КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ МЕТОД АНАЛИЗА ПРОВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

Вестник АПК ,„ ,

Ставрополья ________Животноводство

№ 4(40), 2020

УДК 619:616.98:578.828.11:577.213.3 DOI: 10.31279/2222-9345-2020-9-40-35-41

Р. Б. Ахмедов, И. Я. Нам, В. В. Заякин

Akhmedov R. B., Nam I. Ya., Zayakin V. V.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ МЕТОД АНАЛИЗА ПРОВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

QUANTITATIVE METHOD FOR ANALYZING BOVINE LEUKEMIA PROVIRUS USING REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION

Представлены результаты по разработке метода по-лимеразной цепной реакции в реальном времени для количественного анализа провируса лейкоза КРС в образцах крови и спермы животных. Разработаны наборы олигону-клеотидов-праймеров для проведения ПЦР-РВ на основе фрагментов гена env вируса лейкоза КРС. Предложен набор из пяти праймеров и двух линейных проб типа TaqMan. Использование предложенных синтетических олигонуклеоти-дов позволяет получить ампликоны размером 220 и 178 п.о. Установлены оптимальные концентрационные и темпера-турно-временные условия проведения ПЦР-РВ, определена чувствительность и эффективность анализа. Определено среднее значение эффективности реакции, равное 88 %. Установлено, что минимально выявляемое количество молекул вирусной ДНК равно 50-100 молекул на пробу при 40 циклах реакции. Отработана методика количественного определения провирусной ДНК. Описан оригинальный процесс создания серии калибровочных матричных растворов. Подтверждена пригодность методики для массового скрининга крупного рогатого скота. На наличие провируса лейкоза проанализировано 433 образца геномной ДНК КРС, выявлено 99 инфицированных животных. Установлено, что среди молодняка доля инфицированных телят более чем в 4 раза ниже по сравнению со взрослыми животными. Метод может применяться для выявления инфицированного молодняка и его выбраковки до горизонтального переноса вируса в популяции, что значительно снизит уровень виру-соносительства.

The article presents the results of developing a real-time polymerase chain reaction method for quantitative analysis of bovine leukemia provirus in animal blood and semen samples. Sets of oligonucleotide primers for Real-time PCR based on fragments of the env gene of the bovine leukemia virus have been developed. A set of primers is proposed, including three direct primers, two reverse primers, and two TaqMan-type fluorescent samples. The use of the proposed synthetic oligonucleotides makes it possible to obtain amplicons of 220 and 178 BP. The optimal concentration and temperature-time conditions for Real-time PCR were determined, and the sensitivity and efficiency of the analysis were determined. The average value of the reaction efficiency equal to 88% was determined. It was found that the minimum detectable number of viral DNA molecules is 50-100 molecules per sample at 40 reaction cycles. The method of quantitative determination of proviral DNA has been developed. The original process of creating a series of calibration tests is described.

Ключевые слова: вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ), праймеры, TaqMan-зонды, ген env, количественный анализ, оздоровление.

Key words: Bovine Leukemia virus (BLV), polymerase chain reaction in real time (Real-time PCR), primers, TaqMan probes, env gene, quantitative analysis, health improvement.

Ахмедов Роман Бахтиярович -

аспирант ИННО-центра биотехнологии и экологии ФГБОУ ВО «Брянский государственный университет им. акад. И. Г. Петровского» г. Брянск

РИНЦ SPIN-код: 2641-0531

Тел.: 8-980-308-30-29

E-mail: [email protected]

Нам Ирина Ян Гуковна -

доктор биологических наук, директор программы

научно-исследовательской лаборатории

Россиеведения, Евразийства и устойчивого развития

Северо-Западный институт управления -

филиал ФГБОУ ВО «Российская академия народного

хозяйства и государственной службы

при Президенте Российской Федерации»

г. Санкт-Петербург

РИНЦ SPIN-код: 2071-9197

Тел.: 8-921-424-85-03

E-mail: [email protected]

Akhmedov Roman Bachtiyarovich -

Postgraduate Student of INNO-center of Biotechnology and Ecology

FSBEI HE «Bryansk State University named after academician I. G. Petrovsky» Bryansk

RSCI SPIN-code: 2641-0531

Tel.: 8-980-308-30-29

E-mail: [email protected]

Nam Irina Yan Gukovna -

Doctor of Biological Sciences, Program Director

of the Research Laboratory of Russian Studies,

Eurasianism and Sustainable Development

North-West Institute of Management -

branch of FSBEI HE «Russian Presidential Academy

of National Economy and State Service of the Russian

Federation President»

Saint-Petersburg

RSCI SPIN-code: 2071-9197

Tel.: 8-921-424-85-03

E-mail: [email protected]

Е^^™!!,,,,* *>естеик АПК

ЖВ Ставрополья

научно-практическии журнал

Заякин Владимир Васильевич -

доктор биологических наук, профессор кафедры ботаники

ФГБОУ ВО «Брянский государственный университет им. акад. И. Г. Петровского» г. Брянск

РИНЦ SPIN-код: 6820-6223

Тел.: 8-919-198-25-81

E-mail: [email protected]

Zayakin Vladimir Vasiljevich -

Doctor of Biology Sciences, Professor of the Department of Botany FSBEI HE «Bryansk State University named after academician I. G. Petrovsky» Bryansk

RSCI SPIN-code: 6820-6223

Tel.: 8-919-198-25-81

E-mail: [email protected]

Лейкоз КРС - это хроническое заразное заболевание опухолевой природы, инфекционным агентом которого является вирус лейкоза КРС, или Bovine leukemia virus. Он относится к ретровиру-сам, воспроизведение которых происходит на основе провирусной ДНК, интегрированной в геном клетки-хозяина. Развитие инфекционного процесса при лейкозе коров характеризуется тремя прогрессирующими стадиями: начальной бессимптомной стадией, персистентным лимфоцитозом и лимфомой [1]. Передача ВЛКРС происходит горизонтально и вертикально, горизонтальная передача считается главным способом инфицирования. Длительный латентный период (5-8 лет) в 1-5 % случаев приводит к развитию В-лимфомы. Вирус лейкоза КРС также может инфицировать Т-лимфоциты, моноциты и гранулоциты. Количество провирусной ДНК напрямую связано с количеством инфицированных клеток. Достаточное количество вирусных белков синтезирует только незначительная часть инфицированных лимфоцитов, поэтому терминальная стадия болезни развивается редко [2]. ВЛКРС не содержит онкогенов и не интегрируется в протоонкогены.

В настоящее время для диагностики лейкоза КРС и его возбудителя применяют иммунологический, гематологический и молекулярно-гене-тические методы. Для ежегодного мониторинга распространенности лейкоза в стадах КРС применяют диагностические наборы, основанные на серологических методах РИД (радиальной иммунодиффузии) и ИФА (иммунофермент-ный анализ). К недостаткам серологических методов относятся низкая чувствительность и специфичность серологических методов, что приводит в ряде случаев к ложноположитель-ным и ложноотрицательным результатам. Кроме того, из-за колостральных антител РИД не проводят у коров на позднем этапе стельности и у телят до 6 месяцев.

Эти недостатки отсутствуют при использовании для выявления зараженных ВЛКРС животных метода ПЦР, который имеет высокую специфичность и чувствительность. Важным преимуществом этого метода является возможность выявления инфицированных новорожденных животных сразу после отела, не дожидаясь 6 месяцев, необходимых для исчезновения колостральных антител [3]. Для повышения специфичности анализа разработана технология Nested-PCR. Однако из-за этапа детекции про-

дуктов амплификации с помощью электрофореза в методике проведения ПЦР лаборатории иногда получают ложноположительные реакции, что связано с контаминацией образцов.

Вышеуказанных недостатков лишен метод ПЦР в реальном времени, имеющий высокую специфичность и чувствительность, в нем исключена контаминация образцов, и ПЦР-РВ позволяет проводить количественный анализ [4]. Существует несколько вариантов анализа в реальном времени, чаще используют ДНК-зонды в виде линейных разрушаемых проб (TaqMan). Проба представляет собой олигону-клеотид, комплементарный участку ДНК между праймерами, меченный молекулой флуоресцентного красителя (F, reporter) и гасителем флуоресценции (Q, quencher). Пока сохраняется целостность зонда, флуоресцентный сигнал минимален. Taq-полимераза обладает 5'-3'-экзонуклеазной активностью, за счет которой она, доходя до пробы, разрушает ее. При этом молекула флуорофора теряет связь с гасителем, и флуоресценция увеличивается.

На основе метода ПЦР-РВ разработано и используется несколько диагностических наборов для выявления ВЛКРС [5-7]. Недостатком многих методик является нереализованная возможность количественного обнаружения провируса.

Разработка методов ПЦР основана на знании генома анализируемого объекта. Геном ВЛКРС состоит из вирусной РНК размером 8720 п.н., которая содержит структурные гены gag, pol и env, необходимые для формирования вирусной частицы. Ген gag кодирует полипептид Pr44, являющийся предшественником трех структурных негликолизированных белков. Ген pol транслируется в виде предшественника Pr145, содержащего последовательность обратной транскриптазы. Ген env кодирует белковый предшественник Pr72 двух гликолизиро-ванных белков оболочки. Сравнение нуклеотид-ных последовательностей различных биотипов ВЛКРС по генам pol и env показало низкий уровень гетерогенности между ними [8].

Целью настоящей работы являлась разработка метода полимеразной цепной реакции в реальном времени для массового скрининга животных на вирусоносительство ВЛКРС.

В задачи исследования входили:

1. Разработка наборов праймеров для выявления провируса ВЛКРС (гена env) в ходе ПЦР в реальном времени.

2. Определение оптимальных концентрационных и температурно-временных условий проведения ПЦР-РВ.

в

естник АПК

Ставрополья

№ 4(40), 2020

Животноводство

37

3.

Определение чувствительности и эффективности анализаВЛКРС методомПЦР-РВ. Отработка методики количественного отредеееетяпромирумной ДОК вибсо-лютных величинах (копий провируса/мл юрови) .

Проведение скрининга нескольких групп животтых нм нылтчие праоидусо лейктаа. Анализ включал этапы: выделение ДНК ^ постановка ПЦР-РВ ^ анализ кривых изменения флуоресценции. Для выделения ДНК ис-

4.

5.

пользовали венозную кровь крупного рогатого скота. В ра°ате тримеыялистандартнуюмоыо-дику выделения, основанную на лизисе лейко-цилав крови ОМааствором гуанидипоиаоионата и сорбции молекул ДНК на силике. ПЦР в реальном враммнипроводили с использованием ам-плификатора «АНК-32». Для анализа применяли оииюилаоьные олтгмнрыыпеоеиды-п реПмеры.

В ходе исследования для разработки наборов праймеров для выявления ВЛКРС было изучено 22 штамма и и золята ВЛКРС (рис. 1).

Рисунок 1 - Дендрограмма генетического сходства разных штаммов и изолятов ВЛКРС

Известно, что гены pol и env имеют низкую вариабельность, но при этом ген env должен иметь большие видоспецифические отличия по сравнению с pol, поэтому для выбора праймеров проводилось сравнение последовательностей вирусного гена env. Перспективность выбора гена env для разработки метода ПЦР-РВ подтверждается также высокой гомологией между изолятами и его широкой представленностью в генетических базах данных. У гена env были определены достаточно длинные консенсусные участки (22, 17, 23 и 30 п.н.), на основе которых проводился выбор праймерных областей.

Для анализа вирусоносительства у животных ВЛКРС был разработан метод вложенной ПЦР (Nested PCR) по вирусному гену env. Для генотипирования в указанной области выбрали сайт-специфические праймеры (по З'-концу), соответствующие участку gp51 внутри env-гена. Особенностью выбранных олигонуклеотидов является относительно небольшая длина, что ускоряет процесс их амплификации и увеличивает выход продукта. Умышленно укороченная длина ампликонов сократила время элонгации и сделала диагностику более оперативной. Близкая температура плавления позволила проводить ПЦР по одному температурно-временно-му режиму для нескольких вариантов анализа.

В таблице 1 показан набор праймеров, включающий три прямых, два обратных праймера и две флуоресцентных пробы типа TaqMan.

Таблица 1 - Характеристика выбранных олигонуклеотидов

Название 5'-3'-последовательность Кол-во нкд Длина ампли-кона

env_5400_F ttc-cct-ctg-tca-gat-cat-gg 20 220

env_5620_R gga-agg-gtg-gtg-cca-tc 17

env_5441 (ROX)gc-acg-ggc-ctt-ccc-ag (RTQ2) 16

env_5442_F cac-ggg-cct-tcc-cag-a 16 178

env_5620_R gga-agg-gtg-gtg-cca-tc 17

env_5549 (FAM)ct-ccc-gga-cgc-cca-aa (RTQ1) 16

Использование указанных в таблице 1 наборов позволяет получить ампликоны размером 220 и 178 п.о.

Для разработки протокола проведения ПЦР-РВ была проведена серия амплифика-ций, работу проводили с использованием программируемого амплификатора с детекцией флуоресцентного сигнала «АНК-32». Для ре-

38

Ежеквартальный

научно-практический

журнал

В

естник АПК

Ставрополья

акции использовали немодифицированную Тар-полимеразу. В результате чего были подобраны температурные, временные и концентрационные условия анализа. Результаты ПЦР-РВ представлены на графике изменения

! I

3 □ ■

0

-> I i □

1

I

»□

' и ■

"и И

флуоресценции (рис. 2) и электрофореграмме (рис. 3).

Анализ проводился на образцах крови КРС здоровых и инфицированных животных. Положительные образцы - 643,649; отрицательный - 644.

Г Ii | Г:»| ГИ9[ Гд| г 21 I Г»\

г »I

Г1й[ Г«[ п.";| rsi| Г»[ гзо| Г«[

.......г......т..................... ......................i...... /

РВ-ПЦР с «iv 5400 .......Г......7......Т............... ......................Г......

.......

ОАО "Железнодорожник" Карачевский район ...............>......

15.i92.li4 . 649/;

.......■■/■'■......j.......

.......г......т......*................

1 i [ : :

.......J.......;.......:.......;.......1....... .......1......1......•............../ •..............643 ;

.......j......j.......;........./ ..................

.......\...............i.......

.....;......:......Г /.....

.......-:.......:.......:.......:.......г.....г..................:....... .......1......!-'/:............... ■/■.............r......t.......v......'.......

.....Г.......Г/'":..........."7 .......г.......У..............."/"

.......R-ye.......V.....>4..... ..............• ..-".........

2 4 6 S 10 и Н 1! 10 И 22 24 В В 30 К 31 38 К 40 4! 44 46

Тиеунок2 - Груфикизмененияфлуоресценуии в ходе; ПЦР, используемые олигонуклеотиды

env_5400_F, env_5620_R, env_5441

ПЦР-РВ

ОАО «Железодорожник» Карачевский район 24.06.14

М27

Таблица 2 - Компоненты реакционной смеси

env 5400

o.K. 649 708

env 5442

o.k. 649 708

Рисунок 3 - Электрофореграмма продуктов ПЦР-РВ.

Положительные образцы по первому варианту анализа - 649, 708.

Положительныеобразцы по второму варианту анализа - 649, 708

Анализ показал, что олигонуклеотиды и подобранные условия амплификации пригодны для выявления ВЛКРС, о чем свидетельствует логарифмическое увеличение флуоресценции, наблюдаемое в пробирках с вирусной ДНК, и наличие ампликонов необходимой длины. Протоколы проведения ПЦР-РВ, идентичные для двух наборов олигонуклеотидов, содер-жатсявтаблицах2,3.

Реактив Объем

Вода 5,05 мкл

Буферконцентрат 10х 2 мкл

Магния хлорид 50 mM 2 мкл

dNTP смесь (2 mM/ml) 2 мкл

Праймер прямой (100 пмоль/мкл) 0,25 мкл

Праймер обратный (100 пмоль/мкл) 0,25 мкл

Линейная проба (100 пмоль/мкл) 0,25 мкл

Taq-полимераза (5000 u/ml) 0,2 мкл

ДНК животного 8 мкл

Таблица 3 - Циклический режим ПЦР

Стадия Темп, °С Время, сек Циклы

Первич. денатурация ДНК 94 240

Денатурация ДНК 94 15 40

Отжиг праймеров 68 15

Синтезцепи 72 15

Для проведения количественного ПЦР-анализа ВЛКРС необходимо иметь калибровочные растворы с известной концентрацией матричной ДНК. По результатам ПЦР-РВ можно построить калибровочный график для установления концентрации провирусависследуемыхобразцах.

в

естник АПК

Ставрополья

№ 4(40), 2020

Животноводство

39

Для получения калибровочных растворов точной концентрации для количественного анализа проводили амплификацию с праймером епа_5620_а, на 5'-конец которого быта введена молекула флуорофора (краситель FAM). После скнтека ПОО-лредукт алектрофолееисрнки очл-щали и проводили флуорометрическое опреде-

ление его концентрации. На основе полученной ДНК-матрицы с известной концентрацией приготовили калибровочные растворы, которые ис-кроьоороли в рачевтаа 0цО-мааррцы (рис:. 4(с В ходе амплификации определяли значения по-роговаго цнкла, на основе которых был построен график скорости амплификации (рис. 5).

1ЕЕ

1ЕО

5

■Р5—1 Про |

» I I

■Ро—I

I

□И

и ИшГ|Г

'зПгИЖ

"ПЁЮЕ

■епс

Все |

г ВИР г

г

г шёЕ

г

г |РГ

Гг ВРГ

г г

г []ВГ Г 1ЕЕ

г иё: г пее

г 0[]г

2 < 6 8 10 II 1« 16 18 Я 22 2* Я 28 30 32 31 36 38 «0 42 *«

Рисунок 4 - График изменения флуоресценции в ходе ПЦР

Рисунок5 - Графикскоростиполимеразнойцепной реакции

По данным графика было определено среднее значение эффективности реакции, равное 88 %. Установлено, что минимально выявляемое количество молекул вирусной ДНК равно 50-100 молекул на пробу при 40 циклах реакции. График может использоваться как калибровочный для определения концентрации провирусной ДНКвабсолютныхвеличинах.

С целью подтверждения возможности использования методики ПЦР-РВ для массового скрининга было проанализировано 433 образца геномной ДНК животных разных возрастных групп с различным статусом по ВЛКРС и лейкозу, результатыпредставленывтаблице 4.

Полученные данные свидетельствуют о широком распространении ВЛКРС. Причем среди молодняка доля инфицированных животных

значительно ниже. Среди РИД+ скота только у половины обнаружен провирус лейкоза, что говорит либо об устойчивости животных к пер-систенции вируса в периферической крови, либо о сниженной специфичности реакции им-мунопреципитации.

1. Разработаны и синтезированы олигону-клеотиды для выявления провируса бычьего лейкоза (участка гена белка оболочки патогена) входе ПЦР в реальном времени. Установлены оптимальные концентрационные и темпера-турно-временные условия проведения ПЦР-РВ.

2. Определена чувствительность и эффективность ПЦР-анализа. Отработана техника количественного определения провирусной ДНК в абсолютных величинах (копий провируса/мл крови).

*>естеик АПК

ЖВ Ставрополья

научно-практическии журнал

Таблица 4 - Данные распространения вируса лейкоза КРС

Хозяйство Количество животных Количество вирусоносителей Процент вирусоносителей

Взрослый скот

ОАО «Железнодорожник», Карачевский р-н 90 3 3,3

ОАО «Гетманобудский», Новозыбковский р-н 50 18 36,0

Черно-пестрая порода, Республика Казахстан 49 13 26,5

Телята до 6 месяцев

ОАО «Гетманобудский», Новозыбковский район 25 2 8,0

ООО «Орловское», Жуковский район 70 4 5,7

ООО «Колхозник», Погарский район 50 - 0

РИД+ животные

ОАО «Бежицкое», Брянский район 85 45 52,9

Животные с гем. проявлениями лейкоза

ООО «Гетуновка», Погарский район 14 14 100

3. На наличие провируса лейкоза проанализировано 433 образца геномной ДНК КРС, выявлено 99 инфицированных животных.

Установлено, что среди молодняка доля инфицированных телят более чем в 4 раза ниже по сравнению со взрослыми животными.

Литература

1. Mechanisms of pathogenesis induced by bovine leukemia virus as a model for human T-cell leukemia virus / Y. Aida, H. Murakami, M. Takahashi, S. Takeshima // Front Microbiol. 2013. Vol. 4. P. 328-345.

2. Mechanisms of leukemogenesis induced by bovine leukemia virus: prospects for novel anti-retroviral therapies in human / N. Gillet, A. Florins, M. Boxus, C. Burteau, A. Nigro, F. Vandermeers // Retrovirology. 2007. Vol. 4. P. 1810-1186.

3. Detection and genotyping of bovine leukemia virus in Mexican cattle / N. Heinecke, J. Tortora, H. A. Martinez, V. D. Gonzalez-Fernandez, H. Ramirez // Arch Virol. 2017. Vol. 8. P. 269-276.

4. VanGuilder H. D., Vrana K. E., Freeman W. M. Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis // Biotechniques. 2008. Vol. 44. P. 619-626.

5. BLV-CoCoMo-qPCR: a useful tool for evaluating bovine leukemia virus infection status / M. Jimba, S. N. Takeshima, H. Murakami, J. Kohara, N. Kobayashi, T. Matsuhashi // BMC Vet. Res. 2012. Vol. 8. Р. 1671-1686.

6. BLV-CoCoMo-qPCR: Quantitation of bovine leukemia virus proviral load using the CoCoMo algorithm / M. Jimba, S. N. Takeshima, K. Matoba, D. Endoh, Y. Aida // Retrovirology. 2010. Vol. 2, № 7. P. 91-99.

7. Detection of bovine leukemia virus in blood and milk by nested and realtime polymerase chain reactions / G. C. Kuckleburg, C. C. Chase, E. A. Nelson, S. A. Marras, M. A. Dammen, J. Christopher Hennings // J. Vet. Diagn. Invest. 2003. Vol. 15, № 1. P. 72-76.

References

1. Mechanisms of pathogenesis induced by bovine leukemia virus as a model for human T-cell leukemia virus / Y. Aida, H. Murakami, M. Takahashi, S. Takeshima // Front Microbiol. 2013. Vol. 4. P. 328-345.

2. Mechanisms of leukemogenesis induced by bovine leukemia virus: prospects for novel anti-retroviral therapies in human / N. Gillet, A. Florins, M. Boxus, C. Burteau, A. Nigro, F. Vandermeers // Retrovirology. 2007. Vol. 4. P. 1810-1186.

3. Detection and genotyping of bovine leukemia virus in Mexican cattle / N. Heinecke, J. Tortora, H. A. Martinez, V. D. Gonzalez-Fernandez, H. Ramirez // Arch Virol. 2017. Vol. 8. P. 269-276.

4. VanGuilder H. D., Vrana K. E., Freeman W. M. Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis // Biotechniques. 2008. Vol. 44. P. 619-626.

5. BLV-CoCoMo-qPCR: a useful tool for evaluating bovine leukemia virus infection status / M. Jimba, S. N. Takeshima, H. Murakami, J. Kohara, N. Kobayashi, T. Matsuhashi // BMC Vet. Res. 2012. Vol. 8. P. 1671-1686.

6. BLV-CoCoMo-qPCR: Quantitation of bovine leukemia virus proviral load using the CoCoMo algorithm / M. Jimba, S. N. Takeshima, K. Matoba, D. Endoh, Y. Aida // Retrovirology. 2010. Vol. 2, № 7. P. 91-99.

7. Detection of bovine leukemia virus in blood and milk by nested and realtime polymerase chain reactions / G. C. Kuckleburg, C. C. Chase, E. A. Nelson, S. A. Marras, M. A. Dammen, J. Christopher Hennings // J. Vet. Diagn. Invest. 2003. Vol. 15, № 1. P. 72-76.

B

t'cniiiK ABK , CTaiipuiioii.H ________mueomHoeoacmeo

№ 4(40), 2020

41

8. Molecular characterization of the env 8. Molecular characterization of the env

gene from Brazilian field isolates of bovine gene from Brazilian field isolates of bovine

leukemia virus / M. F. Camargos, A. Pereda, leukemia virus / M. F. Camargos, A. Pereda,

D. Stancek, M. A. Rocha, J. K. dos Reis I. D. Stancek, M. A. Rocha, J. K. dos Reis I.

Greiser-Wilke, R. C. Leite // Virus. Genes. Greiser-Wilke, R. C. Leite // Virus. Genes.

2006. Vol. 34. P. 343-350. 2006. Vol. 34. P. 343-350.