100 г почвы. Процент учтенных клеток колебался от 50 до 131 (разница между числом внесенных и учтенных клеток несущественна). Эти данные позволяют считать, что закономерности распределения клеток сальмонелл в почве подчиняются закономерностям распределения клеток в инокулуме. Применение соответствующей схемы посева и расчетная таблица позволяют определять количественное содержание клеток сальмонелл в почве в интервале от 3 до 1100 клеток на 100 г почвы. Однако анализ фактических данных каждого анализа показал, что в подавляющем большинстве исследованнылч проб зарегистрировано 16 вариантов соотношения f положительных навесок. При анализе каждого вида соотношения положительных навесок выявлено, что между величинами отдельных соотно-
шений нет существенной разницы и, следовательно, их можно объединить в отдельные группы. О возможности объединения близких значений индексов и соответствующем математическом их обосновании говорится в работе Г. П. Калины и В. М. Сомов. Таких групп выделено 5. Определение средних доз заражения почвы показало, что они колеблются от 20 до 550 клеток на 100 г почвы. Между средними значениями доз заражения отдельных групп, а именно между группами 450 и 550 клеток/100 г почвы достоверная разница отсутствует.
В дальнейшем проведен ряд серий опытов со свободными от сальмонелл нативными почвами различного вида землепользования и различной степени бактериального загрязнения. Результаты опытов показали, что при дозах заражения от единичных до сотен клеток на 100 г почвы средний удельный вес учтенных клеток отдельных серо-типов сальмонелл при применении полной таблицы расчета составляет 48%, а при использовании сокращенной таблицы — 103%.
Следовательно, опыты свидетельствуют о возможности количественного учета содержания сальмонелл в почве с помощью схемы посева 33,3 г почвы в 9 навесках в жидкие среды накопления. Для расчета индекса сальмонелл в принципе может быть использована расчетная таблица установления НВЧ клеток в инокулуме. Однако при исследовании натнвных почв получаются заниженные результаты. Лучшей является разработанная нами расчетная таблица, применение которой позволяет в целом учитывать все количество вносимых в почву клеток сальмонелл в пределах от 20 до 550 клеток на 100 г почвы.
Однако и полной, и сокращенной схеме расчета НВЧ сальмонелл в почве присущи некоторые недостатки. При определении количественного содержания сальмонелл в почве на верхних пределах расчетных таблиц, как правило, количество учитываемых клеток значительно ниже количества вносимых, т. е. точность метода снижается. Обе таблицы позволяют установить количественное содержание сальмонелл в пределах от 20 до 550 (сокращенная таблица) и от 3 до 1100 клеток на 100 г почвы (полная схема). Поэтому нами сделаны попытки расширить диапазон указанных расчетных таблиц.
Дальнейшие опыты были поставлены по следующей схеме: 3 навески по 1 г, 3 — по 0,1 г и 3 — по 0,01 г почвы (всего 3,33 г). Постановка опытов была аналогична примененной при схеме посева 33,3 г почвы. Для расчета индекса сальмонелл использовалась та же полная расчетная таблица, но концентрация микробов в 100 мл увеличивалась в 10 раз. По такой схеме исследовано 138 проб , почвы. Автоклавнрованные почвенные образцы за-
' ЛИТЕР
Калина Г. П., Сомов В. М- — В км.: Санитарная микробиология. Под ред. Г. П. Калины, Г. Н. Чнстовнча. М., 1969, с. 18—28.
ражалнсь культурой Salm, typhimurium из расчета от 8 до II 960 жизнеспособных клеток на 100 г почвы. Анализ результатов этой серии опытов показал, что при исследовании стерильной почвы при всех дозах заражения учитывается все количество вносимых возбудителей. Проведенный дополнительный анализ выявил те же закономерности, что и при исследовании 33,3 г почвы; зарегистрированы 16 вариантов соотношения положительных навесок, которые объединены в 6 групп. Разница между средними дозами заражения отдельных групп соотношений положительных результатов достоверна, за исключением последних 2 групп с дозами заражения 3000 и 4000 клеток на 100 г почвы. Исследование по такой схеме позволяет определить обсеменение почвы сальмонеллами в интервале от 70 до 4000 клеток на 100 г почвы.
Схема посева и расчетные таблицы содержания сальмонелл в почве были апробированы при исследовании нативных почв. Было проанализировано 102 почвенных образца при заражении почвы Salm, tuphimurium из расчета от 24 до 11 000 клеток на 100 г почвы и посеве в магниевую среду.. Результаты показали, что при применении полной расчетной таблицы в среднем было учтено 72% (от 41 до 86%) от количества внесенных возбудителей, а при сокращенной расчетной таблице — в среднем 82% (от 48 до 119%).
Важно было установить возможность определения содержания сальмонелл в единичных почвенных образцах. Для этого проводился следующий опыт. Из нативного почвенного образца было отобрано 6 навесок по 100 г, которые были заражены 6 точными дозами Salm. paratyphi В 108, 324, 810, 1620, 2700, 3780 клеток на 100 г почвы. Каждый образец в 5 повторах исследован по схеме посева 3,33 г почвы и предлагаемой расчетной таблице. Результаты показали, что в целом при исследовании всех 30 почвенных образцов удельный вес учтенных клеток равняется 95%. По каждой дозе заражения процент учтенных клеток колебался от 64 до 113%, что указывает на удовлетворительные результаты. Даже при анализе результатов каждого почвенного образца в отдельности выявлено, что удельный вес учтенных клеток в 27 из 37 исследованных образцов был близким к расчетной дозе заражения — от 44 до 185% и только 3 образца дали более резкие колебания: 14, 24, 370%.
Таким образом, проведенные исследования позволяют предложить эффективный способ оценки степени обсеменения почв сальмонеллами, основанный на дробном посеве почвы в жидкие среды накопления и расчета индекса содержания сальмонелл на 100 г почвы по специально разработанной таблице. 1ТУ РА
Мае С г ad у М. — Cañad. Publ. Hltli J., 1918, v. 9, p. 201. Hoskins J. — Publ. Hlth Rep. (Wash.), 1934, v. 49,
P- 393. Поступила 3/X 1979 r.
