CC BY
11УДК 617.713-002.828:616.15
клинико
ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ
ХАРАКТЕРИСТИКА
ИНВАЗИВНОГО
АСПЕРГИЛЛЕЗА У
ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ
ПАЦИЕНТОВ
^адривова О.В. (аспирант)*, 2Фролова Е.В. (зав. лаб.), 2Филиппова Л.В. (н.с.), 2Учеваткина А.Е. (ст.н.с.), 3Волкова А.Г. (пульмонолог), 3Попова М.О. (врач-гематолог), 3Зубаровская Л.С. (зав. отд.), 43юзгин И.С. (зав. отд.), 4Ружинская О.С. (врач-гематолог), ^остелиди С.Н. (ассистент кафедры), 2Игнатьева С.М. (в.н.с.), 2Богомолова Т.С. (зав. лаб.), Чернопятова P.M. (зав. отд.), 2Васильева Н.В. (директор), 3Афанасьев Б.В. (директор), Жлимко Н.Н. (зав. кафедрой)
Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова:1 Кафедра клинической микологии, аллергологии и иммунологии и 2 НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина;3 Институт детской гематологии и трансплантологии имени P.M. Горбачёвой ГБОУ ВПО СПбГМУ им. И.П.Павлова;4 Ленинградская областная клиническая больница, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2013
Инвазивный аспергиллез - тяжелая микотическая инфекция, возникающая преимущественно у иммунокомпрометированных пациентов и часто осложняющая течение гематологических заболеваний. Впервые в отечественной литературе мы представляем результаты исследования клинико-иммунологических особенностей инвазивного аспергиллеза у гематологических больных, получающих цитостатическую терапию, и реципиентов трансплантатов аллогенных гемопоэтических стволовых клеток. Установлено, что инвазивный аспергиллез у гематологических пациентов развился на фоне снижения абсолютного числа всех исследованных субпопуляций лимфоцитов, уровней иммуноглобулинов, дисбаланса функциональной активности нейтро-филов, выраженного угнетения продукции ключевых цитокинов клеточного иммунного ответа ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-8. Особенностью иммунного ответа у реципиентов трансплантатов аллогенных гемопоэтических стволовых клеток явилась низкая продукция ИЛ-17 и IgA по сравнению с показателями у пациентов, получающих цитостатическую терапию.
Ключевые слова: алло-ТГСК, антифунгальная терапия, гемо-бластоз, иммунный ответ, инвазивный аспергиллез, цитостатиче-ская химиотерапия
CLINICAL AND IMMUNOLOGICAL CHARACTERISTIC OF INVASIVE ASPERGILLOSIS IN HEMATOLOGICAL PATIENTS
^hadrivova O.V. (postgraduate student), 2Frolova E.V. (head of the laboratory), 2Filippova L.V. (scientific collaborator), 2Uchevatkina A.E. (senior scientific collaborator), 3Volkova A.G. (pulmonologist), 3Popova M.O. (hematologist), 3Zubarovskaya L.S.
(head of the department), 4Zjuzgin I.S.
(head of the department), 4Ruzhinskaya O.S. (hematologist), ^hostelidi S.N. (assistant lecturer of the chair), 2lgnatyeva S.M. (senior scientific collaborator), 2BogomolovaT.S. (head of the laboratory), 2Chernopyatova R.M. (head of the department), 2Vasilyeva N.V. (director), 3Afanasyev B.V. (director), ^limko N.N. (head of the chair)
North-Western State Medical University named after l.l. Mechnikov:1 Chair of Clinical Mycology, Allergology and Immunology and 2 Kashkin Research Institute of Medical Mycology;3 R.M.Gorbacheva Institute of Children's Hematology and Transplantology of I.P. Pavlov State Medical University;4Leningrad Regional Clinical Hospital, St. Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2013
Invasive aspergillosis - is severe opportunistic infection occurs mainly in immunocompromised patients, and often complicated for hematologic diseases. We present the first time results of a clinical and immunological features studying of invasive aspergillosis in haematological patients receiving cytotoxic therapy and recipients of allogeneic hematopoietic stem cells. Was found, invasive aspergillosis in hematological patients developed against decrease in the absolute number of lymphocytes subsets, immunoglobulin levels, imbalance neutrophil functional activity, significant inhibition of cellular immune response key cytokine production: IFN-y, TNF-a, IL-6, IL-8. Feature of the immune response in recipients of allogenic hematopoietic stem cells was low production ofIL-17 and IgA as compared with the patients receiving cytotoxic therapy.
Key words: allo-HSCT, antifungal therapy, cytostatic
chemotherapy, hematological malignancies, immune response, invasive aspergillosis
* Контактное лицо: Шадривова Ольга Витальевна
Тел.: (812) 303-51-46
ВВЕДЕНИЕ
За последние десятилетия заболевания, вызванные Aspergillus spp., стали важной клинической проблемой. Развитие новых высокоэффективных медицинских технологий, в том числе - аллоген-ной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) и применение высокодозной цитостатической химиотерапии, а также современные методы лечения бактериальных инфекций привели к увеличению популяции иммунокомпроме-тированных пациентов с высоким риском развития инвазивного микоза. Инвазивный аспергиллез (ИА) является наиболее частой микотической инфекцией, осложняющей течение гематологических заболеваний, и составляет от 60% до 82% от всех инвазивных микозов [1, 2]. Несмотря на раннюю диагностику и антифунгальную терапию, летальность остается высокой и, при различных клинических вариантах ИА, варьирует от 48% у пациентов с нейтропенией до 92% у реципиентов алло-ТГСК [3]. Среди больных ИА в Санкт-Петербурге, 86-90% - пациенты с гемобла-стозами. Риск развития ИА у реципиентов ТГСК составляет 5-26% и зависит от выраженности реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) и типа донора: при HLA-идентичной ТГСК - 5-8%, неродственной -10-25%, аутологичной - 0,5-2% [4, 5].
Известно, что у гематологических больных основными предрасполагающими факторами возникновения ИА являются иммунодефицитные состояния разной степени выраженности, возникающие на фоне цитостатической или иммуносупрессивной терапии. К ним относят дефекты фагоцитарной функции макрофагов, стероид-индуцированное подавление киллерной активности макрофагов и нейтро-пению, вызванную высокодозной цитостатической химиотерапией [6]. Оценка иммунологических особенностей ИА и определение их влияния на течение и прогноз заболевания необходимы для дальнейшей разработки перспективных стратегий лечения аспер-гиллезной инфекции [7]. Взаимодействие между эф-фекторными и регуляторными звеньями иммунной системы и динамика изменений иммунологических показателей при ИА изучены недостаточно.
Цель исследования - изучить особенности иммунного ответа у различных категорий гематологических больных (реципиентов алло-ТГСК и пациентов, получающих цитостатическую терапию) на раннем этапе развития инвазивного аспергиллеза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Иммунологическое исследование было проведено 63 гематологическим больным. ВI группу включили 26 пациентов (19 мужчин и 7 женщин) в возрасте от 6 до 59 лет (медиана - 23 года), у которых ИА развился после алло-ТГСК. II группу составили пациенты, у которых ИА развился после цитостатической полихимиотерапии (ПХТ): 37 пациентов (20 женщин и 17 мужчин) в возрасте от 6 до 65 лет (медиана - 44
года). Группа сравнения - 19 гематологических пациентов (8 мужчин и 11 женщин, медиана возраста - 49 лет), получавших цитостатическую химиотерапию, у которых ИА был исключен в ходе обследования. В контрольной группе - 20 практически здоровых людей (медиана возраста - 29 лет). Для диагностики ИА использовали критерии EORTC/MSG 2008 [8].
Инструментальные методы диагностики: обязательно проводили компьютерную томографию легких в режиме высокого разрешения, а также, по показаниям, магнитную резонансную томографию, ультразвуковое исследование органов брюшной полости.
Всем пациентам выполняли фибробронхоскопию с забором бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ). Лабораторная диагностика ИА включала микроскопическое и культуральное исследования. Из образцов биосубстратов (мокрота, БАЛ) готовили препараты в просветляющей жидкости (10% раствор КОН в 10% водном растворе глицерина) с добавлением флуоресцирующего маркера (калькофлуор белый). Окрашенный препарат просматривали в люминесцентном микроскопе, отмечали наличие септированных нитей мицелия, ветвящихся под углом 45°. Из операционного материала готовили гистологические препараты, окрашивая срезы гематоксилином-эозином, проводили PAS-реакцию и окраску по методу Гомо-ри-Грокотта для выявления элементов гриба. Галак-томаннан в сыворотке крови и БАЛ определяли им-муноферментным методом с использованием специфической диагностической тест-системы PLATELIA® Aspergillus (BIO-RAD Laboratories, США). Наличие галактоманнана оценивали путем сравнения оптической плотности исследуемого материала и контрольного образца, содержащего 1 нг/мл галактомананна. Диагностически значимым считали индекс выше «0,5» в сыворотке крови и выше «1,0» - в БАЛ.
Иммунологическое исследование проводили через 1-4 недели от постановки диагноза И А. У больных
I группы медиана дней - 15, во II группе - 14. Состояние иммунореактивности оценивали по показателям клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа, а также факторов врожденной резистентности организма. Абсолютной лимфоцитопенией считали снижение абсолютного количества лимфоцитов крови <1,0-109/л, значимой нейтропенией - снижение абсолютного количества нейтрофилов крови <0,5-109/л. Субпопуляционный состав лимфоцитов определяли иммуноцитохимическим методом с использованием моноклональных антител «DAKO», фагоцитарную и киллерную активность - с использованием референтного штамма С. albicans. Продукцию ИФН-у, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-17, ФНО-а, Г-КСФ определяли в супернатантах клеток крови после 24-часовой индукции фитогемагглютинином с использованием коммерческих иммуноферментных тест-систем («Цитокин», «Вектор-Бест», Россия). Уровни иммуноглобулинов в сыворотке крови оценивали нефелометрическим методом на анализаторе
белков «Turbox plus». Полученные в процессе исследования медико-биологические данные обрабатывали с помощью программной системы STATISTICA 6.0. Для оценки различий между независимыми выборками применяли непараметрический критерий Уилкоксона-Манна-Уитни. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
У всех включенных в исследование больных
I группы диагностировали вероятный ИЛ (100%), во
II группе - вероятный - у 97%, доказанный - у 3%. Диагноз ИЛ подтвержден микологически (микроскопия и посев мокроты, БЛЛ) в I группе у 20% обследуемых; основными возбудителями были: A. fu-migatus - 7%, A.flavus - 7%, A. niger - 3%, A. nidulans - 3%, во II группе - у 25%, возбудители: A. fumiga-tus - 10%, A. niger - 10%, A. flavus - 5%. І Іациентам І группы проводили алло-ТГСК: неродственную — 42%, родственную - 31%, гаплоидентичную - 27%. І Іериод времени после проведения трансплантации до иммунологического обследования составлял от 4 до 270 дней (медиана дней - 40). РТІІХ наблюдали у большинства больных - 88%, гипофункцию трансплантата - 8%. Пациенты II группы получали цито-статическую ПХТ по различным протоколам (Нурег-CVAD+R, COALL-92, ALL 2009, HAD, 7+3, FLAG). Интервал после последнего курса ПХТ до обследования составил от 5 до 50 дней (медиана дней - 36). Структура фоновых заболеваний представлена на рисунке 1.
20*.
IS4
10'.
о*.
фф{о
■I ipsnilJ aII группа
(96 и 97%). Экстрапульмональный аспергиллез с вовлечением центральной нервной системы (ЦНС) отмечали в 7% и 3% случаев в I и II группах соответственно, изолированное поражение кишечника было у одного пациента из группы II. В единичных случаях диагностировали сочетанное поражение легких и ЦНС. Другие клинические особенности каждой группы больных приведены в таблице 1.
Таблица 1
Особенности периода, предшествующего возникновению инвазивного аспергиллеза
Реципиенты ТГСК, N=26 Пациенты, получавшие ПХТ, N=37
Клинические особенности гематологических больных с ИА.
Нейтропения < 0,5x107л 100% 83%
Лимфоцитопения<1,0-107л 84% 72%
Тяжелая бактериальная инфекция 42% 24%
U итомегал овирусн ая инфекция 35% 10%
Использование стимуляторов гемопозза 35% 21%
Клинические признаки инвазивного аспергиллеза
Лихорадка 92% 81%
Кашель 61% 78%
Кровохарканье 7% 8%
У абсолютного большинства больных отмечали нейтропению и лимфоцитопению в период, предшествовавший развитию ИЛ. Основными клиническими проявлениями были лихорадка, рефрактерная к антибиотикам широкого спектра действия, и кашель, в редких случаях - кровохарканье.
Все пациенты, с момента постановки диагноза ИЛ, получали антимикотическую терапию: ворико-назол, амфотерицин В, итраконазол, каспофунгин и позаконазол.
Общая выживаемость в течение 3-х месяцев у реципиентов ТГСК составила 66%, в течение 12 месяцев — 39%; у пациентов II группы - 92% и 84% соответственно.
Сравнительная характеристика показателей иммунного статуса исследуемых групп гематологических больных и лиц контрольной группы представлена на рисунке 2.
Рис. 1. Фоновые заболевания гематологических пациентов с ИА: ОЛЯ - острый лимфобластный лейкоз; ОМЛ - острый миелоидный лейкоз; АА - апластическая анемия; МДС - миелодиспластический синдром; ХЛЛ - хронический лимфолейкоз; ХМЛ -хронический миелолейкоз; ВКЛ - волосатоклеточный лейкоз; ЛХ-л имфома Ходжкина; НХЛ -неходжкинская лимфома; ПКЛ - плазмоклеточный лейкоз
11ри анализе фоновых заболеваний выявили, что ИЛ чаще развивается у пациентов с острым лейкозом, реже наблюдали хронический лейкоз и другие гемобластозы. В отличие от группы I, у пациентов, получавших ПХТ, лимфомы составили 9% фоновых заболеваний. Редкими фоновыми заболеваниями были миелодиспластический синдром и апластическая анемия. В группе сравнения фоновыми заболеваниями были: ЛХ - 31%, ХЛЛ - 31%, НХЛ - 16%, ОЛЛ и МДС составили по 6%.
Среди клинических вариантов ИЛ в обеих группах наиболее часто развивалось поражение легких
о"..
-10*
■3#
у
-30"
-40"
-50"
-60"
-70"
-Х0"
-ЧО"
с*
1 І фуіІІКІ
II ірушш ■ группа сравнения
Рис. 2. Количественные показатели субпопуляционного состава лимфоцитов гематологических больных в процентах по отношению к контрольной группе
У всех групп гематологических больных, включенных в исследование, выявили снижение количества лейкоцитов за счет лимфоцитов, по сравнению с показателями контрольной группы. Соответственно, было снижено абсолютное число всех исследованных субпопуляций лимфоцитов (Рис. 2). Установлено изменение способности предшественников лимфоцитов к дифференцировке в различные субпопуляции, что привело к достоверному снижению относительного числа Т-хелперов ((.'04+) и повышению процентного содержания цитотоксических Т-лимфоцитов (СЕ)8+) у гематологических больных, по сравнению с показателями контрольной группы. Это подтверждено достоверными различиями в значениях иммунорегуляторных индексов (ИРИ) (Рис. 2). Особенностью гематологических больных с ИЛ после алло-ТГСК было достоверно высокое содержание относительного числа СВ8+ лимфоцитов, по сравнению с показателями группы сравнения.
11ри анализе показателей гумо рального иммунного ответа установили снижение абсолютного количества В-лимфоцитов (С020) (Рис. 2) и уровней иммуноглобулинов всех исследованных классов у гематологических больных, по сравнению с контрольными значениями (табл. 2).
Таблица 2.
Уровни иммуноглобулинов у гематологических больных
Пока- затели (г/л) Пациенты после алло-ТГСК, (п=26) Пациенты, получающие ПД (п=37) Группа сравнения, (п=19) Контрольная группа (п=20)
Медиана (25%+75%) Медиана (25%+75%) Медиана (25%+75%) Медиана (25%+75%)
1дА 0,53 0.31+0.89 0,94 0.51+2.39 0,68 0.39+1.34 1,78 1.78+1.84
*0.000 1**0.251 *0.009 I **0.261 *0.001
1дМ 0,68 0.35+0.99 0,56 0.25+0.98 0,75 0.22+1.09 1,16 1.06+1.17
*0.000 1**0.688 *0.000 1 **0.751 *0.001
1дС 6,2 3.9+11.1 9,17 4.8+14.6 7,5 4.1+12.4 13,5 12.95+14.83
*0,000 1**0,945 *0,006 I **0,277 *0,000
Представлены медианные значения с интерквартильным размахом (25% +75%); * - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой (р< 0,05); **-достоверность различий показателей с группой сравнения (р< 0,05)
Установлена достоверно более низкая продукция иммуноглобулина Л (^Л) у гематологических больных ИЛ после алло-ТГСК, по сравнению с больными ИЛ, получающими 11ХТ.
11ри изучении функционального состояния ней-трофильного звена системы фагоцитирующих клеток отмечали снижение киллерной активности ней-трофилов более чем у половины больных I и II групп (62% и 70% соответственно) на фоне повышенной фагоцитарной активности нейтрофилов у гематологических больных ИЛ в обеих группах, относительно показателей группы сравнения (Рис. 3).
Рис. 3. Показатели функциональной активности нейтрофилов у гематологических больных 11ри оценке функциональной активнос ти лейкоцитов периферической крови у больных ИЛ, по сравнению с показателями группы сравнения, установлены нижеследующие особенности. Выявили достоверное снижение продукции провоспалительных цитокинов ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-8, которые обеспечивают антифунгальную активность фагоцитирующих клеток и привлекают их в очаг инфекционного процесса. Напротив, у больных группы сравнения обнаружили повышение выработки ИЛ-6 и ФНО-а. Снижение уровней ИЛ-17, Г-КСФ и противовоспалительного цитокина ИЛ-10 наблюдали у всех обследованных гематологических больных, но наиболее низкую продукцию отмечали у пациентов с ИЛ. Отметим, что у больных после алло-ТГСК обнаружили самые низкие показатели всех исследуемых цитокинов, а выработка ИЛ-17 была достоверно более низкой в этой группе, по сравнению с показателями больных, получавших цитостатическую 11ХТ (табл. 3).
Таблица 3
Цитокиновый профиль различных групп гематологических больных
Показа- тели (пг/л) Пациенты после алло-ТГСК, (п=26) Пациенты,получающие ПХТ,(п=37) Группа сравнения, (п=19) Контрольная группа, (п=20)
Медиана (25%+75%) Медиана (25%+75%) Медиана (25%+75%) Медиана (25%+75%)
ИФН-у индуци- рован- ный 110,5 34.0+470.0 358,0 75.0+698.0 702,0 495.0+1041.0 749,0 544.0+1258.0
*0,000 **0,000 *0,000 **0,004
ФНО-а 86,0 25,0+328.0 236,5 25.0+391.0 451,0 398.0+468.0 369,0 318.5+420.5
*0.000 I **0,000 *0.000 I “0.000 *0.039
ИЛ-6 212,0 14,0+545,0 98,0 25,0+572,0 546,5 406,5+669,5 279,5 233.0+367.0
I **0,005 I **0,003 *0,000
ИЛ-8 289,0 208,0+328,0 277,0 91.0+344,0 314,5 294,5+350.0 367,0 316.5+451.0
*0,001 1**0,041 *0.000 I **0.047
ИЛ-10 23,0 1.0+65.0 54,0 2.0+135.0 113,0 83.5+179.0 333,0 302.0+411.0
*0,000 1 **0.000 *0.000 1**0.037 *0.000
ИЛ-17 8,0 2,0+18,0 23,0 11.0+67.0 37,0 13.0+71.0 367,0 316.5+451.0
*0.000 1**0.001 *0.000 I *0.000
Г-КСФ 34,0 0.0+162,0 18,0 0.0+159.0 184,0 145.0+ 281.0 311,5 257.5+ 348,5
*0,000 |**0,003 *0,000 | **0,001 *0,007
Представлены медианные значения с интерквартильным размахом (25% +75%); * - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой (р< 0,05); **- достоверность различий показателей с группой сравнения (р< 0,05)
ОБСУЖДЕНИЕ
Современные подходы в лечении гемобласто-зов основаны на применении высоких доз цитоста-тических препаратов, что позволяет значительно увеличить частоту достижения полной ремиссии. Например, при остром лейкозе элиминация лейке-мического клона достигается за счет использования миелотоксических противоопухолевых препаратов, которые быстро уменьшают объем опухолевой массы, вызывая глубокую аплазию костного мозга. На этапе консолидации ремиссии, под воздействием вы-сокодозной химиотерапии, происходит уменьшение числа оставшихся после индукции лейкемических клеток, что увеличивает эффективность лечения и снижает риск рецидива заболевания. У реципиентов алло-ТГСК возникновение микотической инфекции в ранний посттрансплантационный период (20-40 день) связано, как правило, с острой РТПХ или ней-тропенией, индуцированной интенсивной химиотерапией; в поздний период (после 100 дней), развитие ИА происходит на фоне восстановления количества нейтрофилов, но выраженного нарушения их функции [9]. Состояние нейтрофильного звена иммунитета - не единственный фактор, определяющий восприимчивость организма к микотической инфекции. Известно, что препараты, применяемые для лечения злокачественных новообразований крови, в том числе глюкокортикостероиды, способны подавлять пролиферацию и активацию Т-лимфоцитов, а также выработку провоспалительных цитокинов [10, 11]. Количество клинических исследований, изучающих особенности иммунного ответа при ИА у гематологических пациентов, немногочисленно. Экспериментальными данными подтверждено, что в защите от оппортунистических грибковых инфекций ведущая роль принадлежит Т-хелперам 1-го типа и провоспалительным цитокинам, активирующим нейтрофилы и макрофаги, которые непосредственно уничтожают клетки грибов [12]. Считают, что баланс между ключевыми цитокинами, обеспечивающими противогрибковую резистентность, такими как ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-8, и противовоспалительными цитокинами ИЛ-4 и ИЛ-10, определяет исход инфекционного процесса [13]. ФНО-а стимулируют фагоцитарную активность нейтрофилов, Г-КСФ способствует дифференцировке, пролиферации и активации мононуклеарных клеток и макрофагов и стимулирует продукцию провоспалительных цитокинов. В экспериментальных исследованиях установлено значительное повышение уровней ФНО-а и ИФН-у в ответ на инфицирование A. flavus [14]. Доказательством значимой роли ИФН-у, продуцируемого Т-хелперами 1-го типа, в защите против грибковых инфекций является повышение уровня выживаемости у мышей с ИА, которым вводили рекомбинантный ИФН-у [15]. Роль ИЛ-10 в иммунном ответе против грибов рода Aspergillus spp. не изучена окончательно. Известно, что он является мощным
иммуносупрессивным цитокином, снижающим фагоцитоз и секрецию провоспалительных цитокинов ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-12, и, как следствие, защитную функцию клеточно-опосредованного иммунитета. При исследовании гематологических пациентов с ИА установили, что прогрессирующее течение ИА коррелировало с низкой пролиферативной активностью Т-лимфоцитов, сниженной продукцией ИФН-у и повышенным уровнем ИЛ-10, по сравнению с показателями функциональной активности клеток у пациентов с благоприятным исходом грибковой инфекции [6]. Однако в последующих наблюдениях было выявлено высокое содержание в сыворотке крови ИЛ-10 у больных с благоприятным исходом ИА, а повышенные уровни ИЛ-6 и ИЛ-8 были предшественниками неблагоприятного течения заболевания [16]. Предполагают, что уровни цитокинов в крови при ИА могут служить маркерами прогрессии заболевания, а также показателями эффективности лечения [17]. Однако изучение отдельных медиаторов иммунного ответа недостаточно для понимания роли цитокинов в формировании защитного иммунного ответа при развитии микотической инфекции.
Впервые в отечественной литературе мы представляем результаты исследования иммунологических особенностей у гематологических больных с ИА после цитостатической ПХТ и алло-ТГСК. Выявили изменение способности предшественников лимфоцитов к дифференцировке в различные субпопуляции у всех включенных в исследование гематологических больных; снижение относительного и абсолютного числа Т-хелперов (СЭ4+), естественных киллеров (СЭ16+) и повышение относительного числа цитотоксических Т-лимфоцитов (СЭ8+), по сравнению с показателями в контрольной группе. Эти результаты согласуются с данными о том, что именно субпопуляция Т-хелперов наиболее чувствительна к действию препаратов, используемых при цитостатической ПХТ Усиление дифференцировки Т-лимфоцитов в цитотоксическую субпопуляцию у гематологических больных с ИА после алло-ТГСК является иммунологическим признаком развития РТПХ, которая, по клиническим данным, установлена у 88% больных, включенных в исследование. При изучении показателей гуморального иммунного ответа наблюдали снижение продукции иммуноглобулинов у гематологических больных по сравнению с контрольными показателями. У больных ИА после алло-ТГСК концентрация 1дА достоверно отличалась от значений в группе сравнения. Снижение число нейтрофилов и нарушения их функциональной активности считают наиболее известными факторами риска развития ИА у больных на фоне цитотоксической ПХТ и после ТГСК [18]. У всех включенных в исследование пациентов установили снижение киллерной активности нейтрофилов, но повышенную фагоцитарную активность нейтрофилов выявили только у гематологических больных с ИА. Это может являться признаком нарушения ме-
ханизмов микробоцидности фагоцитирующих клеток, активность которых во многом контролируется балансом про - и противовоспалительных цитоки-нов. В нашем исследовании установлено снижение продукции ИФН-у, определяющего напряженность клеточного иммунного ответа, у гематологических больных с И А, что согласуется с данными других исследователей [6]. Известно, что, наряду с ИФН-у, такие провоспалительные цитокины, как ФНО-а, ИЛ-6 и ИЛ-8, секретируемые преимущественно клетками миелоидного происхождения, в том числе -альвеолярными макрофагами, дендритными клетками, моноцитами/макрофагами и нейтрофилами, играют важную роль в поддержании противогрибковой активности фагоцитирующих клеток [19]. В нашем исследовании способность клеток крови к продукции ФНО-а, ИЛ-6 и ИЛ-8 была достоверно ниже у гематологических больных с ИЛ после ПХТ и алло-ТГСК, по сравнению с показателями пациентов без ИЛ. Выработка ФНО-а была существенно снижена у больных после алло-ТГСК, по сравнению с показателями его продукции у больных, получавших только цитостатическую ПХТ. Полученные данные согласуются с результатами экспериментальных исследований на животных, в которых показано, что ФНО-а повышает поглощение мицелия грибов легочными альвеолярными макрофагами мышей in vitro и усиливает разрушение нейтрофилами гиф Aspergillus spp., кроме того, истощение ФНО-а у мышей приводит к увеличению их смертности [12]. Противоположные данные были получены при исследовании динамики уровней цитокинов в сыворотке крови у гематологических больных с ИЛ после алло-ТГСК, получавших антифунгальную терапию. Показано, что высокие уровни ИЛ-6, ИЛ-8 могли быть ранними предшественниками неблагоприятного исхода ИЛ [16].
В нашем исследовании установлена низкая продукция Г-КСФ и ИЛ-17 у гематологических больных ИЛ, после цитостатической ПХТ и алло-ТГСК, по отношению к показателям группы сравнения. Однако при экспериментальных исследованиях выявили противоречивую роль ИЛ-17 в защите против Aspergillus spp. Инфицированные мыши, у которых блокировали ИЛ-23 или ИЛ-17, имели пониженное содержание грибов в легких по сравнению с контрольными животными [20]. По данным других авторов, повышенная восприимчивость мышей к аспергиллезу была связана со снижением числа ней-трофилов и неспособностью клеток легких вырабатывать ИЛ-23 и ИЛ-17 в течение первых 24 ч после заражения [21]. Существует ограниченное число клинических исследований роли IL-17 в защите организма против аспергиллезной инфекций у человека. При инкубации мононуклеарных клеток человека с мицелием грибов in vitro выявили, что A. fumigatus являются слабыми индукторами ИЛ-17, но активируют Тх1. Эти данные согласуются с клиническими результатами: в бронхоальвеолярном лаваже и в сыворотке крови больных ИЛ были обнаружены очень
низкие уровни 1Ь-17 [22].
В обеих группах гематологических больных ИЛ отмечали низкие уровни продукции ИЛ-10, который традиционно считают противоспалительным цито-кином, по сравнению с данными группы сравнения. Напротив, в работе других исследователей было показано, что высокое содержание в сыворотке крови ИЛ-10 у больных ИЛ в течение недели лечения противогрибковыми препаратами было связано с благоприятным исходом [16]. Согласно этим данным, можно предположить, что роль ИЛ-10 в развитии инфекционного процесса намного сложнее, чем считали раннее, и он может быть ключевым регулятором воспалительных ответов.
ВЫВОДЫ
1. У всех обследованных гематологических больных после ПХТ и алло-ТГСК установлены нарушения клеточного звена иммунитета: снижение абсолютного числа Т-хелперов (СБ4+), цитотоксиче-ских Т-лимфоцитов (( !1.)8+), естественных киллеров (0316+) и усиление способности Т-лимфоцитов к дифференцировке в цитотоксическую субпопуляцию (СВ8+); снижение активности гуморального иммунного ответа: уменьшение числа В-лимфоцитов (С1.)20+) и уровней иммуноглобулинов всех классов С^Є, ІцМ и 1цЛ); снижение функциональной активности нейтрофилов: угнетение их киллерной способности.
2. Инвазивный аспергиллез развился у гематологических больных на фоне выраженного угнетения продукции ключевых цитокинов клеточного иммунного ответа ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-8 и дисбаланса функциональной активности нейтрофилов.
3. У пациентов с ИЛ установлены иммунологические различия: достоверно низкая продукция ИЛ-17 и 1дА у гематологических больных после алло-ТГСК, по сравнению с показателями пациентов, получавших ПХТ.
4. Наиболее существенными изменениями, отражающими напряженность иммунного ответа у гематологических больных с ИЛ, являлись нарушения показателей функциональной активности клеток крови. В дальнейшем, на основании изучения динамики иммунологических показателей на разных этапах ИЛ (начало заболевания, разгар, фаза рекон-валесценции) у различных групп гематологических больных, будет определено прогностическое значение иммунологических показателей и разработан алгоритм иммунологического обследования.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Kousha М., Tadi R. Soubani А.О. Pulmonary aspergillosis: a clinical review // Europ. Respirat. Rev. - 2011. - Vol. 20, №21. - P. 156-172.
2. Попова M.O., ЗубаровскаяЛ.С., Климко H.H., Афанасьев Б.В. Инвазивные микозы при трансплантации гемопоэти-ческих стволовых клеток // Тер. архив. - 2012. - №7. - Р. 50-57.
3. Zmeili О., Soubani A. Pulmonary aspergillosis: a clinical update // Oxford Journals. - 2007. - Vol. 100. - P. 317-334.
4. Cordonnier C., Ribaud P., Herbrecht R. Prognostic factors for death due to invasive aspergillosis after hematopoietic stem cell transplantation: A 1-year retrospective study of consecutive patients at French transplantation centers // Clin. Infect. Dis. - 2006. - Vol. 42. - P. 955.
5. Васильева H.B., Климко H.H., Цинзерлинг BA. Диагностика и лечение инвазивных микозов: современные рекомендации // Вестник СПБ МАПО. - 2010. - Т. 2, №4. - С. 5-18.
6. Hebart Н., Bollinger С., Fisch P., et al. Analysis of T-cell responses to Aspergillus fumigatus antigens in healthy individuals and patients with hematologic malignancies // Blood. - 2002. - Vol. 100, №13. - P. 4521-4528.
7. Carvalho A., Cunha C., Bistoni F. and Romani L. Immunotherapy of aspergillosis // Microbiol, and Infect. - 2012. - Vol. 18, №2. - P. 120-125.
8. De Pauw B., Walsh T.J., Donnelly J.P., et al. Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group (EORTC/MSG) Consensus Group // Clin. Infect. Dis. - 2008. - Vol. 46, №12. - P. 1813-21.
9. Marr K.A., Carter R.A., Boeckh М., et al. Invasive aspergillosis in allogeneic stem cell transplant recipients: changes in epidemiology and risk factors // Blood. - 2002. - Vol. 100, №13. - P. 4358-4366.
10. Zitvogel L., Apetoh L., Ghiringhelli F., Kroemer G. Immunological aspects of cancer chemotherapy // Immunol. - 2008. -
Vol. 8. - P. 59-73.
11. Motoyoshi Y., Kaminoda K., Saitoh O., et al. Different mechanisms for anti-tumor effects of low - and high-dose cyclophosphamide // Oncology Reports. - 2006. - Vol. 16, №1. - P.141-146.
12. Brahm H. Segal. Role of macrophages in host defense against aspergillosis and strategies for immune augmentation // The Oncologist. - 2007. - Vol. 12, № 2. - P. 7-13.
13. Stevens D.A. Thl/Th2 in aspergillosis // Medical Mycology. - 2006. - Vol. 44, №1. - P. 229-235.
14. AnandR., Tiwary D.N Thl and Th2 cytokines in a self-healing primary pulmonary Aspergillus flavus infection in BALB/c mice // Cytokine. - 2010. - Vol. 52. - P. 258-264.
15. Shao C., Qu /, He L., et al. Transient overexpression of gamma interferon promotes Aspergillus clearance in invasive pulmonary aspergillosis // Clin, and Experim. Immunol. - 2005. - Vol. 142. - P. 233-241.
16. Chai L.Y.A., Netea M.G., Teerenstra S., et al. Early proinflammatory cytokines and C-reactive protein trends as predictors
of outcome in invasive aspergillosis II]. Infect. Dis. - 2010. - Vol. 202, № 9. - P. 1454-1462.
17. Chai L.Y., Vonk A.G., Kullberg B-J., Netea M.G. Immune response to Aspergillus fumigatus in compromised hosts: from bedside to bench // Future Microbiol. - 2011. - Vol. 6, №1. - P. 73-83.
18. ParkS.J. and Mehrad B. Innate immunity to Aspergillus species // Clin. Microbiol. Rev. - 2009. - Vol. 22, №4. - P. 535-551.
19. Frank L. van de Veerdonk, Mihai G. Netea. T-cell subsets and antifungal host defenses // Curr. Fungal Infect. Reports. -2010. - Vol. 4, № 4. - P. 238-243.
20. Zelante Т., De Luca A., Bonifazi P., et al. IL-23 and the Thl7 pathway promote inflammation and impair antifungal immune resistance // Europ. J. of Immunol. - 2007. - Vol. 37, №10. - P. 2695-2706.
21. Werner J.L., Metz A.E., Horn D., et al. Requisite role for the dectin-1 beta-glucan receptor in pulmonary defense against Aspergillus fumigatus II The J. of Immunol. - 2009. - Vol. 182, №8. - P. 4938-4946.
22. Chai L.Y., van de Veerdonk F., Marijnissen R.J., et al. Anti-Aspergillus human host defence relies on type 1 T helper (Thl), rather than type 17 T helper (Thl7), cellular immunity // Immunology. - 2010. - Vol. 130, №1. - P. 46-54.
Поступила в редакцию журнала 06.05.13
Рецензент: Ю.В. Борзова
