CC BY
83
и изолята КМ-1/Вг/06. Поэтому целесообразна разработка новой вакцины против БА из этого или подобных ему изоля-тов ВА. Также необходима кооперация эндемичных по БА стран в плане обмена эпизоотологической, вирусологической и энтомологической информацией.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Akashi Н., Inaba Y. Antigenic diversity of Akabane virus detected by monoclonal antibodies. Virus Res. 1997, 47, 187—196.
2. Akashi H., Kaku Y., Kong X.-G., Pang H. Sequence determination and phylogenetic analysis of the Akabane bunyavirus S RNA genome segment. J Gen Virol, 1997, 78. 2847—2851.
3. Bak U.B., Lim C.H., Cheong C.K. et al. Outbreaks of Akabane disease of cattle in Korea. Korean J Vet Res, 1980, 20, 65—78.
4. Brenner J., Tsuda Т., Yadin H., Kato T. Serological evidence of Akabane virus infection in northern Israel in 2001. J Vet Med Sci, 2004, 66, 441—443.
5. Bridgen A., Weber F., Fazakerley J.K., Elliott R.M. Bunyamwera bunyavirus nonstructural protein NSs is a nonessential gene product that contributes to viral pathogenesis. PNAS USA, 2001, 98, 664—669.
6. Inaba Y., Kurogi H„ Omori T. Akabane disease: epizootic abortion, premature birth, stillbirth and congenital arthroglyposis-hydranencephaly in cattle, sheep and goats caused by Akabane virus. Aust Vet J, 1975, 51, 584—585.
7. Inaba Y., Matumoto M. Akabane virus. In: Dinter Z., Morein B. Virus infections of ruminants. (Eds). -Amsterdam, Netherlands: Elsevier Sci Publ, 1990, 467—480.
8. Kirkland P.D.. Barry R.D., Harper P.A... Zelski R.Z. The development of Akabane virus-induced congenital abnormalities in cattle. Vet Rec. 1988, 122, 582—586.
9. Kobayashi Т., Yanase Т., Yamakawa M. et al. Genetic diversity and reas-sortments among Akabane virus field isolates. Virus Res, 2007, 130, 162—171.
10. Kohl A., Clayton R.F., Weber F. et al. Bunyamwera virus nonstructural protein NSs counteracts interferon regulatory factor 3-mediated induction of early cell death. J Virol, 2003, 77, 7999—8008.
11. Kurogi H.. Inaba Y., Takahashi E. et al. Epizootic congenital arthrogryposis-hydranencephaly syndrome in cattle: isolation of Akabane virus from affected fetuses. Arch Virol, 1976, 51, 67—74.
12. Kurogi H., Inaba Y., Takahashi E. et al. Experimental infection of calves with Akabane virus. Bull Natl Inst Anim Health, 1977, 75, 1—8.
13. Kurogi H., Inaba Y., Takahashi E. et al. Development of inactivated vaccine for Akabane disease. Natl Inst Anim Health Q, 1978, 18, 97—108.
14. Kurogi H., Inaba Y., Takahashi E. et al. An attenuated strain of Akabane virus: a candidate for live virus vaccine. Natl Inst Anim Health Q, 1979, 19, 12-22.
15. Lee J.K.. ParkJ.S., ChoiJ.H. et al. Encephalomyelitis associated with Akabane virus infection in adult cows. Vet Pathol, 2002, 39, 269—273.
16. LiaoY.K., Lu Y.S., GotoY., Inaba Y. The isolation of Akabane virus (Iriki strain) from calves in Taiwan. J Basic Microbiol, 1996, 36, 331—39.
17. Matsumori Y., Inai K„ Yanase T. et al. Serological and genetic characterization of newly isolated Peaton virus in Japan. Arch Virol, 2002, 147, 4011—410.
18. Metselaar D„ Robin Y. Akabane virus isolated in Kenya. Vet Rec, 1976, 99, 86.
19. Miyazato S., Miura Y., Hase M. et al. Encephalitis of cattle caused by Iriki isolate, a new strain belonging to Akabane vims. Jpn J Vet Sci, 1989, 51, 1281—136.
20. Ogawa Y„ Kato K., Tohya Y., Akashi H. Sequence determination and functional analysis of the Akabane virus L RNA segment. Arch Virol, 2007, 152, 9711—979. 21.0yaA., OkunoT., Ogata T. et al. Akabane, a new arbovirus isolated in Japan. Jpn J Med Sci Biol, 1961, 14, 1011—108.
22. Page R.D.M. TreeView: an application to display phylogenetic trees on personal computers. Comput Appl Biosci, 1996, 12, 3571—358.
23. Parsonson I.M., McPhee D.A. Bunyavirus pathogenesis. In: Maramorosch K. et al. (Eds). Advances in virus research, v. 30. -Orlando, Fla: Acad Press, 1985, 2791—316.
24. Saitou N.. Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Bio Evol, 1987, 4, 406-425.
25. Schmaljohn C.S., Nichol S.T. Bunyaviridae. In: Knipe D.M., Howley P.M. (Eds).. Fields Virology, 5th Ed. - Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2007, 17411—1789.
26. Sellers R.F., Mellor P.S. Temperature and the persistence of viruses in Culicoides spp. during adverse conditions. Rev Sci Tech OIE, 1993, 12, 7331—755.
27. Shi X., Kohl A., Leonard V.H.J, et al. Requirement of the N-terminal region of orthobunyavirus nonstructural protein NSm for virus assembly and morphogenesis. J Virol, 2006, 80, 80891—8099.
28. Taylor W.P., Mellor P.S. The distribution of Akabane virus in the Middle East. Epidemiol Infect, 1994, 113, 1751—185.
29. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 1994, 22. 46731^1680.
30. WeberF., BridgenA., Fazakerley J.K. et al. Bunyamwera bunyavirus nonstructural protein NSs counteracts the induction of alpha/beta interferon. J Virol, 2002, 76, 79491—7955.
31. Yanase Т., Yoshida K„ Ohashi S. et al. Sequence analysis of the medium RNA segment of three Simbu serogroup viruses, Akabane, Aino and Peaton viruses. Virus Res, 2003, 93, 631—69.
32. Yanase Т., Kato Т., KuboT. et al. Isolation of bovine arboviruses from Culicoides biting midges (Diptera: Ceratopogonidae) in southern Japan: 19851— 2002. J Med Entomol, 2005, 42, 631—67.
33. Yoshida K., Tsuda T. Rapid detection of antigenic diversity of Akabane virus isolates by dot immunobinding assay using neutralizing monoclonal antibodies. Clin Diagn Lab Immunol. 1998. 5, 1921—198.
34. Yamakawa M., Yanase T„ KatoT., Tsuda T. Chronological and geographical variations in the small RNA segment of the teratogenic Akabane virus. Virus Res, 2006, 121, 84—92.
35. UchidaK., Murakami T., Sueyoshi M. et al. Detection of Akabane viral antigens in spontaneous lymphohistiocytic encephalomyelitis in cattle. J Vet Diagn Invest, 2000, 12, 518—524.
R. Kono, M. Hirata, M. Kaji, Y. Goto, S. Ikeda, T. Yanase, T. Kato, S. Tanaka, T. Tsutsui, T. Imada, M. Yamakawa. Bovine epizootic encephalomyelitis caused by Akabane virus in southern Japan.
УДК 619:616.72-022-022.6:636.39
Выделение вируса артрита-энцефалита коз и разработка серологического метода диагностики
инфекции
Г.Д. Сидельников, Д.В. Колбасов,
С.Ж. Цыбанов, ВНИИВпМ (г. Покров, Россия)
Ключевые слова: артрит-энцефалит коз, лентивирус, серологическая диагностика, симптоматика
Сокращения: АЭК — артрит-энцефалит коз; ВАЭК — вирус артрита-энцефалита коз; РДП — реакция диффузионной преципитации; СМК — синовиальная мембрана козлят
Введение
АЭК представляет собой симптомокомплекс, вызываемый лентивирусом (сем. Яе1хстп<1ае). Эта инфекция характеризуется длительным инкубационным периодом, хроническим течением, признаками поражения нервной системы, легких, молочной железы и суставов с прилегающими тканями либо пожизненным вирусоносительством без проявления клинических признаков [4, 7, 11).
К вирусу АЭК восприимчивы домашние козы и овцы 110]. Экономический ущерб от болезни обусловлен снижением молочной продуктивности, а также выбраковкой клинически больных животных и вирусоносителей. Персистенция ВАЭК сопровождается появлением антител у инфицированных коз [5, 7|. Выявление и выбраковка серопозитивных животных, являющихся основным источником вируса, позволяет предотвращать распространение инфекции и оздорав-ливать неблагополучные по ней стада.
АЭК диагностировали во многих странах мира, в т. ч. и России [2,3, 6, 8,9, 11]. Однако для нашей страны эта болезнь все еще является экзотической и малоизученной.
Нами предпринята попытка выделения ВАЭК и использования РДП для выявления антител к нему. Работа включала изоляцию вируса от больных животных, получение адекватной лабораторной модели для его накопления, изготовление антигена, а также апробацию РДП для серологического обследования коз.
Материалы и методы
Культура клеток. Культуру клеток СМК получали выращиванием эксплантатов синовиальной оболочки [4] на среде БМЕМ с 10 % фетальной сыворотки крови КРС. На 3... 12-м пассажах субкультивирования ее использовали для изоляции и репродукции ВАЭК.
Вирусы. Штамм 75С-63 ВАЭК любезно предоставила д-р Л. Херманн (США). Изолят «Тверской» выделили сокуль-тивированием культуры клеток СМК с лимфоцитами и моноцитами крови козы, естественно инфицированной ВАЭК.
Антиген для РДП. Вирусный антиген для РДП получали концентрированием осветленной культуральной жидкости культуры клеток СМК, зараженной штаммом 75С-63 и изо-лятом «Тверской» ВАЭК.
Постановка РДП. Раствор агарозы (0,7 %) готовили в 0,05 М трис-НС1 буферном растворе с 8 % хлорида натрия (рН 7,2...7,4). Расплавленный гель разливали по 15 мл в чашки Петри диаметром 10 см. После застывания в геле с помощью штампа вырезали розетки лунок (в каждой — 6 периферических и 1 центральную). Диаметр лунок составлял 8 мм, периферические были удалены от центральной на 3 мм. После заполнения лунок чашки закрывали крышками и помещали во влажную камеру при температуре 17...25 "С. Реакцию учитывали в крестах (от + до ++++) через 48 и 72 ч [1 ].
Животные. Для апробации РДП и изучения распространения инфекции исследовали сыворотку крови и молозива коз, содержавшихся на ферме Ленинградской области (поголовье импортировано из Германии), — 305 проб, на ферме Тверской области — 58 проб, в Московском зоопарке (привезены из Чехии и Австрии) — 6 проб, в частном хозяйстве (г. Покров) — 9 проб, в виварии института — 7 проб (в т. ч. от двух козлят, экспериментально зараженных штаммом 75С-63 вируса АЭК).
Результаты и обсуждение
После убоя животных собирали фрагменты синовиальной мембраны запястных суставов, которые в последующем измельчали на кусочки, не превышающие 2 мм в диаметре. Их трижды промывали питательной средой ОМЕМ с антибиотиками и переносили в культуральные матрасы с добавлением смеси той же среды и 10 % фетальной сыворотки крови КРС. Матрасы инкубировали в атмосфере с повышенным до 5 % содержанием С02 при 37 °С в течение 5 дн.
На 4...5 сутки культивирования эксплантатов отмечали интенсивный рост клеток по периметру прикрепившихся тканевых фрагментов. В течение последующих 5...7 дн выросшие колонии клеток фибробластиого типа образовывали монослой.
Пассирование культуры клеток проводили бесцентрифужным способом. Монослой диспергировали смесью 0,25 %-го раствора трипсина и 0,02 %-го раствора версена (1:1), подогретой до 37°+ 0,1 °С.
На первых 2...3 пассажах коэффициент пересева составлял 1 :2, но на уровне 3...8 пассажей его можно было увеличить до 1 : 3...1 : 4.
В доступной нам литературе отсутствует информация об изоляции ВАЭК в нашей стране. Необходимо отметить, что выделить этот вирус из патологического материала по схемам, принятым для возбудителей остро протекающих болезней, сложно. Ввиду крайне низкого содержания агента в пораженных органах и тканях приходится прибегать к различным приемам, сводящимся к его концентрированию или сокультиви-рованию инфицированных им клеток с чувствительными культурами клеток. ВАЭК, «избавившись» от сдерживающего влияния иммунной системы организма хозяина, активизируется по мере созревания и дифференцировки клеток-вирусо-носителей (происходит переход из интегрированной с геномом клетки провирусной ДНК в полноценные вирионы с РНК) и вызывает продуктивную инфекцию, индикатором ко-
торой можно считать феномен симпластообразования в чувствительной к нему культуре клеток.
ВАЭК изолировали из лимфоцитов и моноцитов крови естественно инфицированного животного посредством их сокульти-вирования с культурой клеток СМК. Лимфоциты и моноциты получали центрифугированием крови в градиенте плотности фикола (1,077 г/см3). Суспензию среды БМЕМ с лимфоцитами и моноцитами добавляли к суспензии клеток СМК.
В ходе инкубирования зараженной культуры клеток в первых двух пассажах цитопатические изменения отсутствовали. На третьем пассаже па 5...6-е суткн в монослое появились многоядерные симпласты. В последующем их число и размеры увеличивались, а количество ядер в них доходило до 20...30. Выделенный изолят вируса АЭК назвали «Тверским».
Инфекционный титр изолята «Тверской» и штамма 75С-63 ВАЭК в культуре клеток СМК достигал Ю50ТЦД50/см3 и 1060 ТЦД-0/см3 соответственно.
Вируссодержащую культуральную жидкость подвергали трем циклам замораживания (при -20 °С) и оттаивания (при 4 °С). Осветленную низкоскоростным центрифугированием (2 тыс. об/мин в течение 20 мин.) культуральную жидкость концентрировали в 50...100 раз диализом против сухого по-лиэтиленгликоля 6000. Полученный концентрат использовали в РДП в качестве антигена.
В РДП исследовали сыворотку крови и молозиво коз из источников, перечисленных в разделе «Материалы и методы». Полученные результаты представлены в таблице
Результаты исследования сывороток крови и молозива коз в РДП на наличие антител к ВАЭК
Хозяйство Порода Всего Показания РДП
проб + -
Ленинградская область Зааненская 305 0 305
Тверская область Зааненская и англо-нубийская 58 41 17
Московский Зааненская 6 5 1
зоопарк
Частное хозяйство (г. Покров) Аборигенные козы (беспородные) 9 9 0
Виварий Зааненская 7 5 2
института
Всего 385 59 325
Группа коз, завезенных из Германии (305 гол.), в период проведения обследований была клинически здоровой. В остальных обследованных поголовьях коз присутствовали животные с артритами, симптомами поражения дыхательной системы (кашлем, слизистыми истечениями из носа), нервной системы (парезами), а также истощением, которое развивалось, несмотря на обильное кормление. Указанные признаки отмечали у животных старше года. Одновременного поражения всех вышеперечисленных систем органов мы не наблюдали (за исключением 6-летней козы, у которой диагностировали артритную форму болезни, сочетавшуюся с неврологической симптоматикой).
Заключение
Впервые в нашей стране изолировали ВАЭК. Полевой изолят «Тверской» ВАЭК адаптировали к культуре клеток СМК. Испытания тест-системы РДП, созданной на основе культу-рального антигена этого изолята, показали, что ею можно пользоваться для выявления антител к ВАЭК в пробах сывороток крови и молозива инфицированных животных.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Валихов А.Ф. Сывороточные преципитируюицие антитела к онкорнавиру-су типа С крупного рогатого скота. Ветеринария, 1976, 1, 44—46.
2. Волкова И.Ю. Эпизоотологический мониторинг и совершенствование
мер борьбы с артритом-энцефалитом коз в РФ. Авт. дис. канд. вет. наук. -Покров, 2008, 25 с.
3. Angelopoulou К., Karanikolaou К., Papanastasopoulou М. First partial characterization of small ruminant lentiviruses from Greece. Vet Microbiol, 2005, 109, 1—2, 1—9.
4. Crawford T.B.. Adams S„ Cheevers W.P., Cork L.C. Chronic arthritis in goats caused by a retrovirus. Science, 1980, 207, 997—999.
5. Coackley W., Smith V.W., Houwers D.J. Preparation and evaluation of antigens used in serological tests for caprine syncytial retrovirus antibody in sheep and goat sera. Vet Microbiol, 1984. 9. 581—586.
6. Konishi M„ Tsuduku S., Haritani M. et. al. An epidemic of caprine arthritis encephalitis in Japan: isolation of the virus. J Vet Med Sci, 2004, 66, 8, 911—917.
7. NarayanO., Clements J.E. Biology and pathogenesis of Lentiviruses. J Gen Virol, 1989, 70, 1617—1639.
8. Ngatia T.A., Njenga M.J.. Mbuthia P.G. Occurrence and pathology of caprine arthritis — encephalitis in young goats in Kenya. Bull Anim Health Prod Africa, 2005, 53, 1, 77—83.
9. Oliver R.E., Adams D.S., GorhamJ.R. et al. Isolation of caprine arthritis encephalitis virus from a goat. N Z Vet J, 1982, 30, 10, 147 —149.
10. Shah C., Huder J.B., Buni J. et al. Direct Evidence for Natural Transmission of Small-Ruminant Lentiviruses of Subtype A4 from Goats to Sheep and Vice Versa. J Virol, 2004, 78, 14, 7518—7522.
11. Surman P.G., Daniels E., Dixon B.R. Caprine arthritis-encephalitis virus infection of goats in Sougth Australia. Aust Vet J, 1987, 64, 9, 266—271.
G.D. Sidelnikov, D.V. Kolbasov, S.G. Cybanov. Isolation CAEV and development serological method for diagnostic this infection.
УДК 619:616-092:612.017.1-008.64-076:636.22/28
Применение ПЦР для выявления вируса иммунодефицита КРС у животных в крови и пробах мяса
В.Г. Бурба1, Д.С. Меграбян1, В.В. Колотвин1, Н.Ф. Гриненко2, А.Д. Альтштейн2, А.Ф. Валихов1
1 Московский государственный университет прикладной биотехнологии (г. Москва)
2 Институт биологии гена РАН (г. Москва)
Ключевые слова: культура клеток, крупный рогатый скот, ретровирусы
Сокращения: ВИК — вирус иммунодефицита КРС; ВПК — вирус лейкоза КРС; КРС — крупный рогатый скот; ЛЭК — легкое эмбриона коровы; ПЦР — полимеразная цепная реакция: ЦПД — цитопатическое действие
Введение
Ретровирусы — уникальное семейство РНК-содержащих вирусов, обладающее способностью синтезировать ДНК с помощью специализированного фермента (обратной транскриптазы). Данное свойство позволяет им интегрировать собственную нуклеиновую кислоту в геном клеток хозяина, что фактически делает невозможным излечение последнего. Среди млекопитающих ретровирусы распространены особенно широко [2]. У КРС инфекцию могут вызывать 2 ретровируса — ВЛК и ВИК.
Вирусную природу лейкоза КРС установили в 1970-х годах. К настоящему моменту изучены свойства возбудителя, широта его распространения в разных странах, разработаны методы диагностики и рекомендации по оздоровлению неблагополучных хозяйств. ВИК изучен хуже. До сих пор остается неизвестным его патогенетический потенциал, способы передачи и степень распространения в стадах КРС. Его обнаружили в скотоводческих хозяйствах США, Аргентины, Японии, Канады, Германии, Турции, Южной Кореи, Замбии и др. На территории России эту инфекцию диагностировали недавно [ 11. Установки, что в ряде хозяйств Московской области шпрота распространения ВИК в среднем составляет 40 %, в то время как благополучие по этой инфекции других субъектов Российской Федерации остается неизвестным. Чтобы решить эту задачу, требовался чувствительный и специфичный метод диагностики, позволяющий выявлять ВИК непосредственно в крови животных. В настоящее время наиболее универсальным методом обнаружения вирусов в биологических объектах является ПЦР. Для подтверждения специфичности показаний ПЦР, разработкой которой мы занялись, был необходим положительный контроль. С этой целью трансфицировали плаз-миду с полным геномом ВИК в культуру клеток ЛЭК. В статье описано ЦПД, которое вызывал агент в данной клеточной системе. Приведены результаты исследования в ПЦР крови КРС из нескольких хозяйств Ставропольского края и Вологодской области, а также проб импортированного мяса.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 12262-офи.
Материалы и методы
Вирус. Культуру Е. coli, трансформированную плазмидой pBIV127 с полным геномом ВИК R-29, получили из коллекции Национального института здоровья США. Плазмидой пользовались для трансфицирования культуры клеток ЛЭК.
Культура клеток. Диплоидную линию клеток ЛЭК получили из первично-трипсинизированиой (рисунок). После 30 пассажей расплодку этой культуры перенесли на хранение в жидкий азот.
ПЦР. ДНК из культуры клеток и цельной крови КРС выделяли с помощью набора для универсальной подготовки проб ДНК Diatom DNA Prep 100 (Лаборатория Изоген, Россия). ПЦР ставили с применением наборов лиофилизиро-ванных смесей PCR core и оригинальных праймеров gagl/ gag2 и blv2/blvl0, предназначенных для обнаружения прови-русов ВИК и ВЛК соответственно. Продукты реакции фер-ментативно секвенировали с применением дидезоксирнбо-нуклеотидов. При анализе продуктов секвенирования пользовались программой LaserGene MegAlign_v6.
Тестированный материал. Образцы ДНК выделили из цельной крови КРС шести скотоводческих хозяйств Ставропольского края (120 проб) и одного экспериментального хозяйства Вологодской области (30 проб), а также из 64 партий говядины, импортированной из стран Европейского Союза, Восточной Европы и Южной Америки.
ЦПД в культуре клеток ЛЭК после траксфекции плазмид с полным геномом ВИК
