CC BY
63
1,02 % (Р > 0,95.. .0,99); сырого протеина - на 1,45.. .1,01% (Р > 0,95); сырого жира - на 1,67.1,33% (Р > 0,95).
Применение исследуемой добавки при выращивании цыплят-бройлеров кросса «Росс 308» способствует увеличению усвоения азота у цыплят опытных групп, по сравнению с контролем, на 1,85.4,85% (Р > 0,99),
использования кальция и фосфора соответственно на 1,21.3,25 и 1,61.3,85% (Р > 0,99), кремния - на 0,86.2,65 % (Р > 0,99).
Среди испытанных дозировок наилучший эффект обеспечивает введение в комбикорм 110 мг добавки на 1 кг сухого корма.
Литература.
1. Федин А.С., Матренин А.П. Биологическое обоснование потребности молодняка овец в кремнии//Повышение эффективности кормления и разведения с.-х. животных. Саранск, 1988. С. 139-143.
2. Кормление сельскохозяйственной птицы/В.И. Фисинин, И.А. Егоров, Т.М. Околелова, Ш.А. Имангулов. Сергиев Посад, 2010. 373 с.
3. Сушков В.С., Лобанов К.Н., Гонтюрев А.И. Влияние добавки «Черказ» на переваримость питательных веществ рационов цыплятами-бройлерами кросса «Росс-308» // Вестник МичГау. №4. 2013. С.43-45.
4.Плохинский Н.А. Руководство по биометрии для зоотехников. М.: Колос, 1969. 268 с.
THE iNFLuENcE oF ADDITIVE «cHERKAZ» on NuTRiENT DiGEsTiBiLiTY, usE oF MiNERAL
substances and productivity of broiler chickens
V.A. Babushkin, W.s. suchkov, K.N. Lobanov, A.I. gontyuryov, A.E. Antipov Michurinsk state Agrarian university
summary. The aim of the work is to study the effect of the silicone biopreparation "Cherkaz" to the productivity of broiler chickens. The researches were carried out in 2009-2012 years under the conditions of Ltd "Rudnichnoe" Lipetsk region on the three groups of birds cross "Ross - 308" on 50 goals by groups. We studied the three preparation dosages - 100, 110, 120 mg/kg of feed. It has been established that the safety of livestock wasn't dose-dependent of the studied preparation.The chickens of the 1st, 2nd and 3rd -experimental groups received in addition to the basic diet for 100, 110 and 120 mg/kg of feed of this preparation, to the end of the experiment had the live weight of more than 3.9, 8.5 and 7.8 % (P > 0,95-0,999) respectively than the broilers of the control group. They spent less than 4.8 and 7.4 % of feed. The high feed conversion of the chickens of the experimental groups confirmed the better digestibility of the essential nutrients of diets. The broiler chickens of the experimental groups in comparison with analogues of the control group were higher digestibility of dry substances - for 0,53-0,93% (P > 0,95), of crude protein - for 0,95-1.45% (P > 0,95), better nitrogen fixation - for 1,85-4,85% (P > 0,95-0,999), by the use of calcium - for 1,21-3,25 % (P > 0,99-0,999), phosphorus - for 1,61 -3,85 % (P > 0,95-0,999) and silicon - for 0,86-2,65% (P > 0,99). In the tested dosages of the preparation "Cherkaz" the greatest effect was obtained when injected into mixed fodder in the amount of 110 mg/feed. Key words: digestibility, nutrients, silicon, feed nitrogen.
УДК 619:616=07.006
мониторинг эпизоотической ситуации
И ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛяРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОй
диагностики в оздоровительных мероприятиях при лейкозе крупного рогатого скота*
Н.Г. КОЗЫРЕВА, младший научный сотрудник Л.А. ИВАНОВА, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник
Т.В. СТЕПАНОВА, научный сотрудник лаборатории
М.И. ГУЛЮКИН, академик РАСХН, директор Всероссийский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии Email: [email protected]
Резюме. Приведена характеристика различных методов (РИД, ИФА, ПЦР) диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Обсуждены их преимущества и недостатки в программах оздоровления стад от лейкоза. Показана целесообразность использования метода ПЦР в качестве дополнительного подтверждающего теста при проведении плановых оздоровительных мероприятий. Выполнен анализ эпизоотической ситуации по лейкозу в различных субъектах Российской Федерации. Исследований проводили с целью разработки и
апробации тест-системы диагностики ВЛКРС методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Установлена высокая аналитическая чувствительность предложенной системы для выявления животных-носителей ВЛКРС(1,12x103 копий/мл). Исследование контрольной панели проб крови, а также 192 проб крови коров серологическими методами (РИД, ИФА) и методом ПЦР-РВ с использованием разработанной системы показало полное совпадение результатов. Диагностические специфичность и чувствительность тест-системы составили 100%. Ее использование позволило идентифицировать вирусоносителей среди телят в возрасте до 6 мес.: было выявлено 6 носителей ВЛКРС (15,0%). Показана результативность тест-системы при исследовании пулированных проб крови: по результатам анализа 21 пулиро-ванной пробы были корректно идентифицированы 3 носителя ВЛКРС среди 100 индивидуальных образцов, что позволило сократить экономические затраты и трудоемкость процесса. Предложенную тест-систему на основе метода ПЦР-РВ можно рассматривать в качестве эффективного способа повышения результативности профилактических мероприятий, направленных на оздоровление стад от лейкоза.
* Работа выполнена в рамках проекта Минобрнауки РФ, шифр «2011-16-МЦП/18».
Ключевые слова: мониторинг лейкоза крупного рогатого скота, вирус лейкоза крупного рогатого скота, днк-диагностика
влкрс.
Лейкоз крупного рогатого скота - злокачественное лимфопролиферативное заболевание, этиологическим агентом которого служит вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) (bovine leukemia virus - BLV), относящийся к семейству Retroviridae, роду Deltaretrovirus. ВЛКРС чрезвычайно широко распространен во всем мире. Социальная опасность болезни не доказана. Однако исследования в этом направлении продолжаются. Рядом авторов показано наличие фрагментов генома провируса у людей, в частности в клетках молочной железы [1].
Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в Российской Федерации. С изменением экономических отношений в нашей стране была реформирована система управления, созданы частные акционерные общества и фермерские хозяйства. В результате этих и других процессов возросли масштабы бесконтрольного перемещения животных и перевозок животноводческой продукции, а также обозначились серьезные затруднения в осуществлении ветеринарно-санитарного контроля, организации и проведении необходимых профилактических и противоэпизооти-ческих мероприятий. В частности, владельцы животных не всегда адекватно реагируют на предписания ветслужбы по содержанию животных-вирусоносителей и больных лейкозом, по использованию молочной продукции от них и др. Не в полном объеме проводится работа по подготовке «чистого» поголовья для замены серопозитивных животных, допускается передержка животных больных лейкозом [2]. В качестве одного из факторов, обусловливающих распространение ВЛКРС, рассматривается повышение чувствительности коров к инфекционным заболеваниям, в том числе к лейкозу, с увеличением уровня молочной продуктивности [3, 4].
Во всех субъектах Российской Федерации с целью выявления инфицированных вирусом лейкоза животных в плановом порядке проводится серологический скрининг, результаты которого дают основание сделать вывод о практически повсеместном распространении ВЛКРС.
По официальным данным в Российской Федерации 2278 пунктов, неблагополучных по лейкозу крупного рогатого скота, где уровень инфицирован-ности составляет от 12 до 15% (в отдельных регионах значительно выше), а заболеваемости - 3...4%. Такая эпизоотическая ситуация сохраняется уже в течение нескольких лет.
Согласно ветеринарной отчетности за 2012 г. и первую половину 2013 г. выявлено соответственно 314 и 218 новых неблагополучных пунктов, оздоровлено - 259 и 140. За этот период были объявлены неблагополучными 46 пунктов в Калужской области, 25 - в Московской, 24 - в Орловской, 25 - в Смоленской, 33 - в Саратовской, 48 - в Кемеровской области, 19 - в Приморском крае.
Распространенность ВЛКРС на территориях отдельных субъектов и напряженность эпизоотической ситуации оценивается по средним показателям ин-фицированности скота. В соответствии с его величиной субъекты РФ можно распределить следующим образом:
до 10% - 52 субъекта (Амурская, Астраханская, Брянская, Волгоградская, Вологодская, Еврейская автономная, Ивановская, Иркутская, Калужская, Кемеровская, Кировская, Костромская, Ленинградская, Ли-
пецкая, Магаданская Мурманская, Новгородская, Новосибирская, Омская, Орловская, Псковская, Ростовская, Саратовская, Сахалинская, Свердловская, Смоленская, Томская, Тульская, Тюменская, Ярославская области; республики Алтай, Башкортостан, Бурятия, Карелия, Адыгея, Калмыкия, Ингушетия, Мордовия, Кабардино-Балкарская, Карачаево-Черкесская, Дагестан, Саха (Якутия), Тыва, Удмуртская, Хакасия, Чувашская; Краснодарский Ставропольский, Пермский, Алтайский, Забайкальский, Красноярский, Камчатский края), в 18 из них инфицированность составляет 1,1%;
до 30% - 17 субъектов (Белгородская, Владимирская, Воронежская, Курская, Московская, Рязанская, Тамбовская, Тверская, Оренбургская, Пензенская, Самарская, Ульяновская, Курганская, Челябинская, Калининградская области; Приморский край; республика Татарстан);
больше 30% - 2 субъекта (Нижегородская область -33,2%, Хабаровский край - 32,1%);
свободны от лейкоза Архангельская область, республика Коми, Ненецкий, Ханты-Мансийский (Югра), Ямало-Ненецкий, Чукотский автономные округа;
не представлены данные по 6 субъектам.
В РФ числятся 1513 премпредприятий, имеющих соответствующие лицензии, 386 из них (25,5%) неблагополучны по лейкозу крупного рогатого скота, что свидетельствует об очень тяжелой ситуации. Активно реализуя молодняк в разные субъекты РФ, такие племпредприя-тия способствуют распространению инфекции.
Индуцированная ВЛКРС инфекция отличается отсутствием виремии или антигенемии, пожизненной персистенцией интегрированного в геном инфицированных клеток провируса и наличием антител против антигенов вируса в крови инфицированных животных. Инфекционный процесс принято подразделять на 4 стадии: инкубационный период (с момента инфицирования до появления первых признаков развития инфекции - обычно, антител); стадия бессимптомного вирусоносительства (животное не имеет клинико-гематологических признаков болезни), гематологическая стадия (персистентный лимфоцитоз и другие нарушения картины крови), опухолевая (терминальная) стадия (возникновение злокачественных образований в кроветворных и других органах и тканях). Первые две стадии развития лейкоза довольно продолжительны. Для диагностики каждой стадии разработан комплекс методов, которые можно разделить на две группы. Первую из них составляют непрямые методы, которые представляют комплекс серологических реакций, позволяющих выявлять специфические антитела против антигенов ВЛКРС - РИД (РДП), ИФА. Ко второй группе относятся методы прямого обнаружения вируса или его антигенов - выявление (иммунологически, методами электронной микроскопии) антигенов и/ или вирионов после краткосрочного культивирования клеток, тест синцитиеобразования клетками, биопроба, молекулярно-генетические методы (ПЦР, молекулярная гибридизация, секвенирование).
Успех мероприятий по оздоровлению неблагополучных хозяйств от инфекции, индуцированной ВЛКРС, во многом определяется специфичностью, чувствительностью и практичностью методов диагностики и комплексного их применения.
На сегодняшний день, согласно стандартам МЭБ, признаны два основных метода диагностики лейкоза крупного рогатого скота - РИД и ИФА [6]. РИД - наиболее простой, легкий в постановке и удобный для
практической работы серологический метод [3]. Благодаря разработке и внедрению в 1976 г. в практику РИД на основе структурного гликопротеида [6...8] стало возможным массовое проведение диагностических исследований. На протяжении ряда десятилетий в Российской Федерации осуществляется комплекс мероприятий по борьбе с лейкозом [9, 10].
Серологические методы обнаружения противовирусных антител используют для выявления инфицированных ВЛКРС животных. Это дает возможность контролировать благополучие стад.
Несмотря на мероприятия по оздоровлению, уровень ВЛКРС-инфекции в стадах остается высоким вследствие несоблюдения действующих «Правил...» [9].
Кроме того, широко используемый метод РИД не позволяет выявить всех инфицированных животных, так как у некоторых из них уровень антител в крови ниже порога его чувствительности.
Важное преимущество иммуноферментных методов анализа (ИФА), помимо высокой чувствительности, позволяющей выявлять концентрации порядка нг/мл, и специфичности, - воспроизводимость результатов, простота проведения реакции и возможность использования минимальных объемов исследуемого материала, наличие инструментального учета реакции и возможность автоматизации всех ее этапов [11]. Развитие ИФА открыло новые возможности для контроля за оздоровлением скота от инфекции, вызванной ВЛКРС. Этот метод позволяет исследовать биологические жидкости с низким содержанием антител, например, молоко. Анализ проб молока в ИФА иногда даже более чувствителен, чем проб сывороток крови в РИД [7, 12, 13].
В последние годы ИФА как основной метод диагностики лейкоза широко используют в национальных программах борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в Западной Европе и Америке. Высокая его эффективность была подтверждена в большинстве развитых стран мира, включая Скандинавию, Германию, Францию, Голландию, Словению, Австралию, Новую Зеландию, Ирландию и др. [11].
Использование подтверждающего варианта ИФА -VeriTest - важный инструмент в выяснении специфичности полученных результатов ИФА в скрининговом формате, при применении которого возможны ложноположитель-ные результаты вследствие выявления перекрестно-реагирующих антител [11]. Имеющиеся преимущества дают возможность использовать этот метод на заключительных стадиях оздоровления в комплексе с РИД для более полного выявления вирусоносителей.
Один из недостатков системы диагностики лейкоза крупного рогатого скота, существующей в РФ, заключается в поздней констатации уже неудержимой пролиферации лимфоидных клеток иммунной системы. Эпизоотологическая неоправданность гематологической диагностики лейкоза выражается в том, что к моменту постановки диагноза число инфицированных животных возрастает в несколько раз. Это объясняется долгосрочным, многолетним носительством вируса, а также наличием многочисленных горизонтальных и вертикальных путей его передачи.
Кроме того, серологические методы исследования не позволяют проводить диагностику у молодняка на фоне пассивно приобретенных от инфицированной матери колостральных антител. Тем самым ставится под сомнение один из наиболее важных внутренних резервов создания свободного от ВЛКРС поголовья.
Таким образом, оба методических подхода (иммунологический и гематологический) к выявлению носителей вируса и больных лейкозом животных не обеспечивают эффективного оздоровления субпопуляций крупного рогатого скота. Тем не менее они позволяют уменьшить число серопозитивных носителей ВЛКРС, полностью выводить животных с лимфоцитозом, а также большинство больных лейкозом. В целом существующие методы оздоровления от лейкоза, базирующиеся на серологической и гематологической диагностике, характеризуются значительной продолжительностью (2...8 лет) с выявлением при каждом очередном исследовании всё новых серопозитивных вирусоносителей. Это объясняется неполной ликвидацией или изъятием источников ВЛКРС и отсутствием каких-либо мер, воздействующих на пути и механизмы его передачи. Вместе с тем, применение существующей диагностики позволило полностью оздоровить от ВЛКРС или свести к минимуму вирусоносительство в Вологодской, Свердловской и Ленинградской областях.
Открытие в 1993 г. американским ученым К. Мюл-лисом принципа ПЦР (полимеразная цепная реакция), удостоенное Нобелевской премии, стало одним из важнейших событий XX века в области биологии. Развитие технологии на основе ПЦР дало импульс к разработке и освоению методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК). В российской лабораторной диагностике инфекций они представлены исключительно методом ПЦР [14] в различных вариантах NASBA, Real-Time, «nested''-ПЦР, «end point».
ПЦР открывает новые возможности для совершенствования диагностики и профилактики лейкоза крупного рогатого скота - выявление провируса на ранних стадиях инфекционного процесса до образования антител в диагностических титрах. Для обнаружения возбудителя этим методом используют цельную кровь (лимфоциты периферической крови), разные биологические секреты, органы животных и др. Для проведения ПЦР анализа достаточно 100 мкл крови, а результат можно получить в течение рабочего дня. ПЦР позволяет выявлять фрагменты генома ВЛКРС в образцах крови через 1.2 нед. после заражения [15, 16].
По экономическим соображениям при плановых оздоровительных мероприятиях ПЦР целесообразно использовать в качестве дополнительного подтверждающего теста для исследования проб, отрицательных в РИД и ИФА, а также в случаях, когда серологические методы неэффективны:
диагностика инфекции у телят моложе 6 мес. на фоне персистирования колостральных антител. Диагностика ВЛКРС-инфекции в этот период - узловой этап проведения оздоровительных мероприятий. Изоляция телят-носителей значительно снижает риск распространения инфекции среди ремонтного молодняка и дает возможность оздоровить стадо путем выращивания свободного от ВЛКРС потомства. Это актуально, прежде всего, для хозяйств с уровнем инфицированности более 30.40%, в которых нельзя разделить поголовье на «серонегатив-ную» и «серопозитивную» группы;
исследование животных, предназначенных на экспорт или импорт, находящегося в карантине и племенного скота;
выявление инфицированных животных с низким уровнем антител или не имеющих антител против ВЛКРС. Существуют две основные причины этого явления - толерантность организма к возбудителю вследствие внутриутробного заражения плода до
развития иммунокомпетентности; инфицирование генетическими вариантами ВЛКРС, не вызывающими образование антител, существование которых уже доказано зарубежными учеными. Очевидно, что их распространению способствуют меры борьбы, предусматривающие удаление из стада серопозитивных животных [17];
дифференциальная диагностика между энзоотическим и спорадическим лейкозами.
Один из вариантов ПЦР - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ). В основе этого метода лежит механизм репликации специфического фрагмента молекулы ДНК исследуемого образца ферментом Taq-ДНК-полимеразой в присутствии дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (дНТФ) и специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров и меченного флуоресцентным красителем зонда). Амплификация (количественное увеличение) специфического фрагмента ДНК происходит в результате многократного повторения циклов денатурации, отжига специфических праймеров и зонда, синтеза комплементарных цепей ДНК. Продукты амплификации детектируются по накоплению сигнала флюоресценции [18].
Цель наших исследований - испытания тест-системы диагностики ВЛКСР методом ПЦР в реальном времени, в рамках которых проводили оценку ее диагностической и аналитической чувствительности, а также диагностической специфичности.
Условия, материалы и методы. Для испытания разработанной тест-системы использовали кровь 192 коров из хозяйств Смоленской и Ростовской областей, в том числе контрольную панель из 10 проб, включающую 7 серопозитивных и 3 серонегативных пробы, а также кровь 40 телят в возрасте до 6 мес. из хозяйства Московской области.
Реакцию иммунодиффузии в геле агара (РИД) и иммуноферментный анализ (ИФА) проводили с использованием коммерческих наборов производства ФГУП «Курская биофабрика». Коммерческую ПЦР-тест-систему производства ФБУН ЦНИИЭ Роспотреб-надзора использовали согласно инструкции производителя.
Методику (ВОЗ) NAT-минипул-геноскринирование крови апробировали для исследования крови крупного рогатого скота на лейкоз согласно протоколу, изложенному в научно-методическом сборнике [19] с некоторыми модификациями в модельном эксперименте на 100 серонегативных животных, у 3 из которых по результатам ПЦР индивидуальных проб выявлена ДНК провируса, что соответствует минимальной частоте внутриутробного инфицирования телят - потомков инфицированных матерей.
При выделении ДНК из исследуемого материала в качестве отрицательного контроля использовали 100 мкл бидистиллированной воды. В качестве положительного контроля при проведении ПЦР-РВ использовали 5 мкл ДНК ВЛКРС, который представляет собой плазмиду pBLVpol, несущую вставку фрагмента гена pol на основе вируса, продуцируемого культурой FLK-BLV.
ПЦР-РВ осуществляли с помощью прибора Spectrum 48 («ESCO», Сингапур) по программе выявления провирусной ДНК ВЛКРС (см. табл.).
Интенсивность флюоресценции измеряли при длине волны возбуждения 470 нм, поглощения - 525 нм.
Анализ результатов осуществляли на основе так называемого «порогового метода», включающего опреде-
Таблица. Программа выявления провирусной
днквлкрс
Темпе- Число Детекция Канал
Цикл ратура, мин. сек. ци- флюорес- флюорес-
С° клов ценции ценции
1 95° 05 00 1 - -
2 62° 00 50 45 single FAM
95° 00 15 - -
ление значения порогового цикла реакции Ct (threshold cycle) как точки пересечения графика накопления ДНК (кривая флюоресценции) и пороговой линии [18]. Чем меньше С (то есть чем быстрее происходит накопление флюоресцентного сигнала в образце и достигается пороговая величина), тем больше в нём было целевой ДНК в начальный момент времени. ДНК образцов, в которых флюоресцентный сигнал не достигает пороговой величины за время проведения реакции, не содержит целевых последовательностей [18].
Результат считали достоверным только в случае корректного прохождения реакции в пробирках с положительным и отрицательным контролями амплификации («К-» значение С в канале FAM отсутствует «К+» - < 30).
Образец считали положительным, если значение Ct по каналу FAM было менее 42, отрицательным, если оно отсутствовало, то есть кривая флуоресценции не пересекала установленную на соответствующем уровне пороговую линию.
Отсутствие значений Ct для образца с положительным контролем ПЦР свидетельствовало о допущенных ошибках при программировании прибора или на этапах проведения процедуры ПЦР анализа. В этом случае результаты не учитывали.
Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контрольного образца обычно свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов.
Диагностическую специфичность и диагностическую чувствительность изучаемой тест-системы рассчитывали по формуле B/Nx100, где B - доля негативных результатов теста в группе N неинфицированных животных или доля позитивных результатов теста в группе N инфицированных животных [20].
Аналитическую чувствительность оценивали при тестировании серийных десятикратных (от 1x10-2 до 1 x10-12) разведений рекомбинантной плазмиды pBLVpol с известным содержанием целевых копий ДНК.
Результаты и обсуждение. Аналитическая чувствительность разработанной тест-системы составила 1,12x103 копий/мл.
При исследовании 192 проб крови крупного рогатого скота, 60 из которых были серонегативными по результатам РИД и ИФА и 132 - серопозитивными, было получено 100%-ное совпадение с результатами выявления участка ДНК провируса гена pol методом ПЦР-РВ. Таким образом, диагностические специфичность и чувствительность составили 100%.
Исследование в ПЦР-РВ контрольной панели проб крови показало полное совпадение с результатами серологических исследований.
Анализ 40 индивидуальных проб крови телят показал 6 (15%) положительно реагирующих.
При использовании методики исследования пули-рованных проб крови вместо исследования 100 индивидуальных проб был проведен анализ всего 21 пробы и все 3 вирусоносителя были выявлены с высокой
чувствительностью и при значительном сокращении затрат и трудоемкости процесса.
Сравнение результатов ПЦР с использованием тест-систем производства ВИЭВ и ФБУН ЦНИИЭ Роспотреб-надзора показало совпадение в 100% случаев.
выводы. ПЦР анализ с использованием разработанной тест-системы в режиме «реального времени» позволяет:
проводить диагностику ВЛКРС инфекции у телят в колостральный период;
использовать исследование пулированных проб
крови животных в связи с высокой аналитической чувствительностью разработанной тест-системы, которая составляет 1,12х1013 копий/мл, что позволяет повысить возможности практического использования метода с одновременным сокращением количества реакций и финансовых затрат на их проведение;
осуществлять профилактические мероприятия в неблагополучных по лейкозу хозяйствах с применением комплексной схемы диагностических исследований, которая дает возможность выявлять наибольшее количество вирусоносителей среди молодых животных.
Литература.
1. Bovine Leukemia Virus Gene Segment Detected in Human Breast Tissue / Mesa G., Ulloa J. C., Uribe A. M., Gutierrez M. F. // Open Journal of Medical Microbiology. 2013. Vol. 3. p. 84-90.
2. Гулюкин М.И., Симонян Г.А., Барабанов И.И. и др. Аналитический обзор эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота в Российской Федерации (1996-2010) / Рос. акад. с.-х. наук, Всерос. науч.-исслед. ин-тэксперим. ветеринарии им. Я. Р. Коваленко (ВИЭВ). Москва: [б. и.]. 2011. 46 с.
3. Распространение вируса лейкоза крупного рогатого скота у коров черно-пестрой породы с разной молочной продуктивностью /Зиновьева Н.А., Гпадырь Е.А., Виноградова И.В., Михайлова М.Е., Молофеева Л.А., ЭрнстЛ.К. //Сельскохозяйственная биология. 2012. № 6. № 49-55.
4. Молочная продуктивность коров в зависимости от инфицированности вирусом лейкоза и генотипа по BoLA-DRB3 / Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., Быкова А.С., Виноградова И.В., Эрнст Л.К. //Достижения науки и техники АПК. 2012. № 8. с. 46-49.
5. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (2012) [Electronic resource]. The World Organisation for Animal Health (OIE). URL:http://www.oie.int/en/international-standard-setting/terrestrial-anual/access-online.pdf.
6. Валихов А.Ф., Шишков В.П., Бурба Л.Г. Лейкоз крупного рогатого скота//Серия:животноводство и ветеринария. - М.: ВНИИТЭИсельхоз ВАСХНИЛ, 1980. 76 с.
7. Miller J.M., Van der Maaten M.J. Serological detection of bovine leukemia virus infection // Vet. Microbiol. 1976. Vol.1. P.195-202.
8. Miller J.M., Van der Maaten M.J., Phillips M. Studies of a glycoprotein associated with bovine leukemia virus//In: Bovine leucosis: various methods of molecular virology. 1977. P.69-82.
9. Правила по профилактике и борьбе с лейкозом крупного рогатого скота (утв. МСХРФ 11.05.1999, N 399. Зарегистрировано в Минюсте РФ 4 июня 1999 N1799).
10. Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота (утв. Департаментом ветеринарии МСХ 23.08.2000).
11. Апалькин В.А., Гулюкин М.И., Петров Н.И. Лейкоз крупного рогатого скота //Диагностика и оздоровительные мероприятия. СПб.: Петролазер, 2005. 87 C.
12. Miller J.M., Van der Maaten M.J. Serologic response of cattle following inoculation with bovine leukemia virus // Bibl. Haematol. 1976. Vol.43. P.187-189.
13. Use of an ELISA involving monoclonal antibody for the detection of antibodies against bovine leukemia virus in a herd a high incidence of enzootic bovine leucosis / M. Mammerickx, D. Portetelle, C. Bruck, A. Burny //Zbl. Vet. Med. B. 1984. Vol.31. P.210-218.
14. Творогова М.Г., Гущин А.Е. ПЦР-исследования в лабораторной диагностике: вопросы обеспечения качества // Клиническая лабораторная диагностика. 2006. №12. C.38-41.
15. Возможности и ограничения использования полимеразной цепной реакции в диагностике лейкоза крупного рогатого скота / С.В. Чичинина, В.В. Храмцов, П.Н. Смирнов, Е.А. Дурыманова, В.А. Белявская //Вестник РАСХН. 2006. №.6. C.71-73.
16. Двоеглазов Н.Г., Туманов Ю.В. Сравнительный анализ разных коммерческих тест-систем и методов в диагностике ВЛКРС// Aктуальные вопросы ветеринарии: мат. Сиб. междунар. науч.-практ. конф. Новосибирск, 2004. С. 304-308.
17. Early detection of bovine leukosis virus DNA in infected sheep using the polymerase chain reaction / Brandon R.B., Naif H., DanielR.C.W., Lavin M.F. //Res. Vet. Sci. 1991. 50. 89-94.
18. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и др. ПЦР «в реальном времени». М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. 221 с.
19. NAT-минипул-геноскринирование крови на основе международных стандартов ВОЗ - гарантия вирусной и бактериальной безопасности реципиентов: российско-немецкий научно-методический сборник/под ред. Н.А. Федоров, М.П. Гоишаев. Москва-Новосибирск-Франкфурт-на-Майне, 2003. 87с.
20. Altman D.G., Bland J.M. Statistics Notes: Diagnostic tests 1: sensitivity and specificity // BMJ. 1994. V. 308. P.1552.
application of dna diagnostics in sanitation programs for eradication of bovine leucosis
N.G. Kozyreva, L.A. ivanova, T.V. stepanova, M.i. Guljukin
GNu All-Russian research institute of experimental veterinary, Moscow
summary. The characteristics of different methods (RIA, ELISA, PCR) used for diagnostics of bovine leukemia virus (BLV) was done. The advantages and disadvantages of their applications in programs for leucosis eradications were discussed. The effectiveness of PCR method as the additional confirmation test in frame of systematic sanitary procedure was shown. The analysis of epizootic situation regarding bovine leucosis in the different regions of the Russian Federation was performed. The aim of the present study was the development and application of the test-system for diagnostics of BLV using real-time PCR. The research results showed the high analytical sensitivity of the developed test-system for identification of animals carrying the BLV (1.12*103 copies/ml). The analysis of the control blood panel and 192 blood samples of cows using serological methods (RIA, ELISA) and the real-time PCR method (developed test-system) demonstrated the complete coincidence of research results. Thus the diagnostic specificity and sensitivity of developed test-system was 100 per cent. The practical application of developed test-system allowed identifying the virus carriers among calves in the age up to 6 months: 6 BLV carriers were detected (15.0 per cent). The effectiveness of the test-system application for the analysis of the pulled blood samples was shown: the analysis of 21 pulled probes allowed correctly identifying of three BLV carriers among 100 individual samples that made it possible essentially decrease the expenses and labor-intensiveness of the process. The developed test-system for BLV diagnostics on the base of real-time PCR method could be rated as the effective tool to increase the effectiveness of sanitary procedure for bovine leucosis.
Key words: leucosis monitoring, bovine leukemia virus, DNA diagnostics of BLV.
