CC BY
6
вляется экстракцией хлороформом. Метод проверен на сильно загрязненных сточных водах. Полученные результаты вполне удовлетворительны.
ЛИТЕРАТУРА
Лурье Ю. Ю., Панова В. А. Завод, лабор., 1963, № 3, с. 293.— Казаков Е. И., Воронина Т. Б., Любимова 3. В. и др. Химическая переработка смол. М., 1965.
Поступила 7/1V 1967 г.
УДК 576.851.555.07
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ CL. PERFRINGENS В ОБЪЕКТАХ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ
Г. И. Сидоренко, Ю. П. Пивоваров
Кафедра общей гигиены II Московского медицинского института им. Н. И. Пирогова
Проводимое в ряде стран широкое изучение клостридиальных инфекций, в особенности пищевых токсикоинфекций, вызываемых С1. рег-fringens, ставит перед гигиенистами ряд методических задач. К ним относится, в частности, разработка методики количественного определения CI. perfringens в различных объектах внешней среды. Для этой цели предложено много «элективных» сред, из которых до последнего времени наиболее широко использовалась среда Вильсона — Бле-ра, основанная на способности CI. perfringens восстанавливать сульфит (Angelotti с соавторами; Willis и Path, и др.). Однако эта среда имеет низкую специфичность. Для устранения этого недостатка рекомендован ряд модификаций среды Вильсона — Блера, основанных на включении в ее состав веществ, чаще антибиотиков, препятствующих размножению иной, кроме CI. perfringens, микрофлоры (Bladel и Green-berg; Gibbs и Freame; Hall с соавторами; Marshall с соавторами). К модифицированным средам упомянутых выше авторов относятся, в частности, сульфит-полимиксин-сульфодиазиновая (SPS), дифференциальная усиленная клостридиальная (DRSM) и др. Однако наиболее специфичной для С1. perfringens, по общему мнению, является предложенная Marshall с соавторами триптон-сульфит-неомициновая среда (TSN).
Вместе с тем ни среда TSN, ни другие предложенные среды для количественного определения CI. perfringens не нашли применения в нашей стране. Это связано, вероятно, с рядом обстоятельств. Немаловажную роль здесь играют, например, разноречивые данные о составе этих сред (одного наименования), а также то, что ряд компонентов предлагаемых сред не выпускается нашей промышленностью. Необходимо, кроме того, отметить, что приведенное авторами в рецептах питательных сред весовое содержание антибиотиков затрудняет приготовление этих сред, так как отечественные антибиотики чаще дозируются только в единицах действия (ЕД).
Мы ставили перед собой задачу модифицирования среды TSN на основе доступных компонентов, проверки ее специфичности и разработки простой методики количественного определения CI. perfringens в различных объектах внешней среды. Поскольку, согласно литературным данным, подтвержденным одним из нас в предыдущих исследованиях (Ю. П. Пивоваров) CI. perfringens наиболее хорошо растет при
1 Кандидатская диссертация. Москва, 1966.
45—46°, все работы, описанные в настоящем сообщении, проводились именно при этой температуре.
Нами был приготовлен ряд сред; в качестве пищевого компонента в них были взяты обычно используемые в нашей стране среды для культивирования анаэробных бактерий: казеиново-грибная среда (рецепт Института им. Н. Ф. Гамалеи), бульон Хоттингера, бульон Поуп и сухая китопептонно-дрожжевая среда (КПД), предложенная сотрудниками Института им. Н. Ф. Гамалеи Л. Г. Ивановой, Т. И. Сергеевой, Н. В. Плоскиревым и И. И. Ситниковой. На 1 л каждой из использованных сред непосредственно перед разливкой добавляли следующие компоненты (обоснование количества антибиотиков приведено ниже): 5 мл 10% раствора сернокислого (закионого) железа, 10 мл 10% раствора сульфита натрия (кристаллического), 200 ЕД/мл поли-миксина, 50 ЕД/мл неомицина. Все перечисленные компоненты готовили отдельно на стерильной дистиллированной воде. Как показали наши исследования, при осторожном приготовлении отпадает необходимость в дополнительной стерилизации растворов сульфита натрия и сернокислого железа. Жидкая среда такого состава сохранялась в холодильнике без значительного снижения эффективности до 5—7 дней. При приготовлении плотных питательных сред добавляли агар из расчета 1,5% и устанавливали рН среды, равное 7,2±0,1.
Для проверки эффективности этих сред использовали 60 штаммов CI. perfringens разного происхождения, в том числе 6 штаммов, выделенных из почвы, 5 из воды, 10 из продуктов питания, 13 из faeces здоровых и больных людей, 7 штаммов от больных животных и 19 штаммов, выделенных в случаях пищевых токсикоинфекций у людей. Результаты изучения роста CI. perfringens на описанных выше средах представлены в табл. 1. Как видно из табл. 1, наиболее быстрый и интенсивный рост CI. perfringens наблюдался на среде, в которой в каче-
Т а б л и ц а 1
Характеристика роста С1. регГпг^епв на сульфит-полимиксин-неомициновой среде с разными питательными^ основами (в % к количеству исследованных штаммов)
Питательная основа
Показатель роста среда кпд казеиново-грибная среда бульон Хоттингера бульон Поуп
Интенсивность роста (в 1 ед/мл за сутки) 108 и выше 10е—108 Ниже 10е 95 5 67 23 10 7,5 80 12,5 70 30
Наглядность роста по реакции почернения среды Интенсивное, всей среды ......... Средней интенсивности Почернение осадка и незначительное всей среды....... 100 77,5 22,5 75 25 65 35
Время наступления почернения среды До 4 часов До 8 » Более 8 » 72,5 27,5 32,5 62,5 5 20 80 23 77
стве питательной основы использовали среду КПД. На этой среде все штаммы С1. perfringens вызывали интенсивное почернение уже к 4—8-му часу выращивания при 45—46°. При этом происходило бурное, интенсивное размножение всех штаммов С1. perfringens. Высокая эффективность среды КПД для выращивания токсинообразования С1. регГпп-gens была продемонстрирована в предыдущих исследованиях, проведенных одним из нас (Ю. П. Пивоваров). Остается только пожалеть, что эта среда, несмотря на множество положительных отзывов о ней, до сих пор не вышла за рамки опытных производственных партий.
Таким образом, сульфит-полимиксин-неомициновая (СПН) среда, в которой в качестве питательной основы используется среда КПД или казеиново-грибная, может быть с успехом использована в качестве индикаторной среды для демонстрации роста CI. perfringens. В качестве питательной основы могут быть взяты и другие среды, но с худшим результатом. Применение среды КПД особенно целесообразно в тех случаях, когда необходимо получить быстрые результаты.
Учитывая разноречивые литературные данные о количественном содержании антибиотиков в среде TSN, в частности неомицина, — от 50 мкг/мл (50 ЕД), как утверждают Hall с соавторами, до 200 мкг/мл (200 ЕД) — мы исследовали влияние разного содержания полимиксина и неомицина в среде, составленной на основе казеиново-грибной, на рост С1. perfringens. Использовали среды с 4 количественными градациями содержания антибиотиков. На этих средах изучали частоту и интенсивность обсеменения Cl. perfringens почвы, продуктов питания и faeces здоровых людей (всего 60 проб) путем параллельного посева проб на среды с разным содержанием антибиотиков. Результаты изучения представлены в табл. 2. Как видно из табл. 2, наиболее высокий
Таблица 2
Влияние содержания полимиксина и неомицина на обсеменения CI. perfringens объектов
внешней среды
Результаты исследования
Уровень содержания антибиотиков (в ЕД/мл)
полимиксин неомидин
200 50
200 100
400 50
400 100
Процент выделения
Титр
к
S X га
ш
|
Почва Продукты питания Faeces Почва
Продукты питания Faeces
100
27 87
10" 5— Ю-"
87
17 77
ю-2—10" 5
97
23 87
10-з_ю-5
70
13 67
10-2—10-1
До Ю-4 10-3—10-5
До 10"2 10-з_10"4
До Ю"3 Ю-З—ю-«
До Ю-2 10-2—Ю-з
процент обсеменения и несколько более высокие титры С1. perfringens отмечены при посеве на среды с содержанием неомицина 50 ЕД и полимиксина от 200 до 400 ЕД/мл. Увеличение количества неомицина до 100 ЕД/мл приводило к резкому снижению как процента обнаружения С1. perfпngens, так и его титра (Р<0,01). Некоторое замедление роста С1. perfпngens наблюдается и при увеличении содержания полимиксина до 400 ЕД/мл.
Следовательно, наиболее целесообразным для среды СПН является содержание полимиксина 200 ЕД/мл и неомицина 50 ЕД/мл. что_ соответствует принятой нами прописи ее, приведенной выше. С целью проверки специфичности новой питательной среды для С1. регГг^епэ мы определяли титр этого микроорганизма при параллельном
Таблица 3
Сравнительное изучение специфичности среды Вильсона — Блера и сульфит-полимиксин-неомициновой среды для С1. регЕпп^еги
Среда Титр по черным колониям Количество видов анаэробов на этих чашках Соотношение Cl. pertrin-gens и других анаэробов Истинный титр
Вильсона —
Блера 1.7Х10"5 6—7 3/7 5,IX 10"4
СПН . . . 5,8Х 10"4 2—3 3/2 3,5X10" 4
посеве 30 проб почвы, faeces и продуктов питания на агар Вильсона — Блера и СПН агар. Результаты этих исследований представлены в табл. 3. Как видно из табл. 3, добавление к среде антибиотиков препятствует размножению иных микроорганизмов (кроме CI. perfingens), что проявляется в уменьшении видов их, растущих на ней, и в увеличении относительного количества CI. perfingens по отношению к другим анаэробам. На этой среде титр по выросшим черным колониям мало отличается от истинного титра CI. perfringens, полученного путем расчета с применением поправочного коэффициента. В то же время на среде Вильсона — Блера эти титры отличаются довольно значительно.
Таким образом, СПН среда по сравнению со средой Вильсона — Блера более специфична для CI. perfringens, хотя и не лишена полностью ее недостатков, так как и на этой среде могут расти не только С1. perfringens, но и некоторые другие сульфитвос-станавливающие анаэробы, хотя и в относительно меньшем количестве. На СПН среде титр CI. perfringens может быть приравнен к титру по черным колониям, так как наблюдающаяся разница в практических целях не играет существенной роли. Если же исходить из определения титра по разведениям на жидких средах, рекомендуемого некоторыми исследователями (Barnes с соавторами; Gibbs и Freame) как наиболее простое и достоверное, то эти титры будут по существу идентичны.
В заключение мы проводили разработку простой методики выделения и количественного определения CI. perfringens с использованием модифицированной СПН среды. На основании исследований мы пришли к выводу о целесообразности использования методики, показанной на рисунке. Как видно из рисунка, применение жидкой СПН среды, разлитой в пробирки по 9 мл, позволило исключить этап предварительного приготовления разведений, так как последнее достигается непосредственно в пробирках со средой. Для дозированной разливки среды в пробирки мы использовали систему, состоящую из бюретки с 2 кранами, соединенной колбой со средой. Эту систему перед разливкой среды стерилизовали в автоклаве текучим паром в течение часа. Предварительное нанесение на бюретку делений (по 9 мл) помогало быстро и точно производить разлив среды по пробиркам, а применение обычных микробиологических методов асептики дало возможность сохранить стерильность среды. Неоспоримым достоинством СПН среды является не только простое, быстрое и достаточно точное определение количества CI. perfringens, но также и то, что последующее выделение с нее чистых культур обычно облегчено из-за уменьшения количества
Методика выделения и количественного определения С1. регГитщепБ в объектах внешней среды.
выросших анаэробов и относительного количественного превосходства С1. регГг1п^епз над другими микроорганизмами, растущими в этой среде.
Для выделения чрстых культур С1. perfringens производились посевы на сахарно-кровяной агар по Цейсслеру с последующей инкубацией в условиях неполного вакуума (400—600 мм рт. ст.) при 38—39° в течение 16—18 часов. Следует особо остановиться на приготовлении кровяного агара. В литературе отмечаются противоречия в отношении гемолитической активности штаммов С1. perfringens. выделенных при пищевых отравлениях у людей. Описаны штаммы, не дающие гемолиза на кровяном агаре, штаммы, вызывающие незначительный р-гемолиз,
Таблица 4
Гемолитическая активность и форма роста на кровяном агаре (в % к количеству исследованных штаммов)
Кровяной агар с кровью Гемолиз Форма роста
сильный слабый отсутствует S О R M
Лошадь........ 42,9 37,1 20 20 62,9 14,4 2,7
Крупный рогатый скот 57,1 31,5 11,4 31,5 59,8 8,7 —
Баран ........ 71,4 25,7 2,9 28,8 45,5 25,7 —
Человек ....... 68,5 22,8 8,7 22,8 48,5 20 8,7
и гемолизирующие штаммы, дающие а- и ß-гемолиз при росте на кровяном агаре. При этом разные исследователи используют при приготовлении кровяного агара кровь лошади, барана, кролика, человека и т. д. Можно было предположить, что разноречивые данные о гемолитической активности штаммов Cl. perfringens, вызвавших пищевые отравления, связаны с различием их гемолитической активности в отношении крови разных животных и человека. Для проверки этого предположения мы изучали характер роста 35 штаммов Cl. perfringens, выделенных в случаях пищевых токсикоинфекций, на кровяном агаре с кровью лошади, крупного рогатого скота и барана, а также с человеческой кровью.
Оказалось, что гемолитическая активность штаммов Cl. perfringens находится в зависимости от используемой крови (табл. 4). Отмечалась разница и в форме роста Cl. perfringens на этих средах, что, кстати, объясняет и разноречивые данные литературы относительно штаммов Cl. perfringens, выделенных при пищевых токсикоинфекциях.
Результаты исследований позволяют нам рекомендовать для количественного определения Cl. perfringens жидкую СПН среду, приготовленную на основе среды КПД или казеиново-грибной с добавлением полимиксина (200 ЕД/'мл) и неомицина (50 ЕД/мл). Для выделения чистых культур Cl. perfringens следует использовать сахарно-кровяной агар по Цейсслеру с кровью барана или человеческой кровью.
ЛИТЕРАТУРА
Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней. М-1964.— Angelot ti R., Hall H., Foter M. et al. Quantisation of Cl. perfringens in Foods. J. appl. Microbiol., 1962, v. 10, p. 193.— Barnes E. M., Despanl J. E., I n g r a m M., J. appl. Bact., 1963, v. 26, p. 415. — В 1 a d e 1 В. O., G г e e n b e r g R. A.. J. appl. Microbiol., 1965, v. 13, p. 281.— Gibbs B. M., Freame В., J. appl. Bacte-riol., 1965, v. 28, p. 95. — Hall H., Angelotti R., Lewis K. et al. J. Bact., 1963, Bd 85, S. 1094,— Marshall R. S., Sternbergen J., McClung L. C., J. appl. Microbiol., 1965, v. 13, p. 559,— Willis A. T., Path M. C„ Lab. Pract., 1965, v. 14, p. 690.
Поступила 28/11 1967 г.
