CC BY
7
УДК 619:616.98:578.828
ВСТРЕЧАЕМОСТЬ РЕТРОВИРУСОВ ЖИВОТНЫХ В РАЙОНАХ РЕСПУБЛИКИ
ТАТАРСТАН
Сафина Р.Ф. - аспирант, Сальманова Г.Р. - аспирант, Усольцев К.В. - к.вет.н., Хаммадов Н.И. - к.б.н., Фаизов Т.Х. - д.вет.н., профессор
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической
безопасности»
Ключевые слова: ретровирусы, ИФА, ПЦР, вирус артрита - энцефалита коз, вирус лейкоза крупного рогатого скота
Keywords: retroviruses, ELISA, PCR, caprine arthritis-encephalitis virus, bovine leukemia
virus
В экономике Республики Татарстан одной из доминирующих отраслей является сельское хозяйство, в частности животноводство. Скотоводство Татарстана показывает довольно высокие результаты по производству мяса и молока в сравнении с другими регионами Российской Федерации. Заболевания, вызываемые ретровирусами, причиняют
животноводству существенный
экономический ущерб, который
выражается в недополучении молока и приплода, преждевременной выбраковке животных, нарушении
воспроизводительной функции больных животных, ограничениях племенной работы и хозяйственной деятельности в связи с неблагополучием [6].
Ретровирусы - это РНК-содержащие вирусы, встраивающие свой геном в геном клетки организма хозяина. Семейство ретровирусов включает такие заболевания животных как вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (КРС), вирус лейкоза крупного рогатого скота, вирус артрита-энцефалита коз, вирус висна-маеди овец, инфекционную анемию лошадей и другие [15]. Для репликации своего генома ретровирусы используют механизм обратной транскрипции для синтеза копий ДНК (провирусная ДНК). Как правило, ретровирусы инфицируют соматические клетки. Однако некоторые из них в результате инфекции могут попадать в клетки зародышевого пути. В этом случае интегрированные вирусные гены
наследуются по тем же законам, что и остальные гены организма [13].
Лейкоз крупного рогатого скота -хроническое заболевание опухолевой природы, проявляющееся лимфоцитозом и опухолегенезом, ведущее животное к гибели. Этиологическим агентом заболевания является вирус бычьего лейкоза - Bovine Leukemia Virus, согласно Международной таксономии, относящийся к роду Deltaretroviridae [10]. Болеет преимущественно взрослый крупный рогатый скот. При этом заболевании возможно длительное вирусоносительство и инфицирование молодых особей перед проявлением клинических признаков. Это связано с тем, что вирусная частица в организме животного в течение короткого времени преобразуется в ДНК-провирус, не проявляясь клиническими симптомами [9]. Есть сообщения о межвидовой передаче данного вируса [3, 8]. В соответствии с Ветеринарными правилами по
профилактике и борьбе с лейкозом КРС, утвержденными приказом Минсельхоза РФ в 2021 году, молоко и молозиво от инфицированного животного,
предварительно подвергая термической обработке путем прогревания при температуре не ниже 85 °С в течение не менее 10 минут или кипячения не менее 5 минут разрешено сдавать на переработку или использовать внутри резервации, притом молоко от больных животных подлежит уничтожению. Убой больных и инфицированных животных
осуществляется на предприятиях по убою животных или оборудованных для этих целей убойных пунктах. При обнаружении у животных клинической стадии болезни при патологоанатомическом вскрытии, их мясо подлежит утилизации [2]. Диагностику вируса лейкоза проводят серологическими (реакциями
иммунодиффузии в геле,
иммуноферментный анализ) и
молекулярно-генетическими (полимеразная цепная реакция) методами. Серологические методы диагностики не позволяют точно выявлять активные антитела, возникающие при вирусном инфицировании, примерно до
шестимесячного возраста теленка, так как в данный период жизни в их крови присутствуют материнские антитела, обеспечивающие колостральный
иммунитет. Однако метод полимеразной цепной реакции позволяет прямо осуществлять детекцию вируса путем обнаружения минимального количества копий провирусной ДНК в образцах в течение латентного периода болезни, а у телят - старше 15-дневного возраста [1, 4].
Вирус артрита-энцефалита коз (ВАЭК) относится к лентивирусам подсемейству ретровирусов, куда входят также антигенно и генетически родственные вирусы висна-маеди овец, инфекционной анемии лошадей, иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2). Это медленно протекающая вирусная болезнь, сопровождающаяся развитием энцефаломиелитов (преимущественно у молодняка), хронических
пролиферативных синовитов,
периартритов, прогрессирующих
интерстициальных пневмоний и интралобулярных маститов [11]. Имеются данные об образовании антител к антигенам данного вируса у людей. Но особую актуальность придает факт того, что у людей, употребляющих молоко от инфицированных ВАЭК коз, наблюдается неспецифическое (положительное)
реагирование в серологических реакциях на ВИЧ-1 и ВИЧ-2 [14].
Ретровирус часть времени находится в организме не в виде вирусной
частицы, а в виде провируса, не проявляя клинической картины заболевания. Таким образом, вирусная частица находится в крови в момент заражения (кратковременно) и во время активной репродукции вируса, соответственно РНК вируса можно выявить только в это время. Провирусная ДНК представлена в геноме самого зараженного организма, и в достаточном количестве присутствует в крови. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет проводить индикацию вируса в самые ранние сроки, после попадания вируса в организм [12].
Цель данного исследования -мониторинг животноводческих хозяйств Республики Татарстан на наличие ретровирусов, а именно возбудителя лейкоза КРС (ВЛ КРС) и вируса артрита-энцефалита коз (ВАЭК).
Материал и методы исследований. Нами были отобраны образцы крови крупного рогатого скота и коз из различных животноводческих хозяйств РТ. Отбор проб осуществляли в вакуумные пробирки с ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) из яремной вены. Всего было происследовано 144 образца крови КРС из 3 районов РТ (Лаишевского, Буинского и Алькеевского) по 48 проб, а также 108 образцов крови коз из 3 козоводческих хозяйств РТ, из каждого хозяйства по 36 образцов крови.
Нуклеиновые кислоты выделяли комплектами реагентов «МАГНО-сорб» (для ВАЭК) и «ДНК-сорб-В» (для ВЛ КРС) согласно инструкции производителя. Для ПЦР амплификации использовалась плазмидная ДНК положительного контроля. ПЦР осуществляли на амплификаторе С1000 с оптическим блоком CFX96 («BioRad», США).
Методика проведения ПЦР амплификации аналогична описанной ранее [5] со следующими модификациями: для возбудителя лейкоза КРС - прямой праймер 1§;1;1;саа1§;Шс1;саа;;саас;с; обратный праймер а;;1;а;1;с1;с1;а1;;с1аа;;;с; зонд ЯОХ-сс1;сс1а1;с1;ссс1;§;1;1аа1;с1;с1;с1ас;;с - ЯТО, температура отжига составляла 60,5 °С, считывание результатов ПЦР
(флуоресценции) происходило в каждом
цикле ПЦР, при 60,5 °C по каналам Rox и Cy5; для ВАЭК - прямой праймер gcaaacgcgattcagcagtct; обратный праймер taccatggcataggttgcctctaa; зонд Rox-ctgtccagacccttgctaatgcaactgc-BHQ2, температура отжига праймеров составляла 57° C, детекция результата ПЦР (флуоресценции) происходит на каждом цикле ПЦР, при 57 °C по каналам Rox и Cy5. Для более детального исследования данных образцов был проведен ИФА на обнаружение противолейкозных антител к антигену gp 51 (ген env) «Набором ИФА (Вариант 2) VeriTest» (ООО «Ветбиохим», Россия), согласно приложенной инструкции. Для подтверждения наличия антител к антигену р 28 возбудителя висна-маеди/артрита-энцефалита коз применяли иммуноферментный анализ (коммерческий тест IDEXX, Франция), который основан на использовании иммуногенного пептида трансмембранного белка (TM, ген env) и рекомбинантного белка p 28, входящего в состав капсида вируса (ген gag), в соответствии с инструкцией
производителя.
Результат исследований В
результате исследования, проведенного в животноводческих хозяйствах районов РТ, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, с использованием специфичных праймеров на ВЛ КРС и иммуноферментного анализа с антигеном gp 51 были получены следующие результаты. Методом ПЦР выявлено 39 положительных образцов (27 %) и 105 отрицательных (73 %). Методом ИФА в 30 образцах были обнаружены антитела к вирусу лейкоза КРС, 114 образцов были определены как серонегативные. В Лаишевском районе методом ПЦР выявлено положительных на вирус лейкоза 21 животных, тогда как в ИФА - 18. В Буинском районе выявлено 12 положительных проб, здесь же методом ИФА выявлено лишь 6 положительных проб. И 6 положительных проб были одинаково обнаружены методами ПЦР и ИФА в Алькеевском районе (Таблица 1).
Таблица 1 - Результаты исследования по обнаружению В ВЛ КРС
Район Республики Татарстан Количество проб Положительные образцы
ПЦР % ИФА %
Лаишевский район 48 21 44 18 38
Буинский район 48 12 25 6 12
Алькеевский район 48 6 12 6 12
Всего 144 39 27 30 21
Таблица 2 - Результаты исследования по обнаружению ВАЭК
Район Республики Татарстан Количество проб Положительные образцы
ПЦР % ИФА %
Высокогорский район 36 18 50 16 44
Черемшанский район 36 6 17 2 5
Верхнеуслонский район 36 0 0 0 0
Всего 108 24 22 18 17
Данные, полученные в результате ПЦР и иммуноферментного анализа на ВАЭК показывают, что вирус артрита-энцефалита коз обнаружился в хозяйствах Высокогорского (18 проб) и Черемшанского районов (6 проб), в хозяйстве Верхнеуслонского района данный вирус не выявлен. Всего положительных проб на ВАЭК по
исследуемым хозяйствам 24, из которых ПЦР показало 24 положительных результата, а ИФА только 18, в 6 пробах антитела против ВАЭК не обнаружились (Таблица 2).
Кроме того, в ходе данной работы проведена диагностика на клинические признаки ВАЭК. У некоторых коз из хозяйства Высокогорского района выражен
артрит суставов, шаткость походки, в других исследуемых хозяйствах клинические признаки ВАЭК не обнаружены. Важная роль в распространении ретровирусных инфекций принадлежит импорту животных [7]. Несмотря на отсутствие специфических клинических признаков, у некоторых инфицированных вирусом животных наблюдается снижение общей
резистентности организма. Частота развития патологий коррелирует с увеличением возраста животных. Ретровирусные инфекции имеют во многом схожий цикл репродукции вируса, и проявление одного ретровируса в организме животных становится подобным, как и у других представителей семейства Яе1тоут^е. Этот факт необходимо учитывать при разработке методологии диагностики ретровирусных болезней.
Заключение. По лейкозу КРС исследовано 144 пробы крови КРС из разных животноводческих районов РТ методами ПЦР и ИФА. Методом ПЦР обнаружено 39 положительных образцов, ИФА - 30 образцов. По нашим данным, высокая инфицированность наблюдалась в Лаишевском районе (21 положительных образцов из 48) и низкая - в Алькеевском районе (6 из 48). Несовпадение результатов ПЦР и ИФА могут говорить об особенностях вирусного цикла вируса лейкоза, а также о высокой чувствительности метода ПЦР. То есть, провирус лейкоза КРС можно обнаружить на ранних стадиях инфицирования, когда в организме животного антитела к нему еще не образованы. По вирусу артрита-энцефалита коз всего проанализировано 108 образцов, положительных проб по исследуемым хозяйствам 24, из которых ПЦР показало 24 положительных результата, а ИФА только 18; в 6 пробах антитела против ВАЭК не обнаружились. Это связано с особенностями процесса инфицирования ВАЭК, провирус может быть обнаружен на ранних стадиях, а антитела образуются на более поздней стадии после заражения животного и могут длительное время циркулировать в
организме инфицированных животных. Расхождение результатов ПЦР и ИФА связано с особенностями вирусного цикла ретровирусов, а также более высокой чувствительностью метода ПЦР по сравнению с ИФА. Важно отметить, что наиболее достоверным и точным диагностическим решением является комплексная диагностика ретровирусов животных, которая включала бы применение всех методов обнаружения данного заболевания, описанных нами ранее в статье. Это обеспечило бы наиболее достоверную развернутую клинико-диагностическую картину для
ветеринарного врача или исследователя, а значит, послужило бы более эффективными мерами профилактически-
оздоровительных мероприятий при борьбе с ретровирусами сельскохозяйственных животных.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Бобкова, Г. Н. Лейкоз КРС / Г. Н. Бобкова, П. П. Шамаро, Т.А. Прудникова // Вестник Брянской ГСХА. - 2011. - С.42-48. - еЬтЯЛЯУ ГО: 22913443
2. Ветеринарные правила осуществления профилактических, диагностических, ограничительных и иных мероприятий, установления и отмены карантина и иных ограничений, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию очагов лейкоза крупного рогатого скота. Приказ Минсельхоза РФ от 24.03.2021 № 156 «Об утверждении Ветеринарных правил осуществления профилактических, диагностических, ограничительных и иных мероприятий, установления и отмены карантина и иных ограничений, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию очагов лейкоза КРС» (Зарегистрировано в Минюсте РФ от 29.04.2021№63300). -ЬИ;р://риЬНса1;юп.ргауо.;оу.ги/Воситеп1;/У1е -/0001202104290036
3. Гулюкин, М. И. Межвидовая передача вируса лейкоза КРС в эксперименте / М. И. Гулюкин, Н. Г. Козырева, Л. А. Иванова [и др.] // Вопросы вирусологии. - 2015. - Т. 60. - №
5. - С. 32-37.
4. Косовский, Г. Ю. Инфекционная опасность носителей провируса вируса бычьего лейкоза и ее оценка в связи с лейкоцитозом / Г. Ю. Косовский,
B. И. Глазко, И. А. Андрейченко,
C. Н. Ковальчук, Т. Т. Глазко // Сельскохозяйственная биология. - 2016. -Т. 51. - № 4. - С. 475-482. - DOI: 10.15389/agrobiology.2016.4.475rus
5. Лукманова, Г. Р., Анализ геномов вируса артрит-энцефалита коз для поиска генетических маркеров / Г. Р. Лукманова, Н. И Хаммадов // Новости науки в АПК. -2019. - № 3 - С. 220-224.
6. Сафина, Р. Ф. Повышение чувствительности и специфичности ПЦР с использованием ДНК-маркеров, кодирующих белки p24 и gp51, в ПЦР-РВ для индикации ВЛКРС / Р. Ф. Сафина, Г. Р. Лукманова, К. В. Усольцев, Н. И. Хаммадов, Т. Х. Фаизов // Ветеринарный врач. - 2019. - № 2. - С. 814.
7. Утанова Г. Х. Применение полимеразной цепной реакции для детекции возбудителя энзоотического лейкоза в молоке коров / Г. Х Утанова, Е. С. Красникова // Вестник Ветеринарии. -2014. - № 3. - С. 27-29.
8. Gertrude, C. Bovine leukemia virus discovered in human blood / C. B. Gertrude, D. L. Anne, M. S. Hua, L. D. Chu [et al.] // BMC Infection Disease. - 2019. - № 19. - С. 297. -DOI: 10.1186/s12879-019-3891-9.
9. Kettmann, R. Genomic integration of bovine leukemia provirus: comparison of
persistent lymphocytosis with lymph node tumor from of enzootic / R. Kettmann, Y. Cleuter // Proc. Nat Acad. Sci. U S A. -1980. - № 77. - P. 2577-2581. - doi: 10.1073/pnas.77.5.2577.
10. King, A. M. Q. Taxonomy: classification and nomenclature of viruses / A. M. Q. King, J. Adams, E. B. Carstens, E. J. Lefkowitz // Ninth Report of the ICTV. Amsterdam: Elsevier, Academic Press. - 2012.
11. Konshi, M. An epidemic of caprine arthritis encephalitis in Japan: Isolation of the virus / M. Konshi // Virology. - 2004. - № 66.
- P. 911-917.
12. Li, Y. Development of TaqMan-based qPCR method for detection of caprine arthritis-encephalitis virus (CAEV) infection / Y. Li, F. Zhou, X. Li, [et al.] // Arch Virol. -2013. - № 21. - P. 35-41.
13. Suntsova, M. Molecular functions of human endogenous retroviruses in health and disease / M. Suntsova, A. Garazha, A. Ivanova [et al.] // Cell Mol Life Sci. - 2015.
- 72 (19). - P. 3653-3674.
14. Tesoro-Cruz, E. Frequency of the serological reactivity against the caprine arthritis encephalitis lentivirus gp135 in children who consume goat milk/ E. Tesoro-Cruz [et al.]// Arch Med Res. - 2009. - V. 40, 3. - P.204-207.
15. Poletti, V. Interactions between Retroviruses and the host cell genome / V. Poletti, F. Mavilio // Journal of Molecular Therapy Methods and Clinical development. -2018. - Vol. 8 - P. 31-41. - DOI: 10.1016/j.omtm.2017.10.001.
ВСТРЕЧАЕМОСТЬ РЕТРОВИРУСОВ ЖИВОТНЫХ В РАЙОНАХ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН
Сафина Р.Ф., Сальманова Г.Р., Усольцев К.В., Хаммадов Н.И., Фаизов Т.Х.
Резюме
Целью исследования являлось проведение мониторинга животноводческих хозяйств Республики Татарстан на наличие ретровирусов, а именно возбудителя лейкоза КРС (ВЛ КРС) и вируса артрита-энцефалита коз (ВАЭК). По лейкозу КРС происследовано 144 пробы крови КРС и 108 проб крови коз из разных животноводческих районов РТ методами ПЦР и ИФА. Расхождение результатов ПЦР и ИФА связаны с особенностями вирусного цикла ретровирусов, а также высокой чувствительностью данного метода при котором осуществляется ранняя диагностика провируса, когда антитела в организме животного еще не образованы. Исходя из результатов исследования наиболее достоверным и точным диагностическим решением является комплексная ранняя диагностика ретровирусов животных, которая включала бы применение всех, описанных нами в статье, методов обнаружения данного заболевания.
INCIDENCE OF ANIMAL RETROVIRUSES IN AREAS OF THE REPUBLIC OF TATARSTAN
Safina R.F., Salmanova G.R., Usoltsev K.V., Khammadov N.I., Faizov T.Kh.
Summary
The aim of present study was carry out monitoring of livestock farms in the Republic of Tatarstan for the presence of retroviruses, namely the causative agent of bovine leukemia (BLV) and caprine arthritis encephalitis virus (CAEV). A total of 144 blood samples of cattle and 108 blood samples of goats from different livestock regions of the Republic of Tatarstan were examined by PCR and ELISA methods to detect BLV. The obtained divergent results of PCR and ELISA were associated with the peculiarities of the viral cycle of retroviruses, as well as the high sensitivity of this method. The lost is used for early diagnosis of the provirus, when antibodies have not been formed in the animal's body yet. Based on the results of the study, the most reliable and accurate diagnostic solution is a comprehensive early diagnosis of animal retroviruses, which would include the use of all the methods for detecting this disease described in the present article.
