CC BY
300
обзоры
УДК: 616.33-006.6-091.8+575.1]-07
клинико-морфологические и молекулярно-генетические особенности интестинального и диффузного типов карцином желудка
и.в. Степанов1, м.в. Завьялова12 , Е.С. григорьева2, Ю.А. Букурова3,
С.г. Афанасьев2, н.в. Нердынцева2
Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск1 НИИ онкологии СО РАМН, г. Томск2 Институт молекулярной биологии им. В.А. энгельгардта РАН, г. Москва3 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, e-mail: [email protected]
Представлены современные данные о клинических особенностях 2 разных гистологических типов рака желудка (РЖ) и молекулярных факторах патогенеза, включающих инфекцию Helicobacter руїогі, наследственные и соматические мутации, а также другие генетические нарушения, экспрессионные характеристики опухолевых клеток. Проведен анализ связи маркеров пролиферации, апоптоза, факторов роста и регуляторов межклеточных взаимодействий с опухолевой прогрессией, приведены данные об их возможной прогностической значимости. Освещены результаты протеомных исследований по поиску маркеров диагностики и прогноза интестинального и диффузного типов РЖ.
Ключевые слова: интестинальный и диффузный рак желудка, патогенез, молекулярные маркеры, прогноз.
CLINICAL-MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR-GENETIC CHARACTERISTICS OF INTESTINAL AND DIFFUSE TYPES OF GASTRIC CARCINOMAS I.V Stepanov1, M.V Zavyalova1,2, E.S. Grigoryeva3, Yu.A. Bukurova3, S.G. Afanasyev2, N.V Cherdyntseva2
Siberian State Medical University, Tomsk1 Cancer Research Institute, SB RAMS, Tomsk2 V.A. Engelgardt Institute of Molecular Biology of the RAS, Moscow3 2, Moskovsky Tract, 634050-Tomsk, e-mail: [email protected]
The review presents the data on clinical characteristics of two different histological types of gastric cancer and molecular factors of pathogenesis including Helicobacter pylori infection, inherited and somatic mutations and other genetic disturbances. The analysis of relation of the markers of proliferation, apoptosis, growth factors and regulators of intercellular interactions to the tumor progression was carried out. The results of proteomic studies on the search for diagnostic markers and prognosis of intestinal and diffuse types of gastric cancer were presented.
Key words: intestinal and diffuse gastric cancer, pathogenesis, molecular markers, prognosis.
Рак желудка (РЖ) является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований. Ежегодно в мире регистрируется около 800 тыс. новых случаев и 628 тыс. смертей от этой патологии. Наиболее высокая заболеваемость РЖ наблюдается в Японии, России, Чили, Корее, Китае, Коста-Рике, Филиппинах [4]. В структуре онкологической заболеваемости РЖ устойчиво занимает 2-е ранговое место у мужчин и 3-е у женщин [5]. В России в 2008 г.
было зарегистрировано более 132 тыс. больных РЖ. При этом ежегодно диагностируется около 45-49 тысяч первичных случаев РЖ. В последние десятилетия в России отмечается снижение заболеваемости РЖ, однако показатель летальности увеличивается, за год умирает около 43 тысяч человек [6]. Самая высокая выживаемость при РЖ в мире зарегистрирована в Японии -53 %, тогда как в других странах - не более 15-20 % [8]. Таким успехам в улучшении выжи-
ваемости Япония обязана массовому скринингу населения и принятым национальным программам по борьбе с раком, в этой стране доля раннего рака в общей структуре больных РЖ наивысшая и составляет более половины всех случаев, тогда как в большинстве государств мира этот показатель не превышает 20 % [49].
При целенаправленном эндоскопическом скрининге населения ранний рак желудка обнаруживается в среднем на 10 лет раньше, чем местнораспространенные опухоли. К сожалению, скрининговые мероприятия в России, подобные опыту Японии, в государственном масштабе практически не проводятся. Рутинные методы обследования больных РЖ практически не позволяют распознать заболевание на ранних стадиях [8, 11]. Это делает актуальным поиск чувствительных и специфичных методов диагностики, базирующихся на выявлении вовлеченных в формирование и прогрессию РЖ молекулярных опухолевых маркеров. Мультифакториальная природа РЖ, как и большинства злокачественных новообразований, обеспечивает высокую гетерогенность его клинико-морфологических проявлений, что существенно затрудняет оценку прогноза заболевания, а, следовательно, и выбор тактики лечения. В основе такой гетерогенности лежат молекулярно-биологические различия опухолей, позволяющие дискриминировать гистотипы и подтипы заболевания внутри гистотипов, выявляя группы со схожими опухолевыми фенотипами и поведением.
Клинико-морфологическая
характеристика рака желудка
Существует несколько гистологических классификаций РЖ, из них наиболее часто используются классификация японского общества гастроэнтерологической эндоскопии (JES) и классификация Lauren. Японское общество гастроэнтерологической эндоскопии с 1963 г. постоянно усовершенствует свою классификацию рака желудка, в которой уделяет особое внимание так называемому раннему раку желудка (РРЖ). Этот термин был введен для обозначения поверхностных опухолей желудка небольшого размера, к РРЖ относят опухоли, ограниченные слизистой оболочкой и подслизистым слоем, не-
зависимо от наличия или отсутствия метастазов в регионарные лимфоузлы [11, 35]. P.A. Lauren в 1965 г. выделил кишечный, диффузный и смешанный гистологические типы рака желудка, предположив зависимость агрессивности опухоли от её гистотипа [28].
Кишечный и диффузный типы РЖ имеют связь с хелибактерной инфекцией, этиологическая роль которой в злокачественном перерождении слизистой желудка сегодня не подлежит сомнению. У большинства пациентов с кишечным типом РЖ, перенесших гастрэктомию, в неизмененной слизистой желудка обнаруживалась H. pylori [14]. При диффузном типе H. pylori выявляется гораздо реже, однако это не позволяет полностью исключить её роль в процессе канцерогенеза этого гистологического типа РЖ [34]. Результаты серологических исследований также доказывают связь инфицирования H. pylori с обоими гистологическими подтипами РЖ.
Результаты исследований, проведенных в Японии и Великобритании, свидетельствуют о том, что среди пациентов моложе 40 лет 45-55 % всех случаев рака желудка ассоциированы с инфицированием H. pylori (HP). Вне опухолевой ткани у 89 % пациентов с раком желудка кишечного типа обнаруживалась НР, при диффузном типе РЖ - в 32 % случаев. Необходимо отметить, что имеются варианты рака желудка, не ассоциированные с H. pylori. К ним можно отнести карциному проксимального отдела желудка и РЖ, характеризующуюся диффузной атрофией фундальной слизистой оболочки, ассоциированной с пернициозной анемией [21].
Не исключено, что в этиологии РЖ играет роль специфический штамм H. pylori. Следует отметить, что значительную роль в возникновении гипохлоргидрии, обусловленной НР-инфекцией, и РЖ играет повышенное образование провоспалительного цитокина IL-1ß, который обладает способностью ингибировать желудочную секрецию и моторику, причем эта способность различна у разных индивидуумов вследствие кластерного полиморфизма гена IL-1. Нельзя исключить также определенную роль IL-6, IL-8 и фактора некроза опухоли-альфа (TNF-a), продукция которых стимулируется H. pylori, в возникновении гипохлоргидрии.
Генетические факторы, влияющие на уровень экспрессии ^-ф, лежат в основе того факта, что рак желудка развивается далеко не у всех больных гастритом, ассоциированным с хели-кобактерной инфекцией [12].
Кишечный тип рака желудка во многом связан с кишечной метаплазией, сутью которой представляется замещение дифференцированного желудочного эпителия кишечным и изменение клеточного фенотипа слизистой оболочки желудка, что является исходом длительно существующего хронического воспаления [10, 23, 27]. При хроническом гастрите обнаруживаются дисрегенераторные изменения, которые, в свою очередь, провоцируют ускоренное перемещение клеток из генеративной зоны без полноценной дифференцировки в зоны расположения зрелых высокодифференцированных эпителиоцитов. В результате желудочные железы становятся функционально неполноценными. Таким образом, в метаплазированных железах происходит реорганизация эпителия со смещением зоны пролиферативного компартмента от перешейка желез к основанию и модификация стромальных клеток собственной пластинки слизистой, окружающих измененные железы, по кишечному типу [33].
Принято различать три различных типа кишечной метаплазии слизистой оболочки желудка [25, 32]. Полная кишечная метаплазия - I тип, для неё характерно наличие клеток Панета, абсорбирующих клеток и бокаловидных клеток с сиаломуцинами. Для неполной кишечной метаплазии свойственны бокаловидные клетки и столбчатые мукоциты, в которых гистохимически выявляется сиаломуцин (II тип кишечной метаплазии), или сульфомуцин (III тип). II, а в особенности III тип неполной кишечной метаплазии слизистой оболочки желудка ассоциирован с высоким риском возникновения рака желудка кишечного типа [18, 32].
Молекулярно-генетические аспекты
рака желудка
Трансформация клеток в раковые и опухолевая прогрессия связаны с накоплением изменений в геноме, возникающих в результате нарушения нормального его функционирования под действием наследуемых мутаций и влияния
канцерогенных факторов. Трансформированные клетки получают возможность выживать в организме за счет изменения сигнальных путей, обеспечивающих приобретение: независимых или автономных сигналов к росту; нечувствительности к сигналам, ингибирующим рост; резистентности к сигналам апоптоза; неограниченного потенциала к пролиферации; способности поддерживать ангиогенез; способности к инвазии и метастазированию [50]. Молекулярные изменения, ответственные за приобретение вышеуказанных свойств, могут использоваться в качестве онкомаркеров. Исследования механизмов канцерогенеза необходимы для разработки новых терапевтических подходов и поиска потенциальных молекулярных маркеров, пригодных для ранней диагностики и/или прогнозирования течения заболевания.
Около 5-10 % больных имеют отягощенный семейный анамнез по раку желудка, а именно генетическую предрасположенность к развитию различных типов (кишечный, диффузный) этого заболевания. Молекулярно-генетические факторы, лежащие в основе развития рака желудка кишечного и диффузного типа, различны. Хотя большинство аденокарцином желудка встречается спорадически, небольшая их часть возникает в рамках явной наследственной предрасположенности к развитию рака желудка. Это дало основание выделить синдром наследственного рака желудка диффузного типа, а также синдром наследственного не-полипозного рака толстой кишки (СННРТК), которые вызываются мутациями в одном из генов, участвующих в репарации ДНК (MLH1. MSH2, MSH6, PMS1, PMS2). Эти синдромы характеризуются предрасположенностью к раку толстой кишки, желудка и ряду других раков, таких как рак эндометрия, яичника, тонкой кишки, поджелудочной железы, уроэпителиальных раков и мозга. Форма нестабильности генома, названная микросателлитной неустойчивостью генома (MSI), характерна для всех опухолей, которые возникают совместно с синдромом наследственного неполипозного рака толстой кишки. РЖ возникает в 11 % при этом синдроме и встречается в семействах с MLH1 MSH2, или MSH6 мутациями. Большая часть РЖ в рамках СННРТК (79 %) представлена кишечным типом.
Синдром наследственного диффузного РЖ характеризуется аутосомно-доминантным типом наследования и возникает благодаря мутациям в CDH1 (Е-кадхерин) и имеет связь с повышенным риском развития рака молочной железы, преимущественно долькового типа (40 %) и рака толстой кишки. Пенетрантность гена составляет 70 %, то есть носители имеют 70 % риск развития рака желудка. На результатах скрининга пробандов из 42 семейств с диффузным раком желудка был выделен ряд признаков, позволяющих диагностировать синдром наследственного диффузного рака желудка. К ним относятся наличие двух и более документированных случаев диффузного рака желудка среди родственников первой/второй степени родства, из которых, по меньшей мере, один диагностирован в возрасте до 50 лет, также трех и более документированных случаев диффузного рака желудка среди родственников первой/второй степени родства независимо от возраста [15].
Возникновение семейных и спорадических случаев рака желудка - это результат генетических и эпигенетических нарушений в ключевых онкогенах и онкосупрессорных генах, контролирующих клеточный гомеостаз, приводящих к злокачественной трансформации нормальных клеток слизистой оболочки желудка. Молекулярные события, происходящие при формировании как интестинального, так и диффузного типов РЖ, включают в себя мутации в гене-супрессоре р53, потерю гете-розиготности, генетическую нестабильность и ряд других общих генетических изменений. В раках желудка обоих гистологических типов показан целый ряд нарушений генов опухолевых супрессоров, таких как CDKN2A, GSTP1, APC, MGMT, MLH1, DAPK,THBS-1, RUNX3 и т.д., которые могут считаться потенциальными молекулярными маркерами, тем более, что некоторые нарушения этих генов могут выявляться уже на ранних стадиях желудочного онкогенеза [41, 42].
Для интестинального типа РЖ показаны также мутации в гене APC, повышенная экспрессия онкогена бета-катенина, инактивация гастро-специфического pS2 гена, гиперметилирование супрессорного гена RARp. При диффузной карциноме наблюдается потеря гетерозигот-
ности в 17 хромосоме, инактивация RUNX3, мутация или потеря Е-кадгерина, экспрессия hTERT с активацией теломеразы. Мутации онкогенов при раке желудка включают в себя точечные мутации, как в случае с KRAS2, и генные амплификации, которые обнаруживаются в локусе, кодирующем рецептор к эпидермальному фактору роста HER-2 [43]. Процессы амплификации ведут к увеличению числа копий и повышенной экспрессии трех генов в локусе 17q21. а именно, HER-2/neu, ТОР2А и DARPP32 в первичных раках желудка. Хотя все эти гены имеют определенную связь, уровни их экспрессии, как правило, независимы друг от друга, что позволило предположить наличие других важных механизмов транскрипции, регулирующих их экспрессию. Наличие различных генетических дефектов в опухолевой ткани кишечного и диффузного типов рака желудка подтвердилось в ряде исследований. Так, повышенная экспрессия HER-2/neu наблюдалась только в кишечных типах опухолей, тогда как экспрессия ТОР2А была повышенной также и при диффузном типе. Напротив, амплификация и повышение экспрессии DARPP32 фиксировались в обоих гистологические подтипах и при всех стадиях опухолевого процесса [38]. Изменение гена из семейства рецепторов фактора роста фибро-бластов FGFR2/KSAM обнаруживалось при диффузных типах рака желудка примерно в 16 % случаев, что послужило дифференциально-диагностическим признаком, позволяющим исключать кишечный фенотип опухоли [43].
Белок р53 является фактором транскрипции, который регулирует клеточный цикл, апоптоз, ответ на стрессорные воздействия, в том числе генотоксические (ДНК-повреждающие), и целый ряд других важных клеточных процессов, обеспечивая стабильность генома [13]. В карциномах желудка соматические мутации в гене онкосупрессоре р53 являются наиболее общими генетическими изменениями и обнаруживаются у 60 % больных [31]. Однако данные о встречаемости их в опухолях интестинального и диффузного типов неоднозначны. Для недифференцированных опухолей (диффузный тип) отмечена низкая частота мутирования независимо от стадии, в то время как в дифференцированных (кишечный тип) ген р53 часто мутирован,
и частота мутаций не имеет стадийных различий [41, 43, 46, 47]. Независимо от гистологического варианта на поздних стадиях опухолевого процесса не менее 40 % новообразований содержат соматические мутации, в частности, в опухолях обоих гистотипов обнаружены мутации в кодоне 249, который является «горячей точкой» («хот спот») мутационных изменений в гене р53 при разных новообразованиях при экспозиции с экзомутагенами, что подтверждает существенную роль канцерогенных воздействий в патогенезе РЖ обоих типов [1].
Мутации приводят либо к потере функции белка р53 как онкосупрессора, либо к приобретению им онкогенных свойств (так называемые gain of function мутации). Опухолевые клетки с такими мутациями часто более автономны и агрессивны, менее восприимчивы к стрес-сорным стимулам и терапевтическому воздействию, чем опухоли, в которых р53 либо полностью инактивирован, либо его синтез заблокирован за счет мутаций со «сдвигом рамки считывания» (делеции или вставки) [31].
Молекулярное объяснение различий в морфологии и поведении кишечного и диффузного типов рака желудка может быть, по крайней мере частично, приписано различиям в экспрессии Е-кадхерина в этих типах рака. Е-кадхерин, известный также как CDH1, - это кальцийзависимый фактор адгезии, относящийся к классу поверхностных клеточных белков, которые организуют межклеточные связи и поддерживают структуру эпителиальных тканей. Изменения или инактивация CDH1 встречаются при злокачественных новообразованиях различных локализаций, включая раки молочной железы, щитовидной железы, простаты, толстой кишки и желудка. В начале 1990-х гг. были выявлены соматические мутации CDH1 в 40-83 % спорадических случаев рака желудка диффузного типа, при отсутствии таковых у лиц со спорадическими случаями рака желудка кишечного типа [22, 36]. Мутации Е-кадхерина в экзонах 8 или 9 вызывают рассеянный рост опухоли, снижение количества межклеточных связей и повышают подвижность опухолевых клеток при диффузном типе рака желудка. Мутации в генах бета- и гамма-катенина, которые функционально связаны с Е-кадхерином,
по-видимому, также играют роль в развитии и прогрессии скирроподобного и диффузного типа рака желудка [16].
Метилирование CpG динуклеотида промотора CDH1, приводящее к инактивации гена, встречается при наследственных и спорадических случаях рака желудка и присутствует приблизительно в 50 % наследственных диффузных раках желудка и 83 % спорадических случаев [22]. Таким образом, выявление нарушений гена CDH1 можно расценивать как фактор риска для развития диффузного типа РЖ. В опухолях смешанного типа мутации и отсутствие экспрессии E-cadherin отмечаются только в диффузном компоненте опухоли, что дает основание делать выводы о том, что потеря экспрессии E-cadherin -это вероятное генетическое основание для разграничения диффузного типа опухоли от кишечного.
CDX2 (Caudal type homeobox transcription factor 2) - это транскрипционный фактор, имеющий отношение к кишечному органогенезу. CDX1 вовлечен в процесс пролиферации, а CDX2 - в дифференцировку эпителия в кишечнике, поджелудочной железе и желчных путях. CDX2 взаимодействует с генами опухолевой супрессии APC и E-cadherin, а также с bcl-2. Показано, что CDX2 выступает в роли фактора транскрипции многих кишечных генов, в частности MUC2, MUC5AC, MUC6. CDX2 и MUC2 обнаруживались в 80 % случаев в ткани с признаками кишечной метаплазии и в раках желудка. CDX2 и MUC2 играют важную роль в дифференцировке как нормальной, так и патологически измененной ткани желудка. Потеря CDX2 может быть сигналом прогрессии опухоли в случаях раннего РЖ и рака с кишечным фенотипом. Снижение экспрессии CDX2 при полной кишечной метаплазии, при желудочной дисплазии и раке желудка позволило предположить, что CDX2 играет антиканцерогенную роль [37]. В кишечнике (от двенадцатиперстной кишки до прямой кишки) CDX2 экспрессируется в ядрах эпителиоцитов и обнаруживается во всех типах эпителиальных клеток, однако не выявлялся в образцах нормальной слизистой оболочки желудка. В поджелудочной железе и желчных путях белок CDX2 встречается в эпителиоцитах протоков, в желудке и пищеводе
только в случае кишечной метаплазии или при интестинальном РЖ [45].
Циклины D-типа достигают максимальных уровней экспрессии и формируют функциональные комплексы с CDK4 (Cyclin-dependent kinase 4) во время середины G1 фазы митоза. Поэтому биологическая роль D3-циклина двояка, он участвует в клеточной пролиферации, а также играет роль в дифференцировке. В раках желудка повышенную экспрессию циклина D1 связывают с кишечным фенотипом опухоли в одних исследованиях, с неизмененной тканью в других исследованиях и с диффузным типом рака желудка и низкой дифференцировкой в третьем случае [20].
Известно, что злокачественный фенотип опухоли, ответственный за ее возникновение и прогрессию, определяется, в конечном счете, качественным и количественным изменением профиля белковых молекул, вовлеченных в канцерогенез. Предполагается, что могут быть выявлены белки, избирательно высоко экспрессированные в разных типах РЖ (интестинальном или диффузном), что даст возможность разработать тест-системы для дифференциальной ранней диагностики РЖ и прогноза клинического течения этих типов опухолей. В последние 10 лет были предприняты многочисленные попытки сравнительного транскриптомного анализа опухолей различной локализации (по оценке экспрессии мРНК с использованием технологии ДНК-микроаррей, генных чипов), однако было обнаружено отсутствие четкой корреляции между экспрессией мРНК и канцерогенезом, поскольку часто наблюдаются существенные различия между синтезом мРНК и белка, которые кодируются одним и тем же геном. В этой связи количественные и качественные изменения посттрансляционно модифицированных протеинов как конечного продукта рассматриваются как более информативные, по сравнению с мРНК, для изучения молекулярных событий в процессе канцерогенеза. Для идентификации опухолевых маркеров широко применяются протеомные методы сравнительного анализа белковых профилей нормальных и опухолевых тканей [24, 44]. Такой подход позволяет идентифицировать белковые маркеры, ассоциированные с опухолевой транс-
формацией. Для разработки потенциальных молекулярных маркеров с диагностической целью необходимо выявление белков, содержание которых существенно повышено в опухоли и биологических жидкостях (сыворотка крови), что позволило бы осуществлять их детекцию на ранних этапах опухолевого процесса.
В литературе представлено ограниченное число публикаций по идентификации белков с различной концентрацией в нормальной и озло-качествленной слизистой оболочке желудка, при этом имеет место высокая вариабельность белков, ассоциированных с РЖ, выявленных в разных исследованиях. В целом картина изменения протеома при аденокарциноме желудка остается малоизученной, хотя для ряда белков показано значительное повышение уровня их синтеза при РЖ [17, 48]. В мире практически нет данных о протеомном профиле интестинальных и диффузных опухолей, единичные работы посвящены характеристике качественных и количественных различий белковых молекул в ткани опухоли по сравнению с нормальной тканью, для аденокарциномы желудка вообще, при этом большинство из них касаются РЖ у пациентов азиатской, но не европеоидной популяции. Нами проведен сравнительный протеомный анализ опухолевой и нормальной ткани желудка для идентификации белков, синтез которых значительно повышен в опухоли по сравнению с нормой. Для увеличения разрешающей способности 2D-гель электрофореза была использована предварительная экстракция растворимой фракции белков, для удаления мажорных структурных белков [9]. В ходе сравнительного анализа белковых профилей опухолевой и нормальной тканей с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии выявлено увеличение синтеза 15 белков, для ряда из них показана разная экспрессия в диффузном и кишечном типах РЖ, что делает перспективными дальнейшие исследования для оценки их диагностической и прогностической значимости [3].
Выявление различных белков, вовлеченных в механизмы формирования интестинальной или диффузной форм РЖ, различающихся по тяжести клинического течения, позволит, во-первых, проводить раннюю диагностику у лиц
групп «высокого онкологического риска», во-вторых, при диагностике на ранних стадиях, когда макроскопически невозможно определить тип опухоли, при наличии ассоциированных с той или иной формой РЖ белковых маркеров, прогнозировать клиническое течение заболевания и, соответственно, дифференцированно подходить к выбору тактики лечения. При благоприятном прогнозе можно оптимизировать объем операции, что позволит уменьшить уровень хирургического и анестезиологического стресса и обеспечить снижение риска осложнений, связанных с расширенным объемом лимфодиссекции.
Критерии прогноза при раке желудка
Для прогнозирования клинического течения РЖ широко используются клиникоморфологические параметры злокачественного процесса. Из гистологических параметров прогноза при раке желудка наибольшее значение придают делению опухолей на кишечный и диффузный типы рака, последний считается более агрессивным и имеет худший прогноз. Однако следует отметить, что течение заболевания в пределах одного гистологического типа также существенно варьирует у разных индивидуумов, что требует поиска информативных маркеров, позволяющих прогнозировать клиническое течение заболевания [49].
Имеются сведения о зависимости лимфогенного метастазирования от размера новообразования при раке желудка [7]. Риск метастатического поражения перигастральных лимфоузлов существенно возрастает при размере опухолевого узла более 4 см. Локализация опухоли не рассматривается как фактор, влияющий на частоту возникновения регионарных метастазов на путях лимфооттока, однако вовлечение в опухолевый процесс пищевода явилось важным критерием, повышающим риск лимфогенного метастазирования [2]. Получены данные о том, что распространение опухоли на подслизистый слой, низкая степень дифферен-цировки опухоли, лимфатическая и венозная инвазия ассоциированы с увеличением количества пораженных метастазами лимфоузлов. Мультицентричный характер роста опухоли и тип рака желудка по классификации Lauren не
оказывали влияния на частоту лимфогенного метастазирования [5].
Исследования последних лет показали, что плотность сосудов микроциркуляторного русла в опухоли напрямую влияет на вероятность гематогенного метастазирования. Активация неоангиогенеза связана с рядом факторов, среди которых особая роль принадлежит эндотелиальному сосудистому фактору роста - VEGF. который, активируя коллагеназу и урокиназу, приводит к лизису матрикса эндотелия. В результате данного каскада реакций повышается способность эндотелиальных клеток к миграции. Клетки опухоли также способны к экспрессии рецепторов VEGF, используя их активацию для инвазии и метастазирования. Было установлено, что у пациентов с VEGF-положительными раками желудка обнаруживается большее количество новообразованных микроциркуляторных сосудов. В результате прогноз у больных раком желудка с VEGF-негативным статусом был значительно лучше, чем у пациентов с VEGF-положительной экспрессией. Распространенность гематогенных метастазов увеличивалась с повышением количества новообразованных сосудов, экспрессирующих маркер эндотелиальных клеток CD34, что дает основание считать оценку васкуляризации опухоли ценным инструментом для идентификации пациентов с высоким риском развития гематогенных метастазов. Однако необходимо сказать, что используемые в онкологической практике клинико-морфологические критерии прогнозирования РЖ далеко не всегда способны адекватно оценить вероятность лимфогенного и гематогенного метастазирования, что указывает на высокую актуальность поиска и оценки информативности молекулярно-биологических критериев, выявленных на основе исследования ассоциации патогенетически значимых для РЖ молекулярных факторов с клиническими проявлениями опухолевой прогрессии. Молекулярные онкомаркеры по своей биологической природе и методам выявления можно разделить на несколько типов: генетические (мутации, изменение копийности генов, экспрессии и профиля мРНК), эпигенетические (изменение профиля метилирования ДНК), протеомные (изменение уровня и профиля белковой экс-
прессии), метаболомные (изменение уровня и спектра низкомолекулярных метаболитов), изменения профиля и уровня микроРНК [50].
В настоящее время широкое распространение получили иммуногистохимические методики количественного и качественного определения экспрессии ассоциированных с опухолевыми клетками белков, которые определяют опухолевый фенотип и в той или иной мере ответственны за поведение опухоли, а, следовательно, являются потенциальными онкомаркерами.
Известно, что пролиферативная активность опухолевых клеток во многом определяет опухолевую прогрессию. Ki-67 и PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), два самых часто используемых маркера клеточной пролиферации, являются ядерными антигенами и связаны со всеми фазами клеточного цикла, кроме G0. В середине фазы G1 митоза начинается синтез белка Ki-67, постепенно нарастая, его уровень достигает максимума в метафазе, затем резко снижаясь в анафазе. Уровень ядерного антигена клеточной пролиферации PCNA увеличивается в ядре, достигая максимального уровня во время фазы S (перед началом синтеза ДНК). Традиционный подсчет митотической активности не отражает пролиферативный потенциал опухоли, так как собственно митоз занимает несколько часов, а подготовка к нему - около 24 ч. Изучение негистонового протеина Ki-67, экспрессирующегося во всех клетках, вышедших из G0 и ранней G1 фазы митоза, позволяет определить именно «скрытый» пролиферативный потенциал опухоли.
В ряде исследований было показано, что повышение уровня экспрессии Ki-67 и PCNA коррелирует с наличием метастазов в лимфатических узлах. В РЖ кишечного типа экспрессия Ki-67 обнаруживалась чаще, чем при диффузных формах. Однако эти исследования не выявили какой-либо корреляции между пролиферативной активностью, глубиной инвазии, поражением лимфатических узлов и степенью дифференцировки опухоли. Для РЖ с положительной экспрессией PCNA характерны такие клинические признаки, как старший возраст заболевших раком желудка, мужской пол, большой размер опухоли, высокодиффе-
ренцированная гистологическая структура. В кишечном типе рака желудка экспрессия PCNA обнаруживалась чаще, чем при диффузном типе [29]. Установлено, что у больных раком желудка с глубиной инвазии опухоли в мышечный слой и глубже уровень PCNA был значительно выше, чем у больных с инвазией в пределах слизистой оболочки желудка или до подслизистой основы. Уровень экспрессии PCNA возрастал с увеличением гистологической стадии рака желудка и в опухолях с наличием метастазов в лимфатических узлах [19]. Эти результаты дают основание полагать, что высокие уровни экспрессии Ki-67 и PCNA можно связывать не только с гистологическим типом рака желудка по Lauren, но и со степенью злокачественности рака желудка, вовлечением лимфатических узлов и степенью дифференцировки опухоли.
Определение экспрессии белков CDX1 и CDX2 в опухолях желудка иммуногистохимиче-ским методом началось сравнительно недавно. Экспрессия CDX2 прогрессивно снижалась в ряду состояний кишечная метаплазия, дисплазия и РЖ [37]. CDX2 продемонстрировал высокую чувствительность и специфичность для аденокарцином желудка кишечного типа [45]. Многофакторный анализ общей выживаемости показал, что CDX2-позитивные больные раком желудка демонстрировали более высокую продолжительность жизни, чем CDX2-негативные пациенты. Экспрессия CDH17 (Cadherin-17) -печеночно-кишечного кадхерина также регулируется геном CDX2. Исследования показали, что экспрессия CDH17 обнаруживалась не только при кишечной метаплазии слизистой оболочки желудка, но и при раке желудка кишечного типа. Прогноз пациентов с положительной экспрессией CDH17 был неблагоприятным по сравнению с прогнозом у пациентов с отрицательным CDH17 статусом. В большинстве случаев с положительной экспрессией CDX2 также выявлялась и экспрессия CDH17, что свидетельствует о связи этих маркеров с ранним раком желудка кишечного типа и неблагоприятным прогнозом [39].
Ряд исследователей выявили, что экспрессия фермента циклооксигеназы COX-2 значительно коррелировала с глубиной инвазии опухоли, но не было обнаружено никакой связи между уров-
нем COX-2 экспрессии и выживаемостью [26, 30]. Экспрессия COX-2 выявлялась у больных как с кишечным, так и с диффузным типом рака желудка, однако ряд авторов выявляли иммунореактивность COX-2 только при кишечном типе рака желудка [26]. Таким образом, экспрессия COX-2 является одним из общих свойств различных подтипов рака желудка, что дает основание предполагать наличие связи COX-2 с ранними этапами желудочного канцерогенеза. Поскольку было обнаружено повышение уровня COX-2 мРНК у пациентов не только с раком желудка, но и с тяжелой дисплазией, его выявление у больных с предраковыми изменениями слизистой может служить инструментом ранней диагностики РЖ.
Несмотря на большое число исследований роли гена онкосупрессора ТР53 при РЖ, его прогностическая значимость все еще остается спорной. Поскольку мутантный белок p53 часто более устойчив, чем его дикий тип, считают, что иммуногистохимическая положительная реакция на р53 обусловлена детекцией исключительно мутантного типа p53. В p53 позитивных раках желудка отмечена не только высокая активность апоптоза, но также и активность пролиферации, оцененная с помощью Ki-67. В ряде исследований показано, что экспрессия p53 значительно коррелировала с глубиной инвазии опухоли, но не было выявлено связи между экспрессией p53 и выживаемостью [30]. Хотя есть предположения об отношении между экспрессией p53 и худшим прогнозом, остается до конца неясным, является ли p53 независимым прогностическим фактором. Старший возраст, мужской пол, больший размер опухоли и высокодифференцированная гистологическая структура опухоли положительно коррелируют с экспрессией p53. При этом положительная экспрессия p53 более характерна для кишечного типа рака желудка, чем для диффузного [29].
Одним из потенциально важных маркеров, вовлеченных в процессы клеточной пролиферации, дифференцировки и контроля метастази-рования при раке желудка, является белок nm23 (non-metastatic cells protein) [29]. Экспрессия nm23 связана с молодым возрастом пациентов, большим размером опухоли и высокодифференцированной гистологической структурой.
Согласно классификации Lauren, кишечный тип рака желудка чаще давал положительную nm23 экспрессию, чем диффузный тип. Также экспрессия nm23 положительно коррелировала с обнаружением p53 [30].
Белок HER-2/neu принимает непосредственное участие в пролиферации и росте нормальных клеток посредством рецепции EGF (Epidermal Growth Factor). Амплификация или экспрессия гена HER-2/neu встречается при раке молочной железы, опухолях легких, желудочно-кишечного тракта, женской половой системы и других новообразованиях и связана с неблагоприятным прогнозом течения этих заболеваний. Выявлена высокая корреляция между экспрессией HER-2/neu и кишечным гистологическим типом рака желудка, при этом усиление экспрессии HER-2/neu связано с низкой выживаемостью больных [40]. Однако в целом не получено убедительных доказательств связи экспрессии белкового продукта c-erbB-2 с гистологическим типом рака желудка, глубиной инвазии, размером опухоли или метастазами в лимфатические узлы.
Раковые клетки желудка экспрессируют множество факторов роста и цитокинов, которые осуществляют свои эффекты через аутокрин-ные, паракринные и юкстакринные механизмы. Экспрессия этих факторов и медиаторов зависит от гистологического подтипа рака желудка. Эпидермальный фактор роста (EGF) объединяет в себе семейство факторов, к которым относят EGF, TGF-a, IGF и bFGF, они, как правило, продуцируются раком желудка кишечного типа, в диффузном типе рака преобладает продукция трансформирующего фактора роста бета (TGF-ß). Показано, что TGF-ß1 увеличивает метастатический и инвазивный потенциал опухолевых клеток, стимулируя эпителиальномезенхимальный переход, приводящий к приобретению ими способности проникать через базальную мембрану, увеличению адгезивной и локомоторной активности. Поэтому блокировка TGF-ß или его сигнальных путей может препятствовать вступлению клеток опухоли в процесс метастазирования. Мутации молекул клеточной адгезии, таких как E-cadherin, как уже упоминалось, избирательно обнаруживаются в 50 % рака желудка диффузного типа.
Е-кадхерин связывается с актином цитоскелета через ряд белков катенинов. Поэтому изменения уровней экспрессии Е-кадхерина прямо влияют на клеточную адгезию и играют важную роль в развитии рака [15].
Молекула CD44 - поверхностный клеточный гликопротеин, играющий важную роль в межклеточных взаимодействиях, клеточной адгезии и миграции. Это рецептор гиалуроновой кислоты, а также некоторых других лигандов, таких как остеопонтин, коллаген и металлопротеиназы матрикса. Аномальная транскрипция CD44 часто связана с раком желудка и его метастазиро-ванием. Патологическая транскрипция CD44 в интроне 9 характерна для всех типов рака желудка, подобные изменения обнаруживаются в большинстве образцов с кишечной метаплазией слизистой оболочки желудка и полностью отсутствуют в неизмененной слизистой. Остеопонтин (OPN) - белковый лиганд CD44, он повышенно продуцируется в 73 % случаев РЖ. При анализе его ко-экспрессии с CD44v9 была обнаружена положительная корреляция с инвазивностью и лимфогенным метастазированием.
Таким образом, в настоящее время существует множество прогностических факторов при раке желудка. Однако их трактовка для оценки риска прогрессирования заболевания в большинстве случаев не однозначна, что требует как продолжения независимых исследований для валидации уже имеющихся маркеров, так и поиска новых биологических маркеров на основе современных технологий молекулярногенетического анализа.
Заключение
В настоящее время активно ведется поиск дополнительных морфологических параметров прогноза при раке желудка. Наиболее распространен принцип деления гистологических форм рака желудка на диффузный и кишечный типы, однако в пределах этих групп течение заболевания не однозначно. Акцентируется внимание на размер новообразования, распространение на пищевод, глубину инвазии. Данные параметры ассоциируются с неблагоприятным прогнозом лимфогенного метастазирования. В то же время детальная морфологическая структура при диффузном и кишечном типах рака желудка не учи-
тывается. Из дополнительных прогностических параметров широко исследуются показатели апоптоза, пролиферативной активности, межклеточной адгезии. Больше внимания уделяют экспрессии в опухоли CDX2. Однако значение данных параметров для прогноза трактуется не однозначно, или оно присуще в большей степени какому-то конкретному типу. В связи с этим актуальным является исследование детального гистологического строения первичной опухоли при диффузном и кишечном типах рака желудка с изучением биологических свойств клеток, образующих различные структуры.
Актуальным остается анализ состава и выраженности воспалительного инфильтрата первичной опухоли при раке желудка. Однако в большинстве работ данный параметр изучается либо в общей группе больных РЖ, либо по отношению к каким-то гистологическим формам. Представляется интересным оценить состав и выраженность воспалительной инфильтрации стромы опухоли в группах рака желудка диффузного и кишечного типов в зависимости от глубины инвазии и от детального морфологического строения паренхиматозного компонента опухоли, а также сопоставить эти параметры с биологическими свойствами опухолевых клеток.
Работа частично поддержана
Российским фондом фундаментальных исследований
(проект № 09-04-99072).
ЛИТЕРАТУРА
1. Белявская В.А., Вардосанидзе К.В., Орешкова С.ф. и др. Соматические мутации в гене TP53 у больных раком желудка // Вопросы онкологии, 2010. Т 56, № 2. С. 156-161.
2. ВолковМ.Ю., Августинович А.В., Пак А.В., Афанасьев С.Г. Анализ результатов хирургического лечения больных кардиоэзо-фагеальным раком // Сибирский онкологический журнал. 2010. Прил. № 1. С. 29.
3. Григорьева Е.С., Букурова Ю.А., Чердынцева Н.В. и др. 2Э-протеомика рака желудка: идентификация белков с повышенным синтезом в опухоли // Сибирский онкологический журнал. 2009. № 5 (35). С. 37^2.
4. Давыдов М.И., Аксель ЕМ. Злокачественные новообразования в России и странах СНГ в 2001 году. М.: Медицинское информационное агентство, 2003. С. 95-97, 223-224.
5. ДавыдовМ.И., Туркин И.Н., ПолоцкийБ.Е. и др. Результаты хирургии раннего рака желудка // Вестник Московского онкологического общества. 2008. № 9. С. 2-8.
6. Давыдов М.И., Тер-Ованесов М.Д. Современная стратегия хирургического лечения рака желудка // Современная онкология. 2000. Т. 2, № 1. С. 4-10.
7. Давыдов М.И., Туркин И.Н., Мочальникова В.В. Факторы риска лимфогенного метастазирования раннего рака желудка
// Материалы V съезда онкологов и радиологов СНГ. Ташкент, 2008. С. 286.
8. ЗаридзеД.Г. Эпидемиология и этиология злокачественных заболеваний // Канцерогенез. М.: Научный мир, 2000. С. 26-30, 34-56.
9. Краснов Г.С., Ханкин С.Л., Букурова ЮА. и др. Протеом злокачественных опухолей толстой кишки человека: идентификация растворимых белков с повышенным содержанием в опухоли // Молекулярная биология. 2009. № 43. С. 610-615.
10. Мозговой С.И., Яковлева Э.В., Лининг Д.А., Кононов А.В. Кишечная метаплазия слизистой оболочки желудка: классификация, методика детекции и сложности гистопатологической интерпретации с позиции современной практической гистохимии // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2004. № 1 (внеочередной вып.). С. 114-125.
11. Поддубный Б.К., КувшиновЮ.П., Ефимов О.Н. Современное состояние эндоскопической диагностики и лечения ранних форм рака пищевода и желудка // Современная онкология. 2000. № 2. С. 68-72.
12. Родионова О.Н., Трубина Н.В., Реутова Э.Ю. Взаимоотношения хеликобактерной инфекции и функциональной диспепсии с позиции доказательной медицины (обзор литературы) // Вестник Санкт-Петербургского университета. 2008. Сер. 11, вып. 4. С. 28-37.
13. Чумаков П.М. Белок р53 и его универсальные функции в многоклеточном организме // Успехи биологической химии. 2007. Т. 47. С. 3-52.
14. Araujo-Filho I., Brandao-Neto J. Prevalence of helicobacter pylori infection in advanced gastric carcinoma // Arq. Gastroenterol. 2006. Vol. 43. P. 288-292.
15. Brooks-Wilson A.R., Kaurah P., Suriano G. Germline E-cadherin mutations in hereditary diffuse gastric cancer: Assessment of 42 new families and review of genetic screening criteria // J. Med. Genet. 2004. Vol. 41. P. 508-517.
16. Caca K., Kolligs F.T., Ji X. et at. Beta- and gamma-catenin mutations, but not E-cadherin inactivation, underlie T-cell factor/ lymphoid enhancer factor transcriptional deregulation in gastric and pancreatic cancer // Cell Growth Differ. 1999. Vol. 10. P. 369-376.
17. Cheng Y., Zhang J., Li Y. et al. Proteome analysis of human gastric cardia adenocarcinoma by laser capture microdissection // BMC Cancer. 2007. Vol. 7. P. 191.
18. Dinis-Ribeiro M., Lopes C., Costa-Pereira A. A follow up model for patients with atrophic chronic gastritis and intestinal metaplasia // J. Clin. Pathol. 2004. Vol. 57. P. 177-182.
19. ElpekG.O., Gelen T., AksoyN.H. Microvessel count, proliferating cell nuclear antigen and Ki-67 indices in gastric adenocarcinoma // Pathol. Oncol. Res. 2000. Vol. 6. P. 59-64.
20. Feakins R.M., Nickols C.D., Bidd H., Walton SJ. Abnormal expression of pRb, p16 and cyclin D1 in gastric adenocarcinoma and lymph node metastases:relationship with pathological features and survival // Hum. Pathol. 2003. Vol. 34. P. 1276-1282.
21. Fischbach W., Chan A., Wong B. Helicobacter pylori and Gastric Malignancy // Helicobacter. 2005. Vol. 10. P. 34-39.
22. Grady W.M., Willis J., GuilfordPJ. Methylation of the CDH1 promoter as the second genetic hit in hereditary diffuse gastric cancer // Nat. Genet. 2000. Vol. 26. P. 16-17.
23. Gutierrez-Gonzalez L., Wright N.A. Biology of intestinal metaplasia in 2008: More than a simple phenotypic alteration // Dig. Liver Dis. 2008. Vol. 40. P. 510-522.
24. Itoh K. Proteomic alteration in gastric adenocarcinomas from Japanese patients // Mol. Cancer. 2006. Vol. 5. P. 75.
25. Jass J.R., Walsh M.D. Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review // J. Cell. Mol. Med. 2001. Vol. 5. P. 327-351.
26. Joo Y.E., Oh W.T., Rew J.S., Park C.S. Cyclooxygenase-2 expression is associated with well-differentiated and intestinaltype
pathways in gastric carcinogenesis // Digestion. 2002. Vol. 66. P. 222-229.
27. Kumar V, Cotran R.S., Robbins S.L. Robbins Basic Pathology, 7th Edition. Philadelphia: Saunders, 2003. 873 p.
28. Lauren P. The two histological main types of gastric carcinoma: diffuse and so-called intestinal type carcinoma // Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1965. Vol. 64 (1). P. 31-49.
29. Lee K.E., Lee H-J., Kim Y.H. Prognostic Significance of p53, nm23, PCNA and c-erbB-2 in Gastric Cancer // Jap. J. Clin. Oncol. 2003. Vol. 33. P. 173-179.
30. Lee W-S., Kim H.-S., Choi S-K., Rew J-S. Expression of Cyclooxygenase-2, p53 and Ki-67 in Gastric Cancer // J. Korean Med. Sci. 2006. Vol. 21. P. 871-876.
31. Levine A.J., Hu W., Feng Z. The p53 pathway: what questions remain to be explored? // Cell Death Differ. 2006. Vol. 13. P. 1027-1036.
32. MesquitaP., RaquelA.,NunoL. Metaplasia - a transdifferentiation process that facilitates cancer development: the model of gastric intestinal metaplasia // Crit. Rev. Oncog. 2006. Vol. 12. P. 3-26.
33. Mutoh H., Sakurai S., Satoh K. Perycriptal fibroblast sheath in intestinal metaplasia and gastric carcinoma // Gut. 2005. Vol. 54. P. 33-39.
34. Nardone G., Rocco A., Malfertheiner P. Review article: Helicobacter pylori and molecular events in precancerous gastric lesions // Aliment. Pharmacol. Ther. 2004. Vol. 20. P. 261-270.
35. Nogueira C., Silva A.S., Santos J.N. Early Gastric Cancer: Ten years of Experience // World J. Surg. 2002. Vol. 26, Suppl. 3. P. 330-334.
36. Pharoah P.D.P., Guilford P., Caldas C. International Gastric Cancer Linkage Consortium. Incidence of gastric cancer and breast cancer in CDH1 (E-cadherin) mutation carriers from hereditary diffuse gastric cancer families // Gastroenterology. 2001. Vol. 121. P. 1348-1353.
37. QiangL., Ming T., Kosei I. CDX2 expression is progressively decreased in human gastric intestinal metaplasia, dysplasia and cancer // Modern Pathol. 2007. Vol. 20. P. 1286-1297.
38. Scartozzi M., Galizia E., Freddari F. Molecular biology of sporadic gastric cancer: Prognostic indicators and novel therapeutic approaches // Cancer Treat. Rev. 2004. Vol. 30. P. 451^59.
39. SenoH., OshimaM., TaniguchiMA. CDX2 expression in the stomach with intestinal metaplasia and intestinal-type cancer: Prognostic implications // Int. J. Oncol. 2002. Vol. 21 (4). P. 769-774.
40. Takehana T., Kunimoto K., Kono K. Status of c-erbB-2 in gastric adenocarcinoma: a comparative study of immunohistochemistry, fluorescence in situ hybridization and enzyme-linked immuno-sorbent assay // Int. J. Cancer. 2002. Vol. 98. P. 833-837.
41. Tamura G. Alterations of tumor suppressor and tumor-related genes in the development and progression of gastric cancer // World J. Gastroenterol. 2006. Vol. 12 (2). P. 192-198.
42. Tamura G. Promoter methylation status of tumor suppressor and tumor-related genes in neoplastic and non-neoplastic gastric epithelia // Histol. Histopathol. 2004. Vol. 19. P. 221-228.
43. Varis A., ZaikaA., Puolakkainen P. Coamplified and overexpressed genes at ERBB2 locus in gastric cancer // Int. J. Cancer. 2004. Vol. 109. P. 548-553.
44. Veenstra T.D., Conrads T.P., HoodB.L. et al. Biomarkers: mining the biofluid proteome // Mol. Cell Proteomics. 2005. Vol. 4 (4). P. 409^18.
45. WerlingR.W., Yaziji H., Bacchi C.E. CDX2, a highly sensitive and specific marker of adenocarcinomas of intestinal origin: an im-munohistochemical survey of 476 primary and metastatic carcinomas // Am. J. Surg. Pathol. 2003. Vol. 27 (3). P. 303-330.
46. Wiksten J.P., Lundin J., Nordling S. Comparison of the prognostic value of a panel of tissue tumor markers and established clinico-pathological factors in patients with gastric cancer // Anticancer Res. 2008. Vol. 28. P. 2279-2287.
47. Yamazaki K., Tajima Y, Makino R. Tumor differentiation phenotype in gastric differentiated type tumors and its relation to tumor invasion and genetic alterations // World J. Gastroenterol. 2006. Vol. 12 (24). P. 3803-3809.
48. Yoshihara T., Kadota Y., Yoshimura Y. et al. Proteomic alteration in gastic adenocarcinomas from Japanese patients // Mol. Cancer. 2006. Vol. 5. P. 75.
49. Zheng H., Takahashi H. Pathobiological characteristics of intestinal and diffuse-type gastric carcinoma in Japan: an immu-
nostaining study on the tissue microarray // J. Clin. Pathol. 2007. Vol. 60. P. 273-277.
50. Zhu C.-Q., Shih W., Ling C.-H., Tsao M.-S. Immunohis-tochemical markers of prognosis in non-small cell lung cancer: a review and proposal for a multiphase approach to marker evaluation // J. Clin. Pathol. 2006. Vol. 59. P. 790-800.
Поступила 31.03.10
