CC BY
8
и в конечном счете к дизадаптацни органа. Реакции повреждения и адаптационные сдвиги имеют отчетливо выраженную топическую характеристику.
ЛИТЕРАТУРА. Б'абанов Г. П. Механизмы и границы адаптации при действии на организм неэлектролитов как химических факторов ^интенсивности. Ярославль, 1973.
Поступила 30/1V 1976 г.
УДК 615.9.07
Канд. мед. наук М. Б. Шпирт
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЯДОВ В КУЛЬТУТЕ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
Киргизский научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии и гигиены,
г. Фрунзе
Все более широкое применение в народном хозяйстве синтеза химических соединений вызывает необходимость в моделях, позволяющих за короткий срок определить свойства вещества и сделать заключение о целесообразности обстоятельного его исследования. Одна из таких моделей — культура клеток. Имеющиеся данные позволяют считать, что в культуре сохраняются контрольные механизмы, регулирующие рост клеток и их метаболизм. Поэтому процессы, ведущие к нарушению этих механизмов и появлению в клетках всевозможных изменений, протекают в формах, близких к имеющим место в живом организме (Н. П. Дубинин; Я- Е. Хесин).
Количественная токсикологическая оценка ядов при однократном и многократном действии их на культуры клеток основана на учете характеристики роста клеток и связанных с ним явлений. Она складывается из следующих этапов: культивирование клеток и внесение исследуемых веществ, количественная оценка морфологических изменений клеток в пробирках, камере Горяева и изучение цитостатических и цитотоксических свойств ядов в препарате..
Наиболее целесообразным с практической точки зрения является использование первично эксплантированной (эмбриональные фибробласты человека) или перевиваемых (клетки амниона человека, штамм клеток «Detroit») культур клеток, которые готовятся по общепринятой методике (М. И. Леви; Р. С. Дрейзен; О. Г. Анджапаридзе и соавт.; В. Д. Соловьев и Т. А. Бектемиров; Д. Пол).
Маточную культуру исследуемых клеток (200—250 тыс. в 1 мл) в синтетической питательной среде (50%—среды № 199, 20%—сыворотки крупного рогатого скота, 30% — гидролизата лактальбумина 0,5%) переносят в пробирки по 2 мл. В них пом- шаюг по одному предметному стеклу размером 15x10 мм. Карандашом по стеклу отмечают полоской верх пробирки для удобства последующего просмотра под микроскопом, затем, плотно закрывая их пробками, ставят в наклонном положении (под углом 5°) и инкубируют в термостате при 37°С. По получении сплошного пласта клеток на стенках пробирок и на предметном стекле (для первично эксплантированной культуры на 5-е сутки, для перевиваемой — на 2-е сутки) вносят 0,1 мл исследуемого вещества в 0,01% раствор спирта, приготовленного на питательной среде; часть пробирок для контроля культуры оставляется в исходном состоянии. Рекомендуемая концентрация этилового спирта не оказывает токсического эффекта на клетки в культуре. При необходимости использования другого растворителя следует предварительно подобрать такую его концентрацию, при которой вещество растворяется и токсических изменений в культурах клеток не возникает. При многократном действии внесение изучаемых веществ осуществляется следующим образом: ежедневно из пробирок «контроль клеток» удаляют 0,1 мл среды и добавляют такое
же количество свежей среды, из пробирок «контроль растворителя» дополнительно удаляют еще 0,1 мл среды и добавляют 0,1 мл среды и 0,1 мл растворителя. Из всех опытных пробирок удаляют 0,2 мл среды и добавляют 0,1 срелы и испытуемые вещества в соответствующих дозировках в 0,1 мл растворителя. Изучают обычно 1/10, 1/20, 1/Ь0 ЛД50 химического вещества, установленного в остром опыте. Эти исследования проводят для выявления кумулятивных свойств яда.
Перед началом эксперимента все показатели определяются в качестве исходных (в опыте и контролях), а затем — через 4, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 и 192 ч. Для каждой экспозиции берут не менее 4 пробирок с одной и той же дозой изучаемого вещества.
Морфологические изменения в пробирках изучают под микроскопом с малым увеличением. Обычно цитотоксическое действие химических веществ (эти изменения качественно однотипны) проявляется следующим образом: в сплошном клеточном пласте появляются очаги обособленных округлых клеток, утративших характерную отростчатость (дегенеративные изменения оцениваются от 0 до 12,5%). В дальнейшем эти скопления отдельных округлых клеток увеличиваются в числе и размерах, поражая четверть плсщади клеточного пласта (изменения оцениваются от 12,5 до 25%). Если такие изменения захватывают от четверти до половины клеток, то их оценивают от 25 до 50%. При прогрессировании явлений дегенерации поражается до 75% клеток. При обширной дегенерации весь клеточный пласт представляет собой отдельные или сгруппированные в островки клетки округлой формы (в зависимости от поражения площади клеточного пласта эти изменения оценивают от 75 до 100%).
После извлечения предметного стекла из пробирки среда сливается в центрифужную пробирку. В пустую пробирку с культурой клеток наливают 1 мл трипсина (температура раствора 37°С) и инкубируют в термостате при 37ГС в течение 10 мин (до полной отслойки клеток от стенок пробирки). Извлекают пробирку из термостата, перемешивают содержимое пипеткой, сливают клеточную взвесь в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Затем пастеровской пипеткой отсасывают трипсин и выливают питательную среду в полученный после центрифугирования осадок. Тщательно размешиаают, берут одну каплю ресуспенди-рования взвеси и помещают в гнездо агглютинационного планшета, куда добавляют одну каплю красителя (0,025% раствор нейтральный красный). Окрашивают клетки в течение 30—40 мин, а затем глазной пипеткой заливают смесь в камеру Горяева для подсчета. Подсчитывают общее число клеток (в том числе нежизнеспособных — диффузно прокрашенных в рубиновый цвет). Полученное число умножают на 11 110 (коэффициент пересчета) и получают число клеток в 1 мл. Число нежизнеспособных клеток выражают в процентах к общему числу клеток в 1 мл среды.
Извлеченные предметные стекла споласкивают дистиллированной водой и фиксируют в смеси Буэна в течение 15—20 мин. Затем стекла переносят в первый 70° спирт на 15 мин и во второй 70° спирт на 20—30 мин. После фиксации стекла споласкивают дистиллированной водой и окрашивают гематоксилином в течение 3—8 мин, затем споласкивают в солянокислом спирте, быстро смывают проточной водопроводной водой и помещают в 1% раствор эозина на 1—2 мин. После эозина препарат заключают в канадский бальзам для исследования под микроскопом. Определяют общее число клеток (в том числе дегенерировавших) в 1 см2, митотичсский и «фазные» коэффициенты.
Определение митотического и «фазных» коэффициентов проводят следующим образом: подсчитывают общее число клеток в поле зрения и отмечают число митозов по фазам (профаза, метафаза, анафаза, телефаза). Затем число клеток в состоянии митоза (для «фазных» — по отдельным фазам) делят на общее число учтенных клеток, приведенных к 1000 (%0).
Путем статистической обработки результатов исследований токсических свойств химического соединения в культуре клеток получают данные о недействующей, минимально токсической, среднесмертельной, абсолютной смертельной дозах и коэффициенте кумуляции (В. Б. Прозоровский).
Для унификации терминологических понятий, принятых в токсикологии, известный показатель ЦТД50 (цитотокснческая доза) на культурах клеток обозначается как ЛД80. Условность получаемых количественных параметров токсичности (в миллиграммах на килограмм среды культуры клеток) очевидна, но она связана с традиционной методологией токсикологических исследований.
Известно, что клетки в культурах теряют свою специфическую функцию, происходит их разднфференцировка. Так, кожно-мышечные и легочные эмбриональные фибробласты в культуре совершенно идентичны по морфологии и по отношению к действию ядов. О. Н. Елизарова и Д. Н. Нуж-дина (1971) не выявили существенных различий в действии пестицидов на культуры клеток почек эмбриона человека, эмбриона свиньи и пахового узла обезьяны макаки резуса. Не удалось установить выраженных различий видовой чувствительности эмбриональных фибробластов человека и кролика (М. Б. Шпирт).
В конечном счете точкой приложения любого соединения в организме является клетка и ее составные элементы. Использование теплокровных животных не дает возможности судить о непосредственном действии на клетки, так как влияние вещества в организме нивелируется адаптационными и защитно-компенсаторными функциями и механизмами. Для оценки количественного значения последних предлагается ввести организменно-клеточный коэффициент (ОКК). ОКК определяется по формуле:
окк = лп""тж: 0)
'Шмат кк
= <>')
где ЛД50атж — среднесмертельная доза изучаемого соединения в остром эксперименте для теплокровного животного; ЛЩоакч —среднесмертельная доза этого же вещества в остром эксперименте для культуры клеток человека; ККтЖ — коэффициент кумуляции изучаемого соединения для теплокровного животного; ККкч — коэффициент кумуляции этого же вещества для культуры клеток человека.
Величина ОКК есть количественное выражение силы адаптационных и защитно-компенсаторных механизмов целостного организма. Можно рекомендовать следующие уровни силы адаптационных и защитно-компенсаторных механизмов организма по величине ОКК: низкий — ОКК 1—1,5; умеренный — ОКК 1,6—2; высокий — ОКК 2,1—2,5; очень высокий — ОКК больше 2,5.
Расчеты показывают, что существует сильная обратимая корреляционная зависимость между ОКК и коэффициентом запаса (К,±/п = —0,79± ±0,23; /=3,2). Наличие столь выраженной корреляции позволяет вывести уравнение регрессии для расчета коэффициента запаса (Кч) для токсических соединений по данным ОКК. ОКК — К, : £=245,3—79,48 х — 8,18 х-(2), где у — коэффициент запаса, * — ОКК.
Расчеты Кч по этой формуле свидетельствуют о вполне достаточном соответствии расчетных и экспериментальных данных (относительная погрешность в расчетах Кч равна примерно ±30%). Полученный по этой формуле коэффициент запаса является сугубо ориентировочным. Однако наряду с другими данными он способствует более обоснованной экстраполяции экспериментальных данных на человека.
Таким образом, наряду с исследованиями токсичности в остром и хроническом экспериментах, изучением кумулятивных, гонадотоксическнх,
эмбриотоксических, тератогенных, мутагенных, бластомогенных и аллергенных свойств химических веществ, рекомендуется изучать их вредное действие на культурах клеток человека.
Предлагаемый способ разработан и испытан в лаборатории токсикологии Киргизского научно-исследовательского института эпидемиологии, микробиологии и гигиены. С его помощью получены токсикологические характеристики 14 соединений (ДДТ, ГХЦГ, ТМТД, севина, цинеба, МС-14-ПА, хлорофоса, метафоса, метилмеркаптофоса, фосфамида, сольвент-нафта, окислов хрома, опия-сырца, компонентов тутового шелкопряда — серицина, кукочки, фиброина).
ЛИТЕРАТУРА. Анджапарид'зе О. Г. (Ред.) Культура ткани в вирусологических исследованиях. М., 1962. — Дрейзен Р. С. — В кн.: Руководство по лабораторной диагностике гриппа, парагриппозных и аденовирусных инфекций. М., 1960, с. 142. — Дубинин Н. П. Проблемы радиационной генетики. М., 1961. — Елизарова О. Н., Н у ж д и н а Д. Н. — «Гиг. и сан.», 1971, № 1, с. 83. — Л е в и М. И. Культура тканей в изучении полиомиелита. Ставрополь, 1957. — Пол Д. Культура клеток и ткани. М., 1963. — Прозоровский В. Б. — «Фармакол. и токсикол.», 1962, № 1, с. 115. — Соловьев В. Д., Б е к т е м и р о в Т. А. Тканевые культуры в вирусологии. М., 1963. — X е с и н Я. Е. Размеры ядер и функциональное состояние клеток. М., 1967. — Шпирт М. Б. — »Сов. здравоохр. Киргизии», 1972, № 6, с. 43.
Поступила 3/У1 1976 г.
УДК 616.45-001.1/.3-092.9.613.2
М. Г. Чистяков, Р. Д. Ильинская, А. П. Парахонский ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ
Кубанский медицинский институт, Краснодар
В настоящей работе исследовали способность организма крыс противостоять некоторым формам стресса после продолжительного содержания их на рационах, в которых основным источником белков и жиров являлись продукты питания, получаемые от сельскохозяйственных животных, потребляющих в составе корма определенное количество углеводородных дрожжей.
Опыты проведены на 80 крысах линии Вистар, животные были разделены на 3 группы. В рацион 1-й группы (30 животных) было включено 10 мл молока, 10 г обезжиренного творога, 1,5 г сливочного масла и 10 г яиц, получаемых соответственно от коров и кур, в корме которых 25% белка заменяли белком углеводородных дрожжей, выращенных на основе дизельного топлива (ДТ) Контролем служила равная по численности 2-я группа крыс, в рацион которой были включены в таком же количестве аналогичные продукты, получаемые от коров и кур, содержавшихся на обычных хозяйственных кормах. Молочные продукты и яйца обеспечивали
Т а^б л и ц а 1.
Продолжительность предельного плавания крыс разных групп в воде, нагретой до 40°
Группа животных Рационы, включающие Время пребывания на рационе (в мес.) Предельное время плавания (в мни)
1-Я Экспериментальные молочно-яичные 3 22,4±2,6
продукты 6 25,0—2,3
2-Я Контрольные молочно-яичные про- 3 24,12=3,4
дукты 6 22,2^:2,8
3-Я Углеводородные дрожжи 6 20,2— 1,9
1 Химический состав дрожжей: белка 53,75%, жира 1,67%, углеводов 20,13% нос« таточных углеводородов 0,076%.
