CC BY
9
а гексахлоран поднимается на высоту 12—14 см и может быть определен совместно с ДДТ.
Для полуколичественного определения ДДТ был разработан вариант тонкослойной хроматографии. ДДТ выделяли из воды путем 3-кратной экстракции бензолом. Полученную вытяжку упаривали при низкой температуре до объема 2—3 мл и наносили на стекло с адсорбентом. Адсорбентом служила безводная окись алюминия, закрепленная гипсом. Применяли стекла размером 9Х 12 см.
Подвижным растворителем служил н-гексан, а проявителем — водно-ацетоновый раствор AgN03 с прибавлением NH4OH. Время хрома-тографирования составляло 15 мин. После проявления пластинку выдерживали 10 мин. под флюоресцентной лампой. На высоте 4—5 см от старта появлялось темно-фиолетовое пятно ДДТ. Количественное определение производили путем сравнения данного пятна с пятном, полученным при нанесении известного количества ДДТ. Воспроизводимость метода была хорошая. Чувствительность определения составляла 25 мкг.
Для определения гептахлора в водоеме мы попытались использовать реакцию его с диэтаноламином в щелочной среде, предложенную Давыдовым и Радомским и являющуюся для гептахлора специфической. Извлекали последний из воды путем экстракции эфиром. Наилучшего выделения достигали, если 250 мл воды, насыщенной поваренной солью, экстрагировали 30 мл эфира. Эфирную вытяжку выпаривали при низкой температуре на водяной бане досуха, а сухой остаток растворяли в ацетоне и наносили на стартовую линию хроматографиче-ской бумаги. Бумагу затем протягивали через 5% раствор касторового масла в эфире и хроматографировали 16—18 часов в системе ацетон — вода (7:3). По истечении этого времени бумагу извлекали из камеры, высушивали в течение часа и опрыскивали смесью диэтаноламина и 2 н. раствора КОН в метаноле (1:2). После опрыскивания выдерживали 10 мин. в сушильном шкафу при 100°. При наличии гептахлора на высоте 7—8 см от стартовой линии появлялось пятно светло-сиреневого цвета. Чувствительность определения 50 мкг в пробе. Количественное определение производили путем сравнения с пятном, полученным при известной концентрации гептахлора.
ЛИТЕРАТУРА
Кульберг JI. М., Ш и м а Е. И. Гиг. и сан., 1949, № 6, с. 45. — Radomsk i J. Z„ D a v i d o w В., J. Pharmac. Exp. Ther., 1953, v. 107, p. 266. —Mitchell L„ J. Ass. off. agrie. Chem., 1963, v. 46, p. 988. — S с h e с h t e r M. S., H aller H. L„ J. Am. chem. Soc., 1944, v. 66, p. 2129.
Поступила I5/I 1966 r.
УДК 613.63-07-093.35
К ВОПРОСУ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА ТКАНЕВЫХ КУЛЬТУР В САНИТАРНО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
Г. Н. Красовский, А. П. Ильницкий
Кафедра коммунальной гигиены I Московского медицинского института им. И. М. Сеченова
Метод тканевых культур находит все большее распространение во многих областях экспериментальной медицины. С различным успехом он применялся для первичного отбора противоопухолевых препаратов (В. А. Чернов и В. Б. Лыткина; Е1сЬогп с соавторами, и др.),
сравнительного изучения токсичности антибиотиков (Л. М. Якобсон; А. Ф. Зак, и др.). консервантов (Л. И. Райхер с соавторами), бактериальных токсинов (Feiton и Pomerat, и др.) и т. д. В практике же санитарно-токсикологических исследований методом тканевых культур пользовались исключительно редко. Так, Е. В. Штанников прибегал к нему для предварительной токсикологической оценки полимеров. Вместе с тем в комплексе с другими способами он может быть полезен в решении ряда вопросов, в частности для изучения сравнительной токсичности и оценки кумулятивных свойств тех или иных веществ, выявления их комбинированного действия, определения механизма действия вещества на клеточном и субклеточном уровне, а также некоторых генетических последствий воздействия его на клетку.
Исследуя сравнительную токсичность спиртов (метиловый, этиловый, бутиловый, изоамиловый), сернокислых солей ряда металлов (магний, марганец, кобальт, никель, цинк, медь, кадмий), различных солей меди, кадмия и стронция на культуре ткани и при пероральном введении белым мышам, мы использовали 3—4-дневные культуры перевиваемых клеток HeLa, СОЦ, Нер-2 и первично-трипсинизирован-ную культуру клеток почек эмбриона человека. Основная масса опыта была проведена с перевиваемым штаммом клеток HeLa. Разведения указанных выше веществ готовили на синтетической среде № 199, после чего каждым разведением (объем 1 мл) заливали 4—6 пробирок с однослойной культурой ткани. Пробирки помещали в термостат при 37°. В части опытов пробирки выдерживали параллельно при комнатной температуре (18—20°). Просматривали пробирки под микроскопом через 24, 48 и 72 часа, а в начальных опытах и через 96 часов. Результаты учитывали по цитотоксическому действию испытываемых веществ по балльной системе. Окончательный учет результатов производили через 72 часа. С каждым веществом было проведено по 3—4 серии опытов.
Пероральную затравку мышей осуществляли по обычной методике, определяли LD50 испытываемых веществ. Полученные результаты обрабатывали статистически, устанавливали коэффициент корреляции.
Сравнительное изучение токсичности сернокислых солей ряда металлов, производившееся параллельно на культуре ткани и белых мышах, показало (табл. 1), что результаты, полученные двумя указанными методами, находятся в прямой корреляции (коэффициент корреляции + 0,89).
Следует отметить, что наши данные согласуются с результатами исследований Shaw по выявлению пороговых концентраций солей тех же металлов, влияющих на жизнедеятельность дафний, микроорганизмов, а также на активность некоторых ферментов в опытах in vitro.
Проведенное нами далее сравнительное изучение токсичности различных солей 3 металлов (меди, кадмия и стронция) убедило нас в том, что существует прямая корреляция между результатами, полученными на культуре тканей и на белых мышах (коэффициент корреляции + 0,9). Полученные данные представлены в табл. 2.
Как явствует из табл. 2, токсичность солей металлов определяется, очевидно, ионом металла, а не кислотным остатком. Дальнейшие исследования мы проводили с метиловым, этиловым, бутиловым и изоамиловым спиртами. Эта серия экспериментов дала близкие результаты. Следует подчеркнуть, что токсичность бутилового и изоамилово-го спиртов как в эксперименте на культуре ткани, так и в опытах на мышах оказалась весьма близкой. Результаты наших исследований, а также сопоставление их с данными Штаркенштейна (1931 —1933) приведены в табл. 3.
Суммируя данные всех опытов с целью изучения сравнительной токсичности солей различных металлов и спиртов, хочется подчеркнуть,
5*
67
Таблица 1
Сравнительные данные изучения токсичности сернокислых солей ряда металлов
1 Действующее вещество1 Разведение, при котором наблюдалось выраженное цитотоксичес-кое действие на культуру ткани к 3~ §¡8 з*3(
1 -10—2 >4503
МпБО, 6-10~3 450
СоБО, 2 -Ю-3 110
N¡504 1 • 10~3 100
Си504 4 -Ю-4 80
СёБО, 1 • Ю-4 75
гпБО, 6-ю-4 175
1 Исходная концентрация вещества 10 г/л по иону металла.
5 По данным Бре^ог (1956).
Таблица 2
Сравнительные данные изучения токсичности различных солей меди, кадмия и стронция
Действующее вещество Разведение, при котором наблюдалось выраженное цитотоксическое действие на культуру ткани для белых мышей (в мг/кг по иону металла)
БгСи 1 ■ Ю-1 1 3101
БгЫОз 8 -Ю-2 1 2121
Си(СН3СОО)2 8 -Ю-4 100—120
СиБС^ 6-Ю-4 70—90
Си(Ы03)2 8 -Ю-4 70—80
Си(СН3СОО)2 2- Ю-5 60—70
1 По данным Ю. Шафирова (1965).
что оба использованных нами метода (метод культуры ткани и пер-оральная затравка белых мышей) обеспечивают хорошо совпадающие результаты. Статистическая обработка подтвердила наличие прямой
корреляции между результатами.
Таблица 3 Результаты исследований со спиртами
тем и другим спосо-
полученными бом.
Следует сделать несколько замечаний о применении метода тканевых культур в токсикологии. Основную массу веществ, пригодных для испытания на культуре ткани, составляют водорастворимые вещества. Работать с ними не сложно, эксперименты легко воспроизводимы. Точно также, по-видимому, технически просто изучают влияние на тканевые культуры пылевидных веществ (В. М. Перелыгин), хотя такое изучение, вероятно, менее целесообразно. Значительно сложнее методика работы с веществами, нерастворимыми в воде (например, с высшими спиртами). В процессе работы мы использовали культуры перевиваемых клеток НеЬа, СОЦ, Нер-2 и первично трипсинизированную культуру клеток почек человека. Накопленный нами опыт позволяет сделать вывод, что практически любая тканевая культура может быть
Спирт К . К щ ^ о. 2 и , к * о» Е н -а с! о л £ о Ч О О. У ^ о >, В1 о о йй ьй К з 5! о * кй 4> I <\) а
са
2 Н Ч «О -« О к О ф ч ; - й С[В 7 Е 1 а а _! X СП О п
Метиловый 8 10-2 8,4 18,0
Этиловый 2-10-2 6,96 12,5
Бутиловый 8 • 10-3 3,2 3,75
Изоамиловый 4 ■ 10-3 3,6 2,5
применена в токсикологическом эксперименте. Наибольшей чувствительностью, однако, обладает культура фибробластов кожно-мышечной ткани эмбриона человека.
Большое влияние на цитотоксическое действие вещества оказывает температурный фактор и рН среды. Мы проводили эксперименты при 2 температурах: комнатной (18—20°) и температуре термостата (37°). При 37° метаболизм клеток протекает значительно интенсивнее, в связи с чем действие вещества сказывается быстрее. При 18—20° опыт рекомендуется проводить тогда, когда имеют дело с летучими веществами. Это позволяет предупредить их переход из растворенного состояния в газообразную фазу. При той же температуре возможен эксперимент и в тех случаях, когда по каким-либо причинам хотят замедлить процесс воздействия вещества на клеточные культуры. Оптимальные пределы рН при работе с культурой ткани соответствуют 6,8—7,8. Если кислотность исследуемого раствора выходит за пределы этой области, то в зависимости от направления сдвига прибегают к подщелачиванию раствора, добавлению буферных систем и т. п. Без учета этого обстоятельства можно получить неверные результаты.
Срок наблюдения зависит от целей, поставленных экспериментатором. При изучении сравнительной токсичности веществ оно вполне достаточно в течение 72 часов. Если же поставлена иная задача, например выявление мутагенного вещества, то срок наблюдения должен быть значительно больше.
Наконец, следует заметить, что обязательным условием является одновременное использование в эксперименте всех сравниваемых веществ. Опыт показал, что при испытании одних и тех же веществ на одной и той же линии клеток, но в разные сроки, могут быть получены несколько различные результаты; это зависит от многих обстоятельств: возраста клеток, серии синтетической поддерживающей среды и т. д. Особенно важно соблюдать правило одновременного исследования испытуемых веществ при сравнении действия токсических веществ, близких по силе своего воздействия на тканевые культуры.
Общее заключение и выводы
В последнее время некоторые зарубежные авторы высказывают мнение об установлении ПДК того или иного вещества с использованием для этого только метода тканевых культур. Отвергая столь упрощенный подход, мы на основании приведенных выше экспериментальных данных полагаем, что метод тканевых культур применим для экспрессного определения сравнительной токсичности ряда веществ. При этом обязательно следует учитывать особенности механизма действия испытываемых веществ, возможность возникновения в целом организме токсичных метаболитов и т. д. В самом деле, как отмечают Р. А. Салтыков с соавторами, культура ткани непригодна для определения сравнительной токсичности некоторых нейротропных ядов. Так, столбнячный и ботулиновые токсины типов А, Б, С и Е даже в больших дозах не оказывают видимого цитотоксического воздействия на ряд перевиваемых (НеЬа, НЬЭ, Детройт-6 и т. д.) и первично-трипсинизированных тканевых культур. Очевидно, такой же результат будет и при испытании веществ, действующих через гормональные системы организма.
Можно считать, что в первую очередь метод тканевых культур пригоден для определения токсичности веществ, обладающих общетоксическим действием. В меньшей степени, а иногда совсем не подходит этот метод при изучении веществ системного или органного действия. Там, где метод культуры тканей может быть использован, получаемые данные хорошо коррелируют с результатами опытов на животных (Л. М. Якобсон; Л. И. Райхер с сотрудниками, и др.).
Необходимо отметить хорошую воспроизводимость результатов, получаемых в эксперименте на культуре ткани. Вместе с тем этот метод обладает рядом преимуществ перед классическим методом изучения сравнительной токсичности на животных, ибо позволяет получить результаты в 5—10 раз быстрее; для него характерен малый разброс результатов, что в свою очередь позволяет ограничиться для испытания токсичности каждого вещества 4 пробирками с клеточной культурой, значительно уменьшая материальные затраты.
Таким образом, оба использованных нами в эксперименте метода изучения сравнительной токсичности веществ (метод культуры ткани и пероральная затравка белых мышей) дают хорошо совпадающие результаты, что подтверждается статистической обработкой. Метод тканевых культур может быть использован в качестве экспресс-метода при изучении сравнительной токсичности веществ, обладающих общетоксическим действием.
ЛИТЕРАТУРА
Зак А. Ф. Антибиотики, 1962, № 11, с. 1011. — Перелыгнн В. М. Гиг. и сан.,
1964, № 5, с. 34. — Райхер Л. И., Шурки на Л. Д., Хазина Е. X. Лабор. дело,
1965, № 7, с. 438. — С ал т ы к о в Р. А., Земсков Е. Н„ Милютин В. Н. Бюлл. экспер. биол., 1961, № 12, с. 43. — Чернов В. А. Л ы т к и н а В. Б. Вопр. онкол , 1959, № 5, с. 552.— Шт а н ни ко в Е. В. Гиг. и сан., 1966, № 7, с. 59. — Я к о б -сон Л. М. Антибиотики, 1962, № 11, с. 1007. — Е i с h о г n P. A., Huffman К. V., О 1 е s о п J. J. et al., Ann. N. —Y. Acad. Sci., 1954, v. 58, p. 1172.— Felt on H. M„ Pomerat С. M„ Exp. Cell Res., 1962, v. 27, p. 280. — S h a w W. H„ Nature, 1961, v. 192, p. 94.
Поступила S/X 1966 r.
УДК 613.633:669.0461-073.753.373
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ЭЛЕКТРОННОЙ ДИФРАКЦИИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СТРУКТУРНОГО СОСТАВА ПЛАВИЛЬНЫХ ПЫЛЕЙ
Канд. мед. наук Р. А. Нищий, И. А. Бразгин Златоустовская городская санэпидстанция
При гигиенической оценке различных видов пыли, выделяющейся в воздушную среду производственных помещений, очень важно знать, из каких химических элементов или соединений она состоит. Это можно установить спектральным, химическим и некоторыми другими методами, однако для определения токсических свойств пыли необходимо выявить и истинный состав соединений, которые в нее входят, особенно на тех производствах, где ее выделение связано со сложными физико-химическими процессами.
С целью углубленного изучения структуры пыли мы применили метод электронной дифракции (С. С. Горелик с соавторами; Г. Томасс). Нас интересовал состав пыли, выбрасываемой в воздушную среду производственных помещений из электродуговых сталеплавильных печей при выплавке высококачественных марок сталей и сплавов. Известно, что при их производстве в большом количестве применяются разнообразные химические элементы (хром, марганец, никель, ванадий и пр.), которые при технологической температуре около 2000° должны естественно подвергаться значительным измененням.
Пробы отбирали непосредственно в дымовом факеле (над дуговой печью) и в зоне дыхания сталеваров с помощью ротационной установки.
