CC BY
5
Научная статья
УДК 619:616.98:578.828.11
https://dol.org/10.31016/1998-8435-2022-16-3-282-295
генетический анализ изолятов ВлкРс у перинатально инфицированного крупного рогатого скота в молодом возрасте
наталия Геннадиевна козырева 1, Илья Юрьевич Абашин 2, Людмила Александровна Иванова 3
1-3 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр -Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К. И. Скрябина и Я. Р. Коваленко Российской академии наук» (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН), Москва, Россия
1 nk07-73@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-4318-8173
2 nk07-73@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-3623-1623
3 nk07-73@mail.ru
Цель исследований - в динамике выявления случаев перинатального заражения оценить количество, генетический статус провирусов лейкоза крупного рогатого скота, выделенных от молодых животных, и корреляционные связи между некоторыми показателями проявления инфекционного процесса на основе методов генодиагностики. Материалы и методы. Использовали материал от крупного рогатого скота различных возрастных групп: 1 - телята (30-40 минут после рождения до приема молозива и от 15 до 45 сут); 2 - нетели (не старше двух лет). Применяли методы радиальной иммунодиффузии (РИД), полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ), филогенетический анализ.
Результаты и обсуждение. Приведена оценка случаев перинатального заражения молодняка крупного рогатого скота. Частота выявления случаев инфицирования составила у телят 4,15% (ПЦР-РВ) и 1,09% (РИД); у нетелей - 1,1% (ПЦР-РВ) и 0,88% (РИД). В положительной динамике (2013-2022 гг.) обнаружено снижение в 36 раз случаев инфицирования с 14,5 до 0,4%, при этом, проходя через 0% (2020 г.) и находясь на уровне 0% (2022 г.). Диапазон провирус-ной нагрузки в крови обследованных животных составил 2,02 х 104 - 8,38 х 106 ГЭ/мл. Показана принадлежность выделенных изолятов ВЛКРС к двум генотипам GIV и GVII (env) и кладу 1 (pol). Оценено завышение числа провирусов в три раза у особей до двух лет (3,83 х 106 ГЭ/мл) относительно таковой у месячных телят (1,3 х 106 ГЭ/мл) и в 9 раз для GIVотносительно GVII. Проработка генодиагностических алгоритмов важна для повышения эффективности профилактических инструментов по предотвращению распространения данной ретровирусной инфекции на ранних сроках у молодых животных, что подтверждено снижением до 0% случаев выявления ретровирусной инфекции у молодых животных в динамике. Число провируса было выше у нетелей, чем у телят; у повторнородящих молочных коров уровень провирусной нагрузки выше, чем у не рожавших особей и количественные показатели в крови животных с генотипом GIVбыли выше относительно таковых с GVII генетическим вариантом ВЛКРС. Ключевые слова: лейкоз, ВЛКРС, крупный рогатый скот, перинатальное инфицирование, филогенетический анализ, генетический полиморфизм, противолейкозные оздоровительные мероприятия
Благодарность. Работа выполнена в рамках государственного задания в соответствии с утвержденным планом НИР ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН на 2022 год.
Прозрачность финансовой деятельности: в представленных материалах или методах авторы не имеют финансовой заинтересованности. Конфликт интересов отсутствует
Для цитирования: Козырева Н. Г., Абашин И. Ю., Иванова Л. А. Генетический анализ изолятов ВЛКРС у перинатально инфицированного крупного рогатого скота в молодом возрасте // Российский паразитологический журнал. 2022. Т. 16. № 3. С. 282-295.
https://doi.org/10.31016/1998-8435-2022-16-3-282-295
Аннотация
© Козырева Н. Г., Абашин И. Ю., Иванова Л. А., 2022
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License. The content is available under Creative Commons Attribution 4.0 License.
Original article
Bovine Leukemia Virus (BLV) isolates genetic analysis in perinatally infected cattle at young age
Natalia G. Kozyreva 1, Iliya Yu. Abashin 2, Lyudmila A. Ivanova 3
1-3 Federal State Budget Scientific Institution "Federal Scientific Centre VIEV", Moscow, Russia
1 nk07-73@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-4318-8173
2 nk07-73@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-3623-1623
3 nk07-73@mail.ru
Abstract
The purpose of the research is to identify perinatal infection in the dynamics, and assess the number and genetic status of bovine leukemia proviruses isolated from young animals, and correlations between some indicators of the infectious process based on gene diagnostics methods.
Materials and methods. We used the material from cattle of different age groups: 1, calves (30-40 minutes after birth before colostrum and 15 to 45 days); and 2, heifers (not older than two years). Radial immunodiffusion (RID), real-time polymerase chain reaction (PCR), and phylogenetic analysis were used.
Results and discussion. An assessment is given for perinatal infection of the young cattle. The detection rate of the infection in the calves was 4.15% (PCR) and 1.09% (RID); and 1.1% (PCR) and 0.88% (RID) in the heifers. A 36-fold decrease of the infection was found in positive dynamics (2013-2022) from 14.5 to 0.4% with passing through 0% (2020) and being at the level of 0% (2022). The proviral load ranged from 2.02 x 104 to 8.38 x 106 GE/mL in the blood of the examined animals. The BLV isolates obtained were shown to belong to two genotypes, GIVand GVII (env), and clade 1 (pol). We assessed an overestimation of the number of the proviruses by a factor of three in the animals under two years of age (3.83 x 106 GE/mL) relative to that in the 1-month-old calves (1.3 x 106 GE/mL), and by a factor of nine for GIV relative to GVII. It is important to develop gene diagnostics algorithms to increase the effectiveness of routine tools to prevent the spread of this retrovirus infection in young animals at an early stage, which is confirmed by a decrease to 0% of detected retrovirus infection in young animals over time. The provirus number was higher in the heifers than the calves; the proviral load level was higher in the multiparous dairy cows than the nulliparous animals, and quantitative indicators were higher in the animals' blood with the GIV genotype relative to those with the GVII genetic variant of the BLV.
Keywords: leukemia, BLV, cattle, perinatal infection, phylogenetic analysis, genetic polymorphism, anti-leukemic health precautions
Acknowledgements. The study was conducted within the State Task as provided by the approved Research Work Plan of the FSC VIEV for 2022.
Financial transparency: none of the authors has financial interest in the submitted materials or methods. There is no conflict of interests
For citation: Kozyreva N. G., Abashin I. Yu., Ivanova L. A. Bovine Leukemia Virus (BLV) isolates genetic analysis in perinatally infected cattle at young age. Rossiyskiy parazitologicheskiy zhurnal = Russian Journal of Parasitology. 2022;16(3):282-295. (In Russ.).
https://doi.org/10.31016/1998-8435-2022-16-3-282-295
© Kozyreva N. G., Abashin I. Yu., Ivanova L. A., 2022
Введение
Вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) является представителем дельтаре-тровирусов семейства Ке^оушёае и индуцирует злокачественное лимфопролифератив-ное заболевание - энзоотический лейкоз [19]. Лейкоз крупного рогатого скота, как латентная ретровирусная инфекция сельскохозяй-
ственных животных, наносит экономический ущерб животноводческой отрасли, и является одной из наиболее важных проблем ветеринарной медицины.
В хозяйствах с высоким уровнем инфици-рованности выращивание свободного от вируса молодняка с заменой им в дальнейшем маточного поголовья - основное направление
работы по формированию здорового поголовья в рамках осуществления оздоровительных мероприятий, где ведущее место принадлежит диагностике. Применение серологических методов диагностики усложняет задачу своевременной постановки диагноза из-за присутствия в организме телят колостральных антител, приобретенных от матерей. Таким образом, на данном этапе онтогенеза крупного рогатого скота (телята в возрасте 0-6 мес.) прямая диагностика инфекции становится наиболее эффективной и приводит к сокращению сроков противолейкозных мероприятий.
Кровь, все секреты и экскреты с наличием в них лимфоцитов, зараженных ВЛКРС, представляют собой факторы передачи патогена восприимчивому крупному рогатому скоту [1].
При вертикальной передаче инфицирование ВЛ осуществляется в перинатальном периоде, в котором передача лейкозной инфекции от матери к новорожденному проистекает следующими путями: а) гематогенным - трансплацентарно при преодолении ретро-вирусом плацентарного барьера, б) контактным - при родах, посредством заглатывания инфицированной крови или амниотической жидкости, в) алиментарным - после родов через материнское молоко.
По литературным данным, внутриутробное заражение в естественных условиях у новорожденных телят до приема молозива составляет от 4 до 18% [8, 25, 28]. Показана независимость естественного внутриутробного инфицирования ВЛКРС от породы [28], возраста матерей, паритета самок (числа родов) и времени наличия этой инфекции у матерей [9], но выявлена связь с материнским лимфоцитозом [8, 25], злокачественной лимфомой [25] и материнской вирусной нагрузкой [28]. Экспериментальное заражение коров во время беременности подтверждено выявлением серопозитивных телят при рождении, что указывает на их внутриутробное инфицирование [39]. Предположительно плацентарная и пуповинная кровь могут быть путями вертикальной передачи ВЛКРС при наличии провируса в плацентарной и пу-повинной крови, но не в амниотической жидкости [34]. При исследовании частоты перинатальной инфекции ВЛКРС в полевых условиях в Японии обнаружено 7,7% телят, рожденных от инфицированных коров с инфицированием в родовых путях, а 10,8% - в утробе [28, 32].
Как для ВЛКРС, так и для представляющих значительную опасность Т-лимфотропных вирусов приматов, существует проблема передачи ретровирусов потомству с молоком от инфицированных матерей [10]. Принимая во внимание сходство биологических свойств этих вирусов, можно ожидать, что способ и механизмы их передачи имеют много общего [2].
Выпаивание материнским молоком увеличивает риск инфицирования новорожденного. При анализе данных о роли молока как фактора передачи ВЛКРС показано, что в естественных условиях заражение телят вирусом лейкоза при этом происходит весьма редко [1]. Однако, при наличии ретровирус-ной инфекции у коров-матерей вероятность инфицирования через молоко значительно повышается посредством контаминирования кровью, например, в случае заболевания ко-ровы-вирусоносителя маститом [11].
Как по литературным данным, так и по результатам собственных исследований, описано наличие провируса/инфекционного вируса и в молоке, и в молозиве от большинства инфицированных коров [2, 18], которые являются источниками инфекции для новорожденных телят. С другой стороны, и молоко, и молозиво также могут содержать специфические антитела к ВЛКРС [18].
Потенциальные защитная или инфекционная роли/функции молозива и молока при естественной передаче ВЛКРС пока еще до конца не выяснены и в настоящее время являются предметом многочисленных исследований, которые предполагают полярные выводы/гипотезы [13, 15, 24, 39]. При изучении количественных показателей установлено, с одной стороны, что присутствие провируса в молозиве достоверно коррелирует с прови-русной нагрузкой (ПН) в крови [17]; с другой стороны, в образцах молозива ПН ниже, чем в образцах периферической крови [2, 4, 32].
По статистике, в среднем, у инфицированных коров рождается 3-5% (собственные наблюдения), около 10% [32] инфицированного потомства. Увеличение частоты перинатальной передачи может достигать практически до 30% в случаях присутствия отягчающих условий (например, факторов патогенности микроорганизмов, нарушающих плацентарный барьер или контаминации кормов плесневыми грибами).
Известно, что путь передачи ретровируса во время родов является основным в вертикальной трансмиссии. Например, для ВИЧ-инфекции это составляет 60-75% случаев. В связи с этим, предполагается, что передача вируса произошла на интранатальном этапе (во время родов) при условии выявления на 7-90-е сутки жизни инфекции и отсутствии грудного вскармливания [6].
Так, в случае лентивирусов (ВИЧ) трансплацентарный путь внутриутробного заражения является ключевым механизмом передачи инфекции и вторым по эффективности заражения относительно гемотрансфузии. Проанализированы патологические изменения в ворсинчатом хорионе, нарушающие защитную функцию плаценты как плацентарного барьера, препятствующего инфицированию плода. При дефектах плаценты (в частности, синци-тиотрофобласта), способствующих проникновению вируса в кровоток плода, частота передачи ВИЧ плоду увеличивается на последнем месяце беременности. В процессах регуляции межклеточного слияния элементов цитотро-фобласта и формировании синцитиотрофо-бласта в плаценте человека на клеточном уровне участвуют гены эндогенных ретровирусов (в частности, лентивирусов) человека (human endogenous retroviruses - HERVs) как рудимент возбудителей ретровирусных инфекций, закрепившихся в зародышевой ДНК. Например, синцитин-1 (ERVWE1 - endogenous retroviral family W, Env(C7), memberl) в случае обладания феноменом рецепторной интерференции обеспечивает защиту клеток хозяина от экзогенных ретровирусов и может регулировать тропизм ВИЧ-1 к CD4 негативным клеткам через взаимодействие с рецепторами hASCTl/ hASCT2 [6].
Также известно, род дельтаретровирусов представлен, помимо Т-лимфотропных вирусов приматов (PTLV) (в том числе, человека (HTLV) и ВЛКРС (BLV)), эндогенными ретро-вирусами (endogenous retroviruses, ERVs) [19].
При изучении вертикальной трансмиссии в эксперименте частота выявления (скорость распространения) случаев ретровирусной инфекции у последующего поколения мышей, чьи матери были заражены мышиным ретровиру-сом ts1 (возраст матерей, в котором они получили инокуляцию/инъекцию вирусом 5 сут или 48 ч), составила 2,9 и 25% соответственно [12].
У беременных женщин с условием профилактического лечения и также при кесаревом сечении частота заражения ВИЧ-инфекцией при перинатальной передаче снижается до 5-8% [6]. Однако, риск ее все же остается высоким, что диктует необходимость дальнейшего совершенствования организации системы медико-социальной помощи для данной категории населения с разработкой дополнительных мер по снижению трансмиссии ВИЧ-инфекции, смертности и предупреждению мертворождае-мости в перинатальном периоде [7].
В связи с этим, проработка эффективных диагностических алгоритмов профилактики ретровирусной инфекции с применением новых технологий геномного анализа у молодняка крупного рогатого скота на ранних стадиях данного заболевания положено в основу наших исследований.
Цель работы - оценить количество (про-вирусную нагрузку), генетический статус про-вирусов лейкоза крупного рогатого скота, выделенных от молодых животных в динамике выявления случаев перинатального заражения, и также корреляционные связи между некоторыми показателями/переменными (ПН, генетический статус, возрастная группа) на основе методов генодиагностики.
Материалы и методы
Нами использован материал от крупного рогатого скота из обследуемого хозяйства в возрасте: 0,5 ч (в течение 30-40 мин. после рождения до приема молозива); от 15 до 45 сут (телята) - группа 1; не старше двух лет (нетели) - группа 2.
Методом радиальной иммунодиффузии (РИД) проанализированы пробы сыворотки крови, полученные от новорожденных телят до приема молозива. Методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) исследованы пробы крови от тех же телят в возрасте до двух месяцев. Данная группа животных после рождения находилась на вскармливании молоком от здоровых коров. Материал от тех же животных в возрасте до двух лет исследовали методами РИД и ПЦР. Испытывали пробы крови и сыворотки, полученные от телок в возрасте до двух лет из группы здоровых животных, сформированной по результатам исследований тех же животных в возрасте 1-2 мес. Таким образом,
максимальный интервал между обследованиями методом ПЦР достигал 2 года, т. е. работу проводили в отрицательном поле при наличии у данных животных отрицательного серологического статуса.
Всего методом ПЦР обследовано 2833 телят и 1597 нетелей.
Все этапы подготовки растворов и реагентов для проведения анализа, а также непосредственно процедуру проведения анализа выполняли в соответствии с инструкциями к соответствующим комплектам реагентов.
Экстракцию геномной ДНК проводили любым методом, позволяющим получить нуклеиновую кислоту (НК), пригодную для амплификации в ПЦР. С этой целью использовали коммерческие наборы реагентов для выделения нуклеиновых кислот: «Рибо-преп» (метод преципитации НК спиртом), «ДНК-сорб-В» (метод сорбции НК на носитель), (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва). ДНК экстрагировали из 100 мкл цельной крови, на конечном этапе элюировали ДНК в 50 мкл буфера для элюции. Процедура выделения НК, при этом, сопровождалась отрицательным контролем экстракции (ОКО) при использовании в качестве пробы бидистиллированной воды или физиологического раствора в объеме 100 мкл.
Метод мультиплексной ПЦР-РВ с использованием разработки ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН - тест-системы «ВЛКРС мультиплекс» применяли для выявления ДНК провируса вируса лейкоза крупного рогатого скота [3, 5]. Количественный вариант ПЦР (кПЦР) - с использованием генно-инженерной конструкции - плазмиды рБЬУро1 с известной концентрацией (разработка ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН).
В качестве референсного использовали набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота - выявления антител против гликопротеидного антигена ВЛКРС в РИД в геле агара («БИОК», ФГУП Курская биофабрика, Россия) как «золотого стандарта» диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Серологическим методом исследовали пробы сывороток от новорожденных животных до приема молозива и молодых телок (нетелей).
Идентификацию целевых фрагментов для последующего определения первичной нукле-
отидной последовательности проводили методом ПЦР с электрофоретической детекцией в следующих вариантах: классической одно-раундовой ПЦР с получением ампликонов размером 438 п.о. (pol); «гнездовой» (''nested'') ПЦР с получением ампликонов размером 341 п.о. (env).
Непосредственно секвенирование проводили на автоматическом анализаторе Beckman Coulter в соответствии с рекомендациями производителя. Первичные нуклеотидные последовательности, полученные в результате секвенирования, идентифицировали в банке данных GenBank с помощью сервиса BLAST ресурса NCBI. Для сравнения использовали референсные нуклеотидные последовательности локусов генов pol, env международных и российских изолятов ВЛКРС, представленные в базах данных (БД) GenBank, ВИЭВ.
Эволюционный анализ локусов генов (pol - приблизительно 400 нуклеотидов; env - приблизительно 300 нуклеотидов) выполняли с помощью программы Mega v.6. Дендрограммы построены дистанционными методами минимума эволюции (ME) [33], присоединения соседей (NJ) [35] с определением p-дистанций. Статистическую достоверность топологии деревьев оценивали с помощью метода бутстрэп-анализа при 1000 итерациях. Эволюционные дистанции рассчитывали с использованием моделей Кимуры [22], Таджима и Неи [38].
Результаты и обсуждение
За 2013-2022 гг. обследован молодняк методом ПЦР по выявлению ДНК ВЛКРС у молодых животных (телок) в динамике. Частота случаев обнаружения ДНК ВЛКРС составила от 14,5 (2013 г.) до 0,4% (2021 г.); при этом показатели инфицированности были снижены в 36 раз, проходя через 0% (2020 г.) и находясь на уровне 0% в текущем периоде, что свидетельствует о положительной динамике развития ситуации (рис. 1).
При проведении эксперимента в хозяйстве отлучали новорожденных телят от инфицированных матерей сразу же после рождения (не допускали контакта с ними) и выпаивали молоком от здоровых особей. Ранее нами была показана опасность нативного молока, обладающего инфекционными свойствами [2].
При сравнении чувствительности методов ПЦР-РВ и РИД в 1373 случаях для телят 1-й
Z013 2014 201S 201S »17 201В ZQ1& 202U 20Ы1 2022
период и■ блюденhr, гад
_ _ .. у
Рис. 1. Динамика выявления случаев ВЛКРС у телок [Fig. 1. Dynamics of detection of cases of BLV infection in heifers]
группы животные распределились следующим образом: ПЦР+/РИД+ - 1,09% (15/1373), ПЦР+/РИД- - 3,06% (42/1373), ПЦР-/РИД+ - не выявлено, ПЦР-/РИД- - 95,85% (1316/1373). Во 2-й группе нетелей в 1364 случаях распределение животных представлено следующими вариантами: ПЦР+/РИД+ - 0,88% (12/1364), ПЦР+/РИД- - 0,22% (3/1364), ПЦР-/РИД+ -не выявлено (0/1364), ПЦР-/РИД- - 98,90% (1349/1364). При этом уровень вирусоноси-тельства у телят составил 4,15% (ПЦР-РВ) и 1,09% (РИД); у нетелей - 1,1% (ПЦР-РВ) и 0,88% (РИД). В результате испытания диагностической чувствительности вышеуказанных методик обнаружено завышение таковой в пользу ПЦР-РВ - в 3,8 (1-я группа) и 1,25 (2-я группа) раз относительно РИД.
На данном этапе определены первичная нуклеотидная последовательность, количества провируса; проведен филогенетический анализ 22 образцов провирусной ДНК изоля-тов ВЛКРС; установлен их генетический статус. Среди данных исследуемых изолятов 14 образцов ДНК анализировали по локусу pol и 19 - по локусу env ВЛКРС (рис. 2, 3).
На основе анализа локуса гена pol выявлено, что общая тенденция по БД сохраняется - анализируемые российские изоляты (14/14, 100%) сгруппировались с изолятом M16017 (USA) - клад 1 (рис. 2, Б). Относительно международного штамма -M16017_(USA) - эволюционные расстояния составляли, в среднем, 0,012. Диапазон эволюционных расстояний представлен следующим образом: минимальная дистанция
составила 0,007 (5/14, 35,7% изолятов), максимальная - 0,037 (2/14, 14,3% изолятов). Определены внутригрупповые средние эволюционные дистанции среди исследуемых изолятов и референс-последовательностей для клада 1 - проанализированная степень внутригрупповой дивергенции, в среднем, составила 0,018±0,002 (1,8±0,2%).
Филогенетический анализ на основе гена env позволил оценить гетерогенность исследуемой группы, включающей 19 изолятов ВЛКРС (рис. 3).
Для положительного контрольного образца K+ (штамм FLK BLV) подтверждено его отношение к GI.
У большинства анализируемых изолятов (13/19, 68,4%) обнаружена принадлежность к IV генетическому варианту ВЛКРС (рис. 3, А). Степень дивергенции внутри GIV между исследуемыми изолятами и международными референс штаммами, в среднем, составляет 1,8±0,5% (0,018±0,005) в диапазоне средних значений эволюционных расстояний от 0,008 до 0,038.
Часть изолятов (6/19, 31,6%) сгруппировалась с VII генотипом изучаемого патогена (рис. 3, Б). Данные исследуемые представители ВЛКРС идентичны между собой (0,000; 100%); находятся на минимальном расстоянии (0,006) от международных AY515274 Chile, AY515276 Chile, AY515280 Chile и российского HM563749 штаммов; максимально удалены от польского изолята EU262555 Poland. Степень дивергенции внутри GVII, в среднем, составила
Л*™«»
I
lirw«
IMflUinn 1ГИ к Jf IflUi-V irfounm
A S 'ta кЛмЭИат (лишит ипеигшш
1НИШНП J'RK!?.. - A 11 *Я К JiKWiS* IJ-BT^*,
цшишш
l«MUIUOH ^EUmdUHUI
I" ЩШЯСШ
jioiniw nit
JlijU'W -Г 1
Tfl-1 № WW
W
( aair t^;-«•'tcatHi^u*
»« №Ыч
ННиЫ
плтичк*]
.WH I П
Wife**
-jiWI^IW
k1-V
j.^'l'l tfbam* И—
*lj№t«
£ 3 l^j
у
«1 jetit-в »44»
I£hw. .им);*
lltn<Hlt utmi-M <4H№
клад I
клал? кгмд J
к/huti
j.a =s>I«««■■■ ¿а- нашит
¡жтгкчкол «¡i in; «is bat
_д ин HindKSi
_lltHHU uCKStr
_A и инярщ i is*;
«Wl» АЭ*Н«ПНМЛС0«
iSi I»» K4lHa;s*
а:' №>иишн
lUMHEUtHH
тпниш
ii?H»4 «ни
tsw: «ни
omvM
иивмиглик!
ii и ■ к- KHV
П HtJMf дошшц
. iHHtta^
-SKtms «т.
iLf
•Hi
А
Б
Рис. 2. Филогенетическое сравнение участков гена pol провирусов ВЛКРС (дистанционный метод максимума правдоподобия, двупараметрическая модель Кимуры, бутстреп-анализ при 1000 случайных выборках, массив данных - 48 последовательностей): А - собственно древо с представителями провирусов ВЛКРС; Б - ветвь (фрагмент) древа с представителями клада 1. Красным символом Л обозначены исследуемые изоляты, черным □ - изолят К + FLK-BLV [Fig. 2. Phylogenetic comparison of the pol gene regions of BLV proviruses. The tree was constructed using the remote maximum likelihood method, using two-parameter Kimura model, bootstrap analysis with 1000 random samples, and the data array consists of 48 subsequences: A - the tree itself with representatives of BLV proviruses; B - branch (fragment) of the tree with representatives of clade 1. The red symbol Л denotes the studied isolates, the black symbol □ denotes the K + FLK-BLV isolate]
1,1±0,5% (0,011±0,005) в диапазоне значений эволюционных расстояний от 0,006 до 0,022.
У 13 из обследованных животных проведена оценка ПН, диапазон которой составил
2.02 х 104 - 8,38 х 106 ГЭ/мл. По возрастным группам количество провируса распределилось следующим образом: у месячных телят (6/13, 46%) эти значения, в среднем, составили
1.3 х 106 ГЭ/мл, у животных до 2-х лет (7/13, 54%) - 3,83 х 106 ГЭ/мл.
При этом, в процессе анализа генетического статуса (всего исследовано 11 из 13 животных) у 6 телят выявлено наличие двух генотипов вируса СУП (3/11, 27,3% изолятов) и аУ (3/11, 27,3% изолятов) - гетерогенная популяция патогена; у 5 нетелей обнаружена гомогенная популяция вируса с наличием 1У-го генетического варианта (5/11, 45,4% изолятов). Уровень ПН для животных с тем или иным генотипом ВЛКРС отличается приблизительно в 9 раз (88%) между собой и, в среднем,
.ноадтчвшис«
iPtJUMQIV*
ИЧиМПМ
EUJSH«ft4»MCUV» ЮЯ51 felp-mOU
^KJTTilWd CWB ИКИРЛВАя! CWB WKH^rSSAni 6WB FwH CIYB
-Aim Mi *JU4 MOSCOW
- л йшиое Moscow
. A itlS.lDKJUlI MOSCOW • A JmS'lilWl MOSCOW
- а moscow - а гмножиг moscow *91flUlWli«C0W ---a slia) KJUl moscow
w
i Sli l t li KUi uftsi(JW
A
1 ?1HW1KU! UMffiW 1 ilrliiSKU! UMffiW 1 flST-WKU! UMffiW 1 ilSHIKU! 1 iinwiKU! UMffiW
1 ili-ii KUJUOKOW AYSIiiTlihltWn AYSIMTfChltiVl
AYjlSiJOChlteUl
HUSHJ51 UeiintCWiH HUSHIHJ l*l(in(0Tfl&
ansiwnq
HIUDHUeWji JJ1 ШягьЯ Роит G YI С
KfW I4M MiUm S ¥1 i KJ И ИМ №Им й Vlt KFM НИ MiMm G VI Ё I №№,1В Vlt
KFMnHkWbHGVlO Kl ИIJH G 410
' KJ И МЫ IftftM G MID Kl HUSr bbUna GviO
Б
Рис. 3. Филогенетическое сравнение участков гена env провирусов ВЛКРС: А - ветвь (фрагмент) древа с представителями IV генотипа; Б - ветвь (фрагмент) древа с представителями VII генотипа (дистанционный метод присоединения соседей, р-дистанций, бутстреп-анализ при 1000 случайных выборках). Красным символом обозначены исследуемые изоляты [Fig. 3. Phylogenetic comparison of env gene regions in BLV Proviruses: A - branch (fragment) of the tree with representatives of genotype IV; B - branch (fragment) of the tree with representatives of genotype VII. The tree itself (data not provided) was constructed using remote method of joining neighbors, p-distances, bootstrap analysis with 1000 random samples. Investigated isolates are marked with a red symbol]
количество патогена составляет 3,09 х 106 ГЭ/ мл для GIV (8/11, 72,3% изолятов), что превышает таковое 3,58 х 105 ГЭ/мл для GVII (3/11, 27,3% изолятов).
На сегодняшний день отмечается прогрессивная тенденция в обеспечении здоровья молочного поголовья крупного рогатого скота, которая заключается в переходе к профилактике инфекции на ранних ее стадиях до начала применения лечебных мероприятий. Несмотря на то, что данная ретровирусная инфекция - лейкоз КРС - не считается таким инфекционным заболеванием, которое вызывает аборты или неонатальную смертность, следует уделять особое внимание новорожденным телятам в течение первой недели жизни в молочных стадах как фактору раннего
распространения возбудителя среди восприимчивых животных [32].
В связи с этим, оценка частоты встречаемости ВЛКРС у инфицированных перинатально телят представляет собой актуальный вектор стратегии управления биологическими рисками в качестве превентивной/предупредительной меры. При проведении оздоровительных мероприятий сложность серологической диагностики инфекции у телят в период от рождения до 6 мес. заключается, во-первых, в наличии колостральных антител против ВЛКРС, которые телёнок получает от матери в первые часы жизни, во-вторых, в слабо выраженном гуморальном иммунном ответе на инфицирование в перинатальный период или его полном отсутствии. Отсутствие иммуно-
глобулинов сыворотки крови телят приводит к быстрой контаминации биоматериала и образованию колоний микроорганизмов в геле агара, что препятствует правильному учету результатов реакции и снижает чувствительность метода РИД. Помимо этого, необходимость взятия материала у новорожденных телят до приема молозива создает дополнительные трудности в работе зооветеринарного персонала. Поэтому, применение прямого высокочувствительного молекулярно-биоло-гического метода выявления генетического материала патогена, не зависящего от присутствия антител, по нашему мнению, позволяет эффективно решать проблему диагностики ВЛКРС-инфекции у телят в раннем возрасте.
Нативное молозиво и молоко, которые обладают инфекционными свойствами [2, 4], представляют потенциальную опасность и, соответственно, являются фактором передачи возбудителя от матери своему потомству. С другой стороны, такая же ситуация продемонстрирована в случае близкородственных Т-лимфотропного вируса человека и вируса иммунодефицита человека, где риск перинатальной трансмиссии повышается при наличии фактора передачи - молока, вместе с такими показателями как ПН и продолжительность лактации [23, 27]. Таким образом, в своей работе выпаивание обследуемых телят проводили молоком от здоровых матерей. В данной ситуации при исключении алиментарного пути передачи возбудителя случаи заражения молодых животных происходили гематогенным (с нарушением плацентарного барьера) и контактным (посредством инфицированных амниотической жидкости или крови) путями.
Наша работа была сосредоточена на следующих аспектах молекулярного анализа: обнаружение провирусной ДНК ВЛКРС и ее ассоциации с различными факторами в полевых условиях; оценка провирусной нагрузки в образцах ДНК; филогенетический анализ выявленных изолятов ВЛКРС.
Выявляемая с помощью геномного анализа частота перинатального заражения молодняка трансплацентарным/контактным путями в животноводческом хозяйстве снизилась до минимального уровня 0,4% в 2021 г. и отсутствует (0%) на сегодняшний день.
Также (как и ранее [4]), нами подтверждена относительная диагностическая чувстви-
тельность молекулярно-генетической диагностики с использованием мультиплексной ПЦР-РВ. Частота встречаемости ВЛКРС у молодняка находится на уровне не ниже по сравнению с таковой серологического метода и отличается в 3,8 (1-я группа) и 1,25 (2-я группа) раз в сторону завышения. Это свидетельствует в пользу эффективности методики ПЦР и подтверждается снижением случаев выявления ретровирусной инфекции у молодых животных в динамике.
Известно, что оценка количества провирус-ной ДНК ВЛКРС, интегрированной в геномной ДНК клеток-хозяев, имеет прогностическое значение для развития лейкоза крупного рогатого скота [26, 36]; потенциально удаление крупного рогатого скота с высокой ПН успешно снижает распространенность и заболеваемость ВЛКРС [31]. Напротив, животные с низкой ПН, по-видимому, имеют, соответственно, меньшую заражающую дозу для передачи ВЛКРС [21, 29]. Следует отметить, что ПН в индивидуальном организме животного не является стабильной и носит колебательный характер при патогенезе [20, 37].
Нами была начата серия экспериментов по выявлению возможной корреляции между некоторыми показателями/характеристиками изучаемого инфекционного процесса. ПН является прогностическим маркером, что показывает, как может снизиться иммунный статус у животного во времени. Так, при сравнении количеств провируса у различных возрастных категорий крупного рогатого скота отмечали трехкратное завышение ПН у нетелей в возрасте до двух лет (2-я группа) относительно таковой у месячных телят (1-я группа). Телята со слабым гуморальным иммунным ответом на инфицирование продолжают быть защищенными на фоне ко-лострального/приобретенного иммунитета (период элиминации материнских антител приблизительно до 6-8 мес.), т. е. незрелая иммунная система не в состоянии справиться с относительно высокими концентрациями вируса. У молодых особей чаще встречаются дефициты гуморального иммунитета в результате недостаточной зрелости иммунной системы в период новорожденности и до 2-3 недели жизни. Другое возможное объяснение относительно высокой концентрации ВЛКРС при вертикальном пути заражения - это передача штаммов вируса, которые мутировали,
чтобы ускользнуть от действия иммунной системы матери. Вирус, адаптировавшийся к иммунной системе матери, несет меньше антигенных детерминант, которые способны образовывать комплексы с молекулами главного комплекса гистосовместимости и распознаваться его иммунной системой [14, 16].
Система естественной резистентности, в том числе нормализация механизмов иммунной реактивности, изменяется в соответствии с общим физиологическим состоянием организма животных и с возрастом.
С другой стороны, ПН у коров в возрасте от 2 до 6 лет, у которых количественные значения были условно высокими (порядок ПН более 105 ГЭ/мл) и, в среднем, составляли 1,5 х 108 ГЭ/мл (не опубликованные данные), превышали таковые у телят приблизительно в 102 раз, нетелей до двух лет - приблизительно в 40 раз. Это согласуется с литературными данным о том, что у повторнородящего молочного скота уровень ПН более высокий, чем у не телившихся особей [30]. Высокие показатели ПН, как правило, приходятся на период, когда телки размножаются, телятся и входят в дойное стадо - это время интенсивного человеческого вмешательства, присутствие стрессовых ситуаций, более тесного физического контакта между взрослыми особями, что возможно оказывает влияние на иммунный профиль животных. У взрослых и старых животных снижение иммунологической реактивности может происходить и за счет аутоиммунных процессов.
Филогенетический анализ показал наличие двух генотипов среди анализируемых животных: GУII и С1У. При этом, количество провируса варьировало между ними с разницей в 9 раз (88%) с завышением в сторону С1У варианта ВЛКРС. Интересно, что в 1-й группе, где выявлена гетерогенная популяция ВЛКРС, ситуация повторилась. Среди телят разница с завышением ПН в сторону С1У варианта составила 6,3 (84%) раза. Учитывая малочисленную выборку животных, планируется продолжать исследования в данном направлении с целью проработки эффективных алгоритмов с помощью соответствующих диагностических инструментов в рамках программ по контролю лейкозной инфекции у крупного рогатого скота.
Эаключение
Обнаружена положительная динамика выявления случаев перинатальной инфекции у молодняка за обозначенный период наблюдения в сторону снижения в 36 раз с отсутствием диагностических признаков трансмиссии ВЛКРС у молодых животных на данном этапе наблюдения.
Обоснована необходимость применения метода ПЦР-РВ как эффективного инструмента профилактических мероприятий при ретровирусной инфекции, начиная с самого раннего возраста телят от 0 до 20 сут (оптимально при первой вакцинации с целью наименьшего травмирования животного), что позволяет своевременно удалять инфицированных телят и формировать группу здоровых животных с последующей заменой ими маточного поголовья.
Проведено совершенствование молекулярной диагностики на основе геномного анализа в схеме комплексных противоэпизоотиче-ских/оздоровительных мероприятий с целью предотвращения распространения данной ретровирусной инфекции на ранних сроках.
Показано, что на основе филогенетического анализа локусов провирусных генов pol, env сохраняется общая тенденция по собственной БД ВИЭВ нуклеотидных последовательностей ВЛКРС: по локусу pol анализируемые российские изоляты сгруппировались с кладом 1 (14/14, 100% изолятов); по локусу env при выявлении двух генотипов вируса - GVII (6/19, 31,6% изолятов) и GIV (13/19, 68,4% изолятов) - доминирует GIV генетический вариант.
Начаты исследования по выявлению корреляционных связей между некоторыми характеристиками инфекционного процесса: количеством и генетическим вариантом ВЛКРС, а также возрастом крупного рогатого скота.
Установлено, что уровень инфицирования выше у нетелей, чем у телят; у повторнородящих молочных коров уровень ПН выше, чем у не рожавших особей; количество провируса завышено в крови животных с генотипом GIV относительно таковых с генетическим вариантом GVII ВЛКРС.
список источников
1. Валихов А. Ф., Бурба Л. Г., Шишков В. П. Иммунологическое и вирусологическое исследование мо-
лока, крови и спермы крупного рогатого скота, инфицированного онкорнавирусом // Труды ВИЭВ. 1983. № 59. С. 71-72.
2. Гулюкин М. И., Козырева Н. Г., Иванова Л. А., Степанова Т. В., Клименко А. И., Коваленко А. В. Дробин Ю. Д., Василенко В. Н. Межвидовая передача вируса лейкоза крупного рогатого скота в эксперименте // Вопросы вирусологии. 2015. T. 5, № 60. C. 32-37.
3. Козырева Н. Г. Применение методики мультиплексной ПЦР-РВ в молекулярной диагностике ВЛКРС при перинатальном инфицировании // Международный вестник ветеринарии. 2018. № 4. C. 28-32.
4. Козырева Н. Г., Абашин И. Ю., Иванова Л. А. Эффективность применения генодиагностического теста в оценке перинатального заражения у молодняка при профилактике лейкоза крупного рогатого скота с целью повышения качества молочной продукции // Российский журнал Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. 2020. T. 4, № 36. C. 450-455. https://doi.org/10.36871/vet. san.hyg.ecol.202004007.
5. Козырева Н. Г., Иванова Л. А., Степанова Т. В., Гулюкин М. И. Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции. Патент РФ 2694617, 2018.
6. Колобов А. В. Место ретровирусов в перинатальной патологии (обзор литературы) // Журнал ин-фектологии. 2012. T. 4, № 4. С. 13-19.
7. Садовникова В. Н. Особенности заболеваемости ВИЧ-инфекцией у детей и меры по профилактике перинатальной трансмиссии ВИЧ-инфекции // Педиатрия. 2010. Т. 89. № 1. С. 14-20.
8. Agresti A., Ponti W., RocchiM., MeneveriR., Marozzi A., Cavalleri D., Peri E., Poli G., Ginelli E. Use of polymerase chain reaction to diagnose bovine leukemia virus infection in calves at birth. Amer. J. Vet. Res. 1993; 54: 373-378.
9. Brym P., Ruse A., Kaminski S. Evaluation of reference genes for qRT-PCR gene expression studies in whole blood samples from healthy and leukemia-virus infected cattle. Vet. Immunol. Immunop. 2013; 153: 302-307. https://doi.org/10.1016/j. vetimm.2013.03.004.
10. Buehring G. C., Choi K. Y., Jensen H. M. Bovine leukemia virus in human breast tissues. Breast Cancer Res. 2001; 3: А14. https://doi.org/10.1186/bcr338.
11. Buehring G. C., Kramme P. M., Schultz R. D. Evidence for bovine leukemia virus in mammary epithelial cells of infected cows. Lab. Invest. 1994; 71: 359-365.
12. Chakraborty J., Clark S., Okonta H., Duggan J. A small animal model for mother-to-fetus transmission of ts1, a murine retrovirus. Viral Immunol. 2003; 16 (2): 191201. https://doi.org/10.1089/088282403322017929.
13. Dimmock C. K., Chung Y. S., MacKenzie A. R. Factors affecting the natural transmission of bovine leukaemia virus infection in Queensland dairy herds. Austr. Vet. J. 1991; 68: 230-233. https://doi. org/10.1111/j.1751-0813.1991.tb03213.x
14. Essajee S. M., Pollack H., Rochford G. Oransky I., Krasinski K., Borkowsky W. Early changes in quasispecies repertoire in HIV-infected infants: correlation with disease progression. AIDS Res. Human Retroviruses. 2000; 16 (18): 1949-1957. https:// doi.org/10.1089/088922200750054675.
15. Ferrer J. F., Piper C. E. Role colostrum and milk in the natural transmission of the bovine leukemia virus. Cancer Res. 1981; 41: 4906-4909.
16. Goulder P. J., Brander C., Tang Y. et al. Evolution and transmission of stable CTL escape mutations in HIV infection. Nature. 2001; 412: 334-338. https://doi. org/10.1038/35085576.
17. Gutiérrez G., Alvarez I., Merlini R., Rondelli F., Trono K. Dynamics of perinatal bovine leukemia virus infection. BMC Vet. Res. 2014; 10: 82. https://doi. org/10.1186/1746-6148-10-82.
18. Gutiérrez G., Lomonaco M., Alvarez I., Fernandez F., Trono K. Characterization of colostrum from dams of BLV endemic dairy herds. Vet Microbiol. 2015; 177 (3-4): 366-369. https://doi.org/10.1016/;. vetmic.2015.03.001.
19. Hron T., Elleder D., Gifford R. J. Deltaretroviruses have circulated since at least the Paleogene and infected a broad range of mammalian species. Retrovirology. 2019; 16: 33. https://doi.org/10.1186/s12977-019-0495-9.
20. Hutchinson H. C. Transmission and Progression of Bovine Leukemia Virus. Michigan State University, 2020.
21. Juliarena A. M., Barrios C. N., Ceriani M., Esteban E. Hot topic: Bovine leukemia virus (BLV)-infected cows with low proviral load are not a source of infection for BLV-free cattle. J. Dairy Sci. 2016; 99 (6): 4586-4589. http://dx.doi.org/10.3168/jds.2015-10480.
22. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J. of Molecular Evolution. 1980; 16: 111-120.
23. Kinoshita K., Hino S., Amagaski T. et al. Demonstration of adult T-cell leukemia virus antigen in milk from three sero-positive mothers. Gann. 1984; 75 (2): 103105.
24. Lassauzet M. L., Johnson W. O., Thurmond M. C., Stevens F. Protection of colostral antibodies against bovine leukemia virus infection in calves on a California dairy. Can. J. Vet. Res. 1989; 53: 424-430.
25. Lassauzet M. L., Thurmond M. C., Johnson W. O., Holmberg C. A. Factors associated with in utero or periparturient transmission of bovine leukemia virus
in calves on a California dairy. Can. J. Vet. Res. 1991; 55 (3): 264-268.
26. Lo C.-W., Borjigin L., Saito S., Fukunaga K., Saitou E., Okazaki K., Mizutani T., Wada S., Takeshima S.-N., Aida Y. BoLADRB3 Polymorphism is Associated with Differential Susceptibility to Bovine Leukemia Virus-Induced Lymphoma and Proviral Load. Viruses. 2020; 12 (3): 352. https://doi.org/10.3390/v12030352.
27. Martin-Latil S., Gnadig N. F., Mallet A. et al. Transcytosis of HTLV-1 across a tight human epithelial barrier and infection of subepithelial dendritic cells. Blood. 2012; 120 (3): 572-580. https://doi.org/10.1182/ blood-2011-08-374637.
28. Mekata H., Sekiguchi S., Konnai S., Kirino Y., Honkawa K., Nonaka N., Horii Y., Norimine J. Evaluation of the natural perinatal transmission of bovine leukaemia virus. Vet. Rec. 2014; 176 (10): 254. https://doi. org/10.1136/vr.102464.
29. Mekata H., Yamamoto M., Kirino Y., Sekiguchi S., Konnai S., Horii Y., Norimine J. New hematological key for bovine leukemia virus-infected Japanese Black cattle. J. Vet. Med. Sci. 2018; 80 (2): 316-319. https:// doi.org/10.1292/jvms.17-0455.
30. Ohno A., Takeshima Sh.-N., Matsumoto Y., Aida Y. Risk factors associated with increased bovine leukemia virus proviral load in infected cattle in Japan from 2012 to 2014. Virus Res. 2015; 210: 283-90. https://doi. org/10.1016/j.virusres.2015.08.020.
31. Ruggiero V., Norby B., Benitez O. et al. Controlling bovine leukemia virus in dairy herds by identifying and removing cows with the highest proviral load and lymphocyte counts. J. Dairy Sci. 2019; 102: 9165-9175. https://doi.org/10.3168/jds.2018-16186.
32. Ruiz V., Porta N. G., Lomonaco M., Trono K., Alvarez I. Bovine Leukemia Virus Infection in Neonatal Calves. Risk Factors and Control Measures. Front. Vet. Sci. 2018; 5: 267. https://doi.org/10.3389/fvets.2018.00267.
33. Rzhetsky A., Nei M. Theoretical foundation of the minimum-evolution method of phylogenetic inference. Mol. Biol. Evol. 1993; 10 (5): 1073-1095.
34. Sajiki Y., Konnai S., Nishimori A. et al. Intrauterine infection with bovine leukemia virus in pregnant dam with high viral load. J. Vet. Med. Sci. 2017; 79: 20362039. https://doi.org/10.1292/jvms.17-0391.
35. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstruction of phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 1987; 4 (4): 406-425.
36. Somura Y., Sugiyama E., Fujikawa H., Murakami K. Comparison of the copy numbers of bovine leukemia virus in the lymph nodes of cattle with enzootic bovine leukosis and cattle with latent infection. Arch. Virol. 2014; 159: 2693-2697.
37. Sultanov A., Rola-Luszczak M., Mamanova S. et al. Molecular Characterization of Bovine Leukemia Virus with the Evidence of a New Genotype Circulating in Cattle from Kazakhstan. Pathogens. 2022; 11: 180. https://doi.org/10.3390/pathogens11020180.
38. Tajima F., Nei M. Estimation of evolutionary distance between nucleotide sequences. Mol. Biol. and Evol. 1984; 1 (3): 269-285.
39. Van der Maaten M. J., Miller J. M., Schmerr M. J. F. Effect of colostral antibody on of bovine leukemia virus infection of neonatal calves. Amer. J. Vet. Res. 1981; 42 (6): 1498-1500.
Статья поступила в редакцию 29.04.2022; принята к публикации 15.06.2022
Об авторах:
Козырева Наталия Геннадиевна, ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН (109428, Москва, Рязанский проспект, д. 24, к. 1), Москва, Россия, кандидат биологических наук, ОКСЮ 10: 0000-0003-4318-8173, nk07-73@mail.ru
Абашин Илья Юрьевич, ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН (109428, Москва, Рязанский проспект, д. 24, к. 1), Москва, Россия, аспирант, ОКСЮ 10: 0000-0002-3623-1623
Иванова Людмила Александровна, ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН (109428, Москва, Рязанский проспект, д. 24, к. 1), Москва, Россия, кандидат биологических наук
Вклад соавторов:
Козырева Наталия Геннадиевна - получение данных для анализа, анализ полученных данных, обзор исследований по проблеме, написание текста рукописи.
Абашин Илья Юрьевич - работа с литературными источниками по теме статьи.
Иванова Людмила Александровна - разработка дизайна исследования, получение данных для анализа, анализ полученных данных.
Авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.
References
1. Valikhov A. F., Burba L. G., Shishkov V. P. Immunology research and virology testing of milk, blood and semen of cattle infected with oncornavirus. Trudy Vsesoyuznogo instituta eksperimental'noy veterinarii = Proceedings of the All-Union Institute of Experimental Veterinary Medicine. 1983; 59: 71-72. (In Russ.)
2. Gulyukin M. I., Kozyreva N. G., Ivanova L. A., Stepanova T. V., Klimenko A. I., Kovalenko A. V., Drobin Yu. D., Vasilenko V. N. Cross-species bovine leukemia virus transmission in experiment. Voprosy virusologii = Problems of Virology. 2015; 5 (60): 32-37. (In Russ.)
3. Kozyreva N. G. Application of a multiplex RT-PCR technique in molecular diagnostics of the BLV during perinatal infection. Mezhdunarodnyy vestnik veterinarii = International Bulletin of Veterinary Medicine. 2018; 4: 28-32. (In Russ.)
4. Kozyreva N. G., Abashin I. Yu., Ivanova L. A. Effectiveness of the gene diagnostics test in evaluating perinatal infection in young animals in the prevention of bovine leukemia to improve the quality of dairy products. Russian Journal of Problems of Veterinary Sanitation, Hygiene and Ecology. 2020; 4 (36): 450455. (In Russ.) https://doi.org/10.36871/vet.san.hyg. ecol.202004007.
5. Kozyreva N. G., Ivanova L. A., Stepanova T. V., Gulyukin M. I. A polymerase chain reaction method for diagnosing bovine leukemia. RF Patent No. 2694617, 2018.
6. Kolobov A. V. Place of retroviruses in perinatal pathology (literature review). Journal of Infectiology. 2012; 4 (4): 13-19. (In Russ.)
7. Sadovnikova V. N. Incidence rate of the HIV infection in children and measures to prevent perinatal HIV transmission. Pediiatriya = Pediatrics. 2010; 89 (1):14-20.
8. Buehring G.C., Choi K.Y., Jensen H.M. Bovine leukemia virus in human breast tissues. Breast Cancer Res. 2001; 3: A14. https://doi.org/10.1186/bcr338.
9. Buehring G.C., Kramme P.M., Schultz R.D. Evidence for bovine leukemia virus in mammary epithelial cells of infected cows. Lab. Invest. 1994; 71: 359-365.
10. Chakraborty J., Clark S., Okonta H., Duggan J. A small animal model for mother-to-fetus transmission of ts1, a murine retrovirus. Viral Immunol. 2003; 16(2): 191201. https://doi.org/10.1089/088282403322017929.
11. Essajee S.M., Pollack H., Rochford G. Oransky I., Krasinski K., Borkowsky W. Early changes in quasispecies repertoire in HIV-infected infants: correlation with disease progression. AIDS Res. Human Retroviruses. 2000; 16(18): 1949-1957. https:// doi.org/10.1089/088922200750054675.
12. Goulder P.J., Brander C., Tang Y., Tremblay C., Colbert R.A., Addo M.M., Rosenberg E.S., Nguyen T., Allen R., Trocha A., Altfeld M., He S., Bunce M.,
Funkhouser R., Pelton S. I., Burchett S. K., McIntosh K., Korber B. T., Walker B. D. Evolution and transmission of stable CTL escape mutations in HIV infection. Nature. 2001; 412: 334-338. https://doi. org/10.1038/35085576.
13. Hron T., Elleder D., Gifford R.J. Deltaretroviruses have circulated since at least the Paleogene and infected a broad range of mammalian species. Retrovirology. 2019; 16: 33. https://doi.org/10.1186/s12977-019-0495-9.
14. Kinoshita K., Hino S., Amagaski T., Ikeda S., Yamada Y., Suzuyama J., Momita S., Toriya K., Kamihira S., Ichimaru M. Demonstration of adult T-cell leukemia virus antigen in milk from three sero-positive mothers. Gann 1984; 75(2): 103-105.
15. Li H. C., Biggar R. J., Miley W. J., Maloney E. M., Cranston B., Hanchard B., Hisada M. Provirus load in breast milk and risk of mother-to-child transmission of human T lymphotropic virus type I. The Journal of Infectious Diseases. 2004; 190: 1275-1278. https://doi. org/10.1086/423941.
16. Martin-Latil S., Gnadig N. F., Mallet A., Desdouits M., Guivel-Benhassine F., Jeannin P. Prevost M.-Ch., Schwartz O., Gessain A., Ozden S., Ceccaldi P.-E. Transcytosis of HTLV-1 across a tight human epithelial barrier and infection of subepithelial dendritic cells. Blood. 2012; 120(3): 572-580. https://doi.org/10.1182/ blood-2011-08-374637.
17. Milligan C., Overbaugh J. The role of cell-associated virus in mother-to-child HIV transmission. The Journal of Infectious Diseases. 2014; 210(3): 631-640. https://doi.org/10.1093/infdis/jiu344.
18. Miotti P. G., Taha T. E., Kumwenda N. I., Broadhead R., Mtimavalye L. A., Hoeven L. V., Chiphangwi J. D., Liomba G., Biggar R. J. HIV transmission through breastfeeding: a study in Malawi. JAMA. 1999; 282: 744-749. https://doi.org/10.1001/jama.282.8.744.
19. Ohno A., Takeshima Sh.-n., Matsumoto Y., Aida Y. Risk factors associated with increased bovine leukemia virus proviral load in infected cattle in Japan from 2012 to 2014. Virus Res. 2015; 210:283-90. https://doi.org/10.1016Zj.virusres.2015.08.020.
20. Ruiz V., Porta N.G, Lomonaco M., Trono K., Alvarez I. Bovine Leukemia Virus Infection in Neonatal Calves. Risk Factors and Control Measures. Front. Vet. Sci. 2018; 5: 267. https://doi.org/10.3389/fvets.2018.00267.
21. Juliarena A. M., Barrios C. N., Ceriani M., Esteban E. Hot topic: Bovine leukemia virus (BLV)-infected cows with low proviral load are not a source of infection for BLV-free cattle. J. Dairy Sci. 2016; 99 (6): 4586-4589. http://dx.doi.org/10.3168/jds.2015-10480.
22. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J. of Molecular Evolution. 1980; 16: 111-120.
23. Kinoshita K., Hino S., Amagaski T. et al. Demonstration of adult T-cell leukemia virus antigen in milk from three sero-positive mothers. Gann. 1984; 75 (2): 103105.
24. Lassauzet M. L., Johnson W. O., Thurmond M. C., Stevens F. Protection of colostral antibodies against bovine leukemia virus infection in calves on a California dairy. Can. J. Vet. Res. 1989; 53: 424-430.
25. Lassauzet M. L., Thurmond M. C., Johnson W. O., Holmberg C. A. Factors associated with in utero or periparturient transmission of bovine leukemia virus in calves on a California dairy. Can. J. Vet. Res. 1991; 55 (3): 264-268.
26. Lo C.-W., Borjigin L., Saito S., Fukunaga K., Saitou E., Okazaki K., Mizutani T., Wada S., Takeshima S.-N., Aida Y. BoLADRB3 Polymorphism is Associated with Differential Susceptibility to Bovine Leukemia Virus-Induced Lymphoma and Proviral Load. Viruses. 2020; 12 (3): 352. https://doi.org/10.3390/v12030352.
27. Martin-Latil S., Gnadig N. F., Mallet A. et al. Transcytosis of HTLV-1 across a tight human epithelial barrier and infection of subepithelial dendritic cells. Blood. 2012; 120 (3): 572-580. https:// doi.org/10.1182/blood-2011-08-374637.
28. Mekata H., Sekiguchi S., Konnai S., Kirino Y., Honkawa K., Nonaka N., Horii Y., Norimine J. Evaluation of the natural perinatal transmission of bovine leukaemia virus. Vet. Rec. 2014; 176 (10): 254. https://doi.org/10.1136/vr.102464.
29. Mekata H., Yamamoto M., Kirino Y., Sekiguchi S., Konnai S., Horii Y., Norimine J. New hematological key for bovine leukemia virus-infected Japanese Black cattle. J. Vet. Med. Sci. 2018; 80 (2): 316-319. https:// doi.org/10.1292/jvms.17-0455.
30. Ohno A., Takeshima Sh.-N., Matsumoto Y., Aida Y. Risk factors associated with increased bovine leukemia virus proviral load in infected cattle in Japan from 2012 to 2014. Virus Res. 2015; 210: 28390. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2015.08.020.
31. Ruggiero V., Norby B., Benitez O, et al. Controlling bovine leukemia virus in dairy herds by identifying and removing cows with the highest proviral load and lymphocyte counts. J. Dairy Sci. 2019; 102: 9165-9175. https://doi.org/10.3168/jds.2018-16186.
32. Ruiz V., Porta N. G., Lomonaco M., Trono K., Alvarez I. Bovine Leukemia Virus Infection in Neonatal Calves. Risk Factors and Control Measures. Front. Vet. Sci. 2018; 5: 267. https://doi.org/10.3389/ fvets.2018.00267.
33. Rzhetsky A., Nei M. Theoretical foundation of the minimum-evolution method of phylogenetic inference. Mol. Biol. Evol. 1993; 10 (5): 1073-1095.
34. Sajiki Y., Konnai S., Nishimori A. et al. Intrauterine infection with bovine leukemia virus in pregnant dam with high viral load. J. Vet. Med. Sci. 2017; 79: 20362039. https://doi.org/10.1292/jvms.17-0391.
35. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstruction of phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 1987; 4 (4): 406-425.
36. Somura Y., Sugiyama E., Fujikawa H., Murakami K. Comparison of the copy numbers of bovine leukemia virus in the lymph nodes of cattle with enzootic bovine leukosis and cattle with latent infection. Arch. Virol. 2014; 159: 2693-2697.
37. Sultanov A., Rola-Luszczak M., Mamanova S. et al. Molecular Characterization of Bovine Leukemia Virus with the Evidence of a New Genotype Circulating in Cattle from Kazakhstan. Pathogens. 2022; 11: 180. https://doi.org/10.3390/pathogens11020180.
38. Tajima F., Nei M. Estimation of evolutionary distance between nucleotide sequences. Mol. Biol. and Evol. 1984; 1 (3): 269-285.
39. Van der Maaten M. J., Miller J. M., Schmerr M. J. F. Effect of colostral antibody on of bovine leukemia virus infection of neonatal calves. Amer. J. Vet. Res. 1981; 42 (6): 1498-1500.
The article was submitted 29.04.2022; accepted for publication 15.06.2022
About the authors:
Kozyreva Natalia G., FSC VIEV (24 Ryazansky prospect, Bldg. 1, Moscow, 109428), Moscow, Russia, Cand. Sc. Biol., ORCID ID: 0000-0003-4318-8173, nk07-73@mail.ru
Abashin Iliya Yu., FSC VIEV (24 Ryazansky prospect, Bldg. 1, Moscow, 109428), Moscow, Russia, Postgraduate Student, ORCID ID: 0000-0002-3623-1623
Ivanova Lyudmila a., FSC VIEV (24 Ryazansky prospect, Bldg. 1, Moscow, 109428), Moscow, Russia, Cand. Sc. Biol.
Contribution of co-authors:
kozyreva Natalia G. - obtaining data for analysis, analyzing the data obtained, reviewing research on the problem, writing the text of the manuscript.
Abashin Iliya Yu. - work with literary sources on the topic of the article.
Ivanova lyudmila A. - research design development, data acquisition for analysis, data analysis.
All authors have read and approved the final manuscript.
