CC BY
24
ОБЗОРЫ И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ / REVIEWS AND PROBLEMATIC ARTICLES DOI: 10.24412/1815-3917-2022-1-14-23
DOI: 10.24412/1815-3917-2022-1 -14-23
Клеточная цитотоксичность иммуноцитов и методические подходы к ее оценке in vitro
М.К.Мамедов1, АА.Кадырова1, H.О.Гудpатов1, Г.М.Мамедов2
1Международная экоэнеpгетическая академия, г.Баку, Азербайджан;
2Азербайджанский институт усовершенствования вpачей им.А.Алиева, г.Баку, Азербайджан
Резюме: Авторы представили определяющую информацию о клеточной цитоксичности и кpатко охарактеризовали важнейшие типы этого феномена и эффекторные клетки (иммуноциты) и возможные клетки-мишени, участвующие в процессе клеточной цитотоксичности.
Кроме того статья содержит общий обзор и основополагающую информацию об основных методических подходах количественной оценки клеточной цитотоксичности у человека и животных. Ключевые слова: клеточная цитотоксичность, иммуноциты.
Для цитирования: Мамедов М.К., Кадырова А.А., Гудратов Н.О., Мамедов Г.М. Клеточная цитотоксичность иммуноцитов и методические подходы к ее оценке in vitro. Биомедицина (Баку). 2022;20(1): 14-23. DOI: 10.24412/1815-3917-2022-1-14-23
Поступила в редакцию: 06.05.2022. Принята в печать: 03.06.2022.
Cellular cytotoxicity of immunocytes and methodical approaches to its evaluation in vitro
Mamedov M.K.1, Kadyrova A.A.1, Gudratov N.O.1, Mamedov G.M.2
international Ecoenergy Academy, Baku, Azerbaijan;
2A.Aliyev's Azerbaijan Institute for Physicians Improvement, Baku, Azerbaijan
Abstract: The authors presented definitive information about cellular cytotoxicity and briefly characterised main types of this phenomena and effectors cells (immunocytes) and possible target cells participated in process of cellular cytotoxicity. Besides, the article contains general review with basic information about main methodical approaches used for quantitation of cellular cytotoxicity at humans and animals. Key words: cellular cytotoxicity, immunocytes.
For citation: Mamedov M.K., Kadyrova A.A., Gudratov N.O., Mamedov G.M. Cellular cytotoxicity of immunocytes and methodical approaches to its evaluation in vitro. Biomedicine (Baku). 2022;20(1):14-23. DOI: 10.24412/1815-3917-20221-14-23
Received: 06.05.2022. Accepted: 03.06.2022.
Для корреспонденции: М.К.Мамедов
Профессор, доктор медицинских наук, отделение биомедицины Международной экоэнергетической академии,, г.Баку, Азербайджан.
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9777-1914 e-mail: m.mamedov@inbox.ru
Corresponding author: Mamedov M.K.
Professor, Doctor of Medical Sciences, Department of Biomedicine, International Ecoenergy Academy, Baku, Azerbaijan ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9777-1914 e-mail: m.mamedov@inbox.ru
Известно, что иммунитет, как таковой, является важнейшим компонентом функционирующей в организме системы поддержания структурного го-меостаза, который обеспечивается жестким надзором организма над гомогенностью его клеточных популяций и отвечает за немедленную элиминацию всех клеточных элементов, которые несут на себе какие-либо признаки генетической чуже-родности [1, 2].
В свою очередь, обеспечение функций иммунитета осуществляется посредством последовательно вовлекаемых в процесс и преемственно формируемых реакций врожденного иммунитета (ВИМ) и приобретенного иммунитета (ПИМ), эффективно распознающих появившиеся в организме чужеродные элементы и интенсивно атакующих эти элементы с целью их уничтожения или элиминации из организма [3].
При этом, хотя ВИМ и ПИМ отличаются друг от друга по механизмам распознавания чужеродных (или ставших чужеродными) объектов, формируемые ими защитные реакции реализуются посредством сходных механизмов и при участии особых лимфоидных или миелоидных клеток, объединяемых под рубрикой "клетки-эффекторы" (КЭ) иммунной системы. Важнейшими из таких механизмов считают: фагоцитоз, осуществляемый макрофагами или нейтрофилами, лизис клеток при участии системы комплемента, а также клеточную цитотоксичность (ЦТ).
Клеточная цитотоксичность (КЦТ) - это описанный in vitro в середине 60-х гг ХХ в феномен такого негативного воздействия клеток иммунной системы на другие клетки, которое (без участия комплемента) приводит к гибели последних; такие клетки в противовес КЭ, называют "клетками-мишенями" (КМ). В роли КМ могут выступать алло-генные и ксеногенные клетки, опухолевые клетки и собственные клетки, модифицированные вирусами.
Поскольку в естественных условиях КЦТ им-муноцитов направлена на разрушение и элиминацию из организма стареющих и поврежденных клеток, и, таким образом, обеспечивает поддержание структурного гомеостаза путем клиренса многоклеточного организма от отживших клеток и продуктов их распада, КЦТ сегодня считается типовой эффекторной защитной реакцией клеток иммунной системы в отношение любых генетически чужеродных клеток и, даже, иммуноцитов [4].
КЦТ нельзя смешивать с описанной еще в 1956 г "комплементзависимой цитотоксичностью", в ходе развития которой лимфоциты, имеющие соответствующий антиген и выступающие как КМ,
под воздействием антител (АТ) и при участии комплемента (но без участия каких-либо КЭ) утрачивают свою жизнеспособность [5]. В 1964 г на основе такой цитотоксичности был разработан удобный микропланшетный тест со "смешанной культурой лимфоцитов" - его стали широко применять для определения антигенов главного комплекса гистосовместимости в практике клинической трансплантологии [6].
КЦТ способны проявлять макрофаги и нейтрофилы, но в несравненно большей степени она характерна для лимфоцитов.
Изначально, в конце 60-х гг ХХ в способность к КЦТ была обнаружена у тимус-зависимых лимфоцитов, которые в 1969 г назвали Т-лимфоцита-ми: последние проявляли КЦТ лишь в отношение клеток, связанных с АТ. Такую КЦТ назвали "антитело-зависимой клеточно-опосредованной", а реализующие ее Т-лимфоциты назвали "Т-киллерны-ми", а позже -"Т-цитотоксическими лимфоцитами" (ЦТЛ) [7].
В 1973 г было установлено, что КЦТ может проявляться и в отношении клеток, не связанных с АТ: такую КЦТ назвали "спонтанной или естественной КЦТ". Но вскоре выяснилось, что такую КЦТ проявляют лишь некоторые типы, так называемых, О-лимфоцитов, лишенных рецепторов как Т-лимфоцитов, так и В-лимфоцитов [8].
В 1975 г в составе популяция О-лимфоцитов были найдены "большие гранулосодержащие" клетки с иммунофенотипом CD16/CD57, которые, в отличие от ЦТЛ, оказывали киллерное действие без предварительной сенсибилизации АТ. Поскольку они обладали естественной (спонтанной) ЦТ, их назвали "естественными киллерными клетками" (ЕКК) [9]. Как выяснилось, именно ЕКК оказались теми КЭ, которые играют ключевую роль в обеспечении антиген-независимых реакций, лежащих в основе ВИМ и защите организма от вирусных инфекций и опухолевого роста [10].
Хотя и ЦТЛ и ЕКК имеют лимфоидный гистогенез, они иммунологически распознают свои КМ по-разному.
Так, ЦТЛ распознают КМ имеющимся на их поверхности АТ, а точнее Fab-фpагментов иммуноглобулинов, связанных с соответствующими мембранными антигенами этих клеток. Итак, ЦТЛ распознают свои КМ по их антигенам и потому считаются эффекторами ПИМ и реализаторами антиген-зависимых иммунологических реакций.
Между тем, ЕКК распознают КМ без какой либо связи с антигенами и лишь по отсутствию на поверхности КМ рецепторов главного комплекса гис-тосовместимости. ЕКК способны обнаруживать
ОБЗОРЫ И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ / REVIEWS AND PROBLEMATIC ARTICLES DOI: 10.24412/1815-3917-2022-1-14-23
находящиеся на поверхности КМ особые консервативные мембранные структуры, сформированные молекулами адгезии в комплексе с другими элементами гликокаликса клеток животных или клеточной стенки (у растений и прокариотов) - эти структуры объединяют под названием "патогенассоциированных молекулярных паттернов [11].
Кроме того, ЕКК способны распознавать КМ и по наличию на их поверхности Fc-фрагментов иммуноглобулинов (за счет рецептора FcR III, т.е. CD16). Формально это означает то, что ЕКК способны индуцировать "антитело-зависимую КЦТ". Однако, в действительности такая КЦТ не является антиген-зависимой, поскольку она связана лишь с неспецифической частью любых, а не конкретных АТ.
Несмотря на указанные выше отличия в механизмах распозпознавания чужеродных биоагентов цитотоксическое действие (ЦД) на них как ЦТК, так и ЕКК реализуется посредством общих механизмов: контактного и/или и дистантного (секреторного).
В контактном механизма ЦД происходит за счет формирования "иммунологического синапса" между КЭ и КМ - в КЭ формируются гранулы, содержащие перфорин (аналог С9 фрагмента комплемента) и гранзимы (гидролитические ферменты). Эти гранулы освобождаются из КЭ в направлении КМ - при контакте с мембраной КМ перфо-рин полимеризуется и встраивается в мембрану, формируя в ней пору диаметром около 100 нм - в эту пору проникают гранзимы - ферменты, инициирующие апоптоз КМ или даже их гибель.
Поэтому in vitro степень разрушения КМ приближается к лизису и полной деструкции.
Второй эффекторный механизм ЦД связан с быстрым выделением прямо и опосредованно действующих цитотоксических субстанций различной природы: гамма-интерферон, фактор некроза опухоли-альфа, некоторые интерлейкины, лимфотоксин, лизосомальные, пероксисомные и другие ферменты и т.д.
Кроме того, в основе ЦД лимфоцитов может лежать и, так называемый, "гипероксидативный взрыв" (сверхбыстрая продукция свободноради-кальных соединений, повреждающих экзогенные структуры). Но этот механизм ЦД более характерен для реакций, инциируемых нейтрофилами и макрофагами.
Очевидно, что информация о цитотоксичес-ком потенциале иммуноцитов может иметь важное диагностическое значение, а сведения о характере влияния того или иного фактора на КЦТ могут ока-
заться полезными с точки зрения использования этого фактора для стимуляции защитных реакций организма. Однако, получение такой информации возможно только с помощью адекватных методов оценки ЦА иммуноцитов.
Попытки разработать метод визуального мо-ниторирования процесса реализации КЦТ in vitro, предпринятые еще в середине 70-х гг ХХ в, показали, что функциональную активность КЭ, полученных из периферической крови, в принципе можно оценивать путем визуально-микроскопического выявления поврежденных клеток, определяемых по способности окрашиваться трипановым синим или аламаровым синим.
До постановки такого теста в системе подсчитывали общее число клеток, а после его завершения подсчитывали число живых (неокрашеных) и мертвых (окрашенных) клеток. Однако такой подход оказался трудоемким и не точным: позволяя обнаруживать факт киллинга КМ, он не обеспечивал возможность с точностью количественно оценивать этот процесс. Поэтому данный подход сохранил свое значение лишь для демонстрации КЦТ и лишь в дидактических целях [12].
В конце 60-х гг ХХ в был предложен метод контроля процесса реализации КЦТ in vivo, основанный на введении в состав КМ радиоактивной "метки", которая при повреждении этих клеток выходит из них наружу и детектируется радиометрическим устройством.
Первой из таких меток стал изотоп хрома Cr-51, продуцирующий гамма-излучение и имеющий период полураспада 27 дней. В качестве содержащего его была использована натриевая соль хрома Cr-51 (Na2CrO4), активно поглощаемая из среды КМ, культивируемыми in vitro. При разрушении КМ Cr-51 вновь "переходил" в жидкую фазу, где и мог быть обнаружен соответствующим прибором [13].
Этот тест позволил количественно оценивать цитотоксическую активность (ЦА) эффекторных клеток: количественный показатель ЦА, определяемый по доле КМ, погибших после контакта с КЭ назвали "индексом ЦА" (ИЦА), а метод назвали "хромовым тестом" [14].
Выбор указанной выше соли был обусловлен тем, что она свободно проникала в живые клетки, где Cr-51 прочно связывался с белками внутриклеточных структур и оставался внутри клеток на всем протяжении их жизни (он покидал из только после повреждения или гибели). Поэтому в процессе даже продолжительной культивации этих клеток Cr-51 в культуральной жидкости не выявлялся, а его появление в ней прямо указывало на
разрушение клеток. Эти особенности и послужили идеологической основой такого теста, который до настоящего времени считается эталонным методом для оценки интенсивности КЦТ как ЦТЛ, так и ЕКК [12].
С помощью этого теста можно было оценивать ЦА КЭ в отношении таких КМ, как опухолевые или зараженные вирусом клетки. Однако, в процессе многократного воспроизведения ЦД с разными КМ для получения сопоставимых результатов было рекомендовано использовать две стандартные линии опухолевых клеток: 1) линию К-562 - клетки эритролейкемии человека (применяется при оценке КЦТ КЭ у человека) и 2) линию YAC1 (или ACC96) - клетки лейкоза Молони мышей линии Balb/C используются при определении КЦТ КЭ мышей). Клетки этих линий легко ассимилировали Cr-51 (как метаболит) и имели высокую чувствительность к деструктиному действию КЭ.
Параллельно с этим для культивирования этих КМ (а также КЭ) стали использовать питательную среду, разработанную в 1966 г в Джорджем Муром и коллегами в Roswell Park Memorial Institute (г. Буффало, США), содержашую полный набор нутриентов глутатион в качестве антиоксиданта (среда RPMI-1640).
Перед постановкой теста в среде RPMI-1640 готовят суспензию соответствующих КЭ в среде RPMI-1640 с известной концентрацией клеток. КМ могут с помощью известных методик выделяться из крови человека или из гомогената селезенки мышей. Посторонние клетки из суспензий удаляются каким-либо методом (к примеру, макрофаги удаляют путем приведения суспензии в контакт со стеклом или нейлоновой ватой, к которым они прилипают).
Воспроизведение теста начинается с культивирования КМ в среде RPMI-1640, в которую добавляют содержащую Cr-51 соль (с удельной радиоактивностью порядка 5 мкКюри/моль) и инкубируют 2 часа при температуре 37°C. Далее взвесь КМ центрифугируют и тщательно отмывают той же средой от изотопа, не утилизированного клетками и, в и тоге, готовят суспензию, содержащую известное число КМ.
Такую суспензию вносят в пробирки со средой RPMI-1640 и в эти же пробрки вносят суспензию КЭ с известной концентрацией клеток. При этом, добиваются соотношения числа КМ и КЭ от 1:10 до 1:200 (КЭ должно быть значительно больше КМ, что обеспечивает более де-монстритивный результат). Полученную смесь помещают в инкубатор с углекислым газом на 4-8 ча-
сов, а затем осаждают клетки центрифугированием. Наконец супернатанты собирают в специальные пробирки, в которых радиоактивность подсчитывают с помощью лабораторного гамма-счетчика; результаты выражают в единицах "срт" (count рег minute, т.е. число импульсов в минуту).
Результаты "хромового" теста отличаются объективностью и хорошей точность, но его недостатком является необходимость работы с радионуклидом, излучающим жесткие гамма-лучи. Для преодоления этого недостатка были разработаны аналогичные тесты, на основе использования иных радиоактивных "меток" и, главное, излучающих менее опасные бета-лучи. Этими радионуклидами "метили" раные метаболиты, которые ассимилля-ционно поглощались культивируемыми in vitro клетками и сохранялись в их составе до их разрушения - далее "метки" переходили в жидкую фазу, где и могли быть детектироваться счетчиками радиации. В качестве таких метаболитов использовались либо аминокислоты (пролин, аргинин), либо предшественники нуклеотидов, например, ти-мидин или уридин.
Среди таких вариантов постановки теста популярным оказался метод, основанный на применение уридина меченного тритием (Нз-уридина) -метаболита, производимого промышленностью и широко используемого в биологических исследованиях. Уридин активно поглощается КМ и включается ими в состав своей РНК, а тритий (Нз), излучающий бета-лучи, имеет период полураспада 12 лет и может использоваться дольше, чем препараты Cr-51 [15].
При воспроизведении этого теста, методологически не отличающегося от "хромового" теста, используются практически те же клеточные линии, питательные среды и основные реактивы, которые применяются и при постановке "хромового" теста. Именно поэтому оба эти теста объединили под названием "цитотоксических тестов" (ЦТ).
Приняв во внимание наличие детального описания методики ЦТ с использованием Нз-урилина в литературе, ниже мы ограничились лишь небольшими комментариями.
Как и при постановке "хромового" теста, на первом этапе готовят суспензии КМ и КЭ. Для "метки" КМ, используют Нз-урилин с удельной радиоактивностью порядка 5-10 мкКюри/моль. Перед использованием в суспензию КМ добавляют рибонуклеазу (для облегчения выхода уридина в жидкую фазу). Культивируя КЭ, в среду добавляют актиномицин D (для предотвращения реутилизации уридина эффекторными иммуноцитами).
Для регистрации факта повреждения КМ со-
ОБЗОРЫ И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ / REVIEWS AND PROBLEMATIC ARTICLES DOI: 10.24412/1815-3917-2022-1-14-23
держимое лунок наносят на пластинки фильтров "МПНроге" (с порами в 2,5 мкм), и фильтруют под "отрицательным" давлением (с помощью водоструйного насоса). Далее через фильтры пропускают изотонический раствор N0, а также растворы трихлоруксусной кислоты и абсолютного этанола. Высушенные фильтры помещают в пробирки со сцинциляционной жидкостью и тестируют с помощью лабораторного бета-счетчика. По чувствительности и воспроизводимости описанный ЦТ практически не отличается от "хромового" ЦТ. Поэтому их часто объединяют под рубрикой "ЦТ с радиометрической регистрацией результатов".
В свое время в наших исследованиях мы оценивали влияние вирусной инфекции на ЦА ЕКК: эти исследования были проведены с помощью ЦТ с использованием Нз-уридина и параллельно - с помощью "хромового" ЦТ. В итоге, в обоих ЦТ были получены практически идентичные результаты [16].
Вместе с тем, несмотря на отмеченные достоинства радиометрических ЦТ, их доступность для широкого круга исследователей ограничена рядом обстоятельств. Во-первых, при их постановке приходиться использовать радионуклиды, что сопряжено с риском радиационного поражения персонала и загрязнений окружающей среды. Во-вторых, они требуют использования специальной прецизионной лабораторно-радиометрической аппаратуры. В-третьих, при их постановке используются клетки лишь определенных линий (требующих специальных условий для поддержания), оборудования и достаточно многочисленного набора реагентов, что затрудняет использование таких ЦТ вне хорошо оснащенных научно-клинических учреждений. В-четвертых, они отличаются трудоемкостью, а на их постановку затрачивается не менее 2 суток.
Из этого следовало, что для расширения области применения в медицине нужны более доступные и точные ЦТ. Это побуждало разработку альтернативных подходов к оценке КЦТ, пригодных для применения в условиях клинической лаборатории.
В качестве таких альтернатив для оценки ЦТА КЭ были предложены, так называемые, колориме-тические методы, среди которых мы обратили внимание лишь 2 подхода. Первый из них был разработан Т.Моссманом в 1983 г и предполагал применение бесцветного тетразолиевого красителя МТТ, который в присутствии митохондриальных ферментов обретал пурпурный цвет. При этом этот краситель окрашивал только живые клетки и не менял цвет погибших клеток. Второй подход в
1984 г предложила Э.Боренфройнд: это тест с нейтральным красным, основанный на способности живых клеток поглощать этот краситель и "включать" его в свои лизосомы. По мере угасания жизнедеятельности эта способность снижается и погибшие клетки полностью утрачивают эту способность. Значительно позже на основе этих тестов были предложены методы оценки КЦТ, которые однако, по основным характеристикам уступали радиометрическим ЦТ и не нашли реального применения в иммунологических исследованиях
[17, 18].
Наиболее интересную альтернативу радиометрическим вариантам ЦТ мы нашли в сообщениях о возможности при постановке ЦТ использования в качестве КМ гетерологических эритроцитов животных (барана, курицы и др.). Очевидно, что такие эритроциты (ЭЦ), сами по себе, будут распознаны иммуноцитами как генетически чужеродные для человека и грызунов. Но будучи покрыты соответствующими АТ, они также могут служить КМ не только для ЦТЛ, но и для ЕКК (за счет присутсивя в составе АТ их Fc-фpагментов)
[19].
Это означало, что подвергшиеся "атаке" КЭ ЭЦ разрушатся, освобождая в культуральную среду содержащийся в них гемоглобин. Соответственно, измеряя его концентрацию в культураль-ной среде, можно оценивать и интенсивность КЦТ, которую проявили избранные КЭ [12].
Эти соображения побудили нас специально исследовать возможность постановки ЦТ, основанного на использовании в качестве КМ гетерологи-ческих ЭЦ (курицы) и адаптированного к условиям неспециализированной клинико-биохимичес-кой лаборатории.
Намереваясь на основе описанного выше процесса разработать такой ЦТ, результаты которого можно оценивать колориметрически по концентрации гемоглобина в культуральной среде, мы воспроизвели феномен КЦТ, используя в качестве КЭ ЕКК, выделенные из нескольких образцов крови человека, а в качестве КМ ЭЦ курицы. Результаты этого ЦТ были учтены биохимическим методом (путем определения концентрации гемоглобина с помощью колориметра). Параллельно, был воспроизведен и ЦТ, с использовании в качестве КЭ линии клеток К-562 и радиометрической регистрации выхода из них радионуклидной метки (Нз-уридин) [15]. По результатам параллельного исследования одних и тех же образцов крови с помощью обеих вариантов постановки ЦТ был рас-читан коэффициент линейной корреляции между данными, полученными при использовании биохи-
мического и радиометрического методов, который составил г =+0,92. При этом, воспроизводимость величин ИЦА, определенных с помощью биохимического учета результатов оказалась, примерно, на 20% ниже таковой в случае использования радиометрического учета результатов ЦТ [20].
С учетом последнего факта, мы заключили, что испытанный нами вариант постановки ЦТ, несмотря на относительно меньшую воспроизводимость результатов, позволяет получить результаты, вполне сопоставимые с таковыми, полученными при применении варианта ЦТ, основанного на использовании в качестве КМ клеток линии К562 и рациметрического учета результатов.
В то же время, несмотря на более низкую воспроизводимость результатов, указанный вариант ЦТ отличался большей простотой (за счет отказа от длительного поддерживания линии КМ) и большей доступностью (за счет отсутствия необходимости использования радиометрической аппаратуры).
В дальнейшем этом метод был использован нами при решении ряда научно-практических задач. Так, с его помощью мы оценили характер влияния ряда иммуностимлуирующих и иммуно-супрессирующих препаратов на функциональную активность ЕКК у человека и мышей [21]. Более того, с помощью этого ЦТ мы оценили состояние клеточного звена у значительной по численности группы здоровых жителей [22] и оценили характер влияния на функцию ЕКК невысоких доз ионизирующего излучения [23]. Все это позволило полагать, что указанный выше ЦТ может быть использован для определения функциональной активности ТЦЛ и ЕКК в типовой лаборатории, не имеющей специализированного оснащения.
Отметив достоинства такого ЦТ, ниже мы приводим краткое описание методики его постановки и особенности процедур подготовки реагентов.
Для подготовки суспензию КМ к 1 мл ге-паринизированной крови курицы добавляли 3 мл 0,15 М раствора хлорида натрия и центрифугированием отделяли массу ЭЦ, которую затем ресуспен-дировали в среде Игла и трижды промывали в этой среде путем повторения цикла "центрифугирова-ние-ресуспендирование". Уже "отмытые" ЭЦ вновь ресуспендировали в среде Игла, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и хранили при 4°С в течение 2-3 суток. Непосредственно перед использованием суспензию осторожно встряхивали и подсчитывали концентрацию ЭЦ в камере Горяева и готовили ее разведение, содержащее порядка 200 тысяч клеток в 1 мл.
Материалом, содержащим КЭ, служила суспензия лимфоцитов, получаемая с помощью традиционной методики путем центрифугирования исследуемых образцов периферической крови в фиколл-верографиновом градиенте плотности. Клетки из суспензии осаждали центрифугированием и ресуспендировали в среде ЯРМ1-1640 с глута-мином, содержащей фетальную телячью сыворотку, 10 ммоль/л буфера "HEPES" и 20 мг/мл нетромицина.
Если стояла задача по определению спонтанной ЦА пула всех присутствующих в суспензии КЭ лимфоидного ряда (ЕКК и макрофагов), то приготовленную суспензию непосредственно использовали в ЦТ. В этом случае в камере Горяева подсчитывали концентрацию клеток в суспензии и ех tempoгe готовили ее разведение (в той же среде для культивирования), содержащее в 1 мл 1 млн клеток, с тем, чтобы при постановке ЦТ обеспечить в тест-системе соотношение КМ и КЭ, равное 1:25.
Если же необходимо было оценить ЦА только ЕКК, то приготовленную суспензию час инкубировали в стерильной чашке Петри при 37°С (для отделения прилипающих к стеклу макрофагов) и подсчитывали концентрацию КЭ в суспензии. В этом случае из суспензии готовили разведение с концентрацией 1 млн/мл, обеспечивающее при постановке ЦТ соотношение КМ и КЭ, равное 1:50.
Приведение в контакт КМ и КЭ осуществляли в пластиковых микропробирках приблизительно в объеме 2 мл: к 1,8 мл суспензии КЭ добавляли 0,2 мл суспензии КМ (соотношение 50:1) или к 1,6 мл суспензии КЭ добавляли 0,3 мл суспензии КМ (соотношение 25:1).
Контролями служили пробирки с исходной суспензией КМ и ее разведением (1:10), пробирка с суспензией КЭ, а также пробирка со средой для культивирования. Штатив с пробирками помещали в герметичный контейнер с повышенным содержанием в воздухе углекислого газа (вместе с зажженной свечой) и инкубировали 18 час при 37°С.
Далее смесь центрифугировали при скорости 3000 об/мин в течение 5 мин, переносили суперна-тант в отдельные пробирки. В содержимом всех пробирок с помощью унифицированного метода определяли концентрацию гемоглобина (используя трансформирующий раствор и фотометрируя пробы при длине волны 540 нм).
Постановку ЦТ считали корректной, если разница между экстинкциями растворов контрольных образцов была менее, чем на 10% выше таковой в пробирке со средой для культивирования. В случае
ОБЗОРЫ И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ / REVIEWS AND PROBLEMATIC ARTICLES DOI: 10.24412/1815-3917-2022-1-14-23
соблюдения этого условия осуществляли расчет величины ИЦА.
Использовали формулу: ИЦА = (М-С)/М х 100%, где М - экстинкция пробы из пробирки со смесью КМ и КЭ, а С - экстинкция пробы из пробирки с разведением суспензией КМ в куль-туральной среде [24].
Завершая рассмотрение методических подходов к оценке КЦТ иммуноцитов, нельзя не отметить и то, что за последние годы был предложен ряд методов, основанных на биохимическом учете результатов определения ЦА иммуноцитов. Но, эти методы были "косвенными" и основывались на определении в системе веществ, появляющихся в процессе реализации киллерного эффекта, например, перфорина (как медиатора дезинтеграции цитомембран КМ) или каспаз, "запускающих" апоптоз в КМ. Однако, методы определения этих веществ не позволяют определить фенотип клеток, секретирующей перфорин, поскольку его источником могут быть и посторонние клетки.
Наконец, в связи с появлением новой высокопрецизионной аппаратуры, резко расширившей возможности иммунологических исследований, было предложено за счет применения такой аппаратуры модернизировать и колориметрческий метод опредения ЦТА иммуноцитов. В частности, оказалось, что КЦТ поддается количественной оценке с помощью проточного лазерного цитофлу-ориметра в случае, если для "мечения" КМ используются два красителя.
Сначала "метят" КМ зеленым флуорохромом, который проникает в клетки, прочно (ковалентно) связывается с внутриклеточными белками и не влияет на жизнеспособность КМ. Затем к суспензии КМ добавляют суспензию КЭ и инкубируют их совместно, чтобы дать возможность реализоваться киллерному эффекту, и добавляют к смеси второй реагент (пропидий иодид), который превращается в красный флуорохром под действием их ферментов-эстераз только в живых клетках. После завершения совместной инкубации КМ и КЭ смесь пропускают через облучаемый лазером капилляр -при этом живые КЭ будут светиться зеленым цветом, а погибшие КМ - красным цветом, а оставшиеся КМ - двумя цветами. По соотношению таких клеток можно определить и ЦА исследованной суспензии КЭ.
Более того, предлагаются и иные наукоемкие подходы к решению задачи по оценке ЦТА имму-ноцитов, основанные на применении современной цитометрической аппаратуры и специальных 1Т-
программ. Так, к примеру, предложено определять ИЦА ЕКК с помощью многофункционального счетчика-анализатора клеток Multisizer MS-4 (Beckman Coulter, США), который позволяет не только подсчитывать количество проходязих через капилляр клеток, но определять их размер и, даже их распределение по размерам.
Принцип такого определения основан на том, что при "прохождении" суспендированных в электролите клеток через апертуру с малым диаметром, расположенную между двумя электродами, каждая клетка вытесняет определенный объем электролита и, тем самым, увеличивает электрическое сопротивление (и уменьшает ток) на определенную величину. Включив в программу прибора средние размеры КМ и КЭ, а также особенности изменений размеров погибших КМ, можно с помощью этой программы определить соотношение живых и погибших КМ и, таким образом, автоматически вычислить величину ИЦА.
И хотя этот метод пока не нашел широкого применения в практике, преимуществом данного подхода является возможность отказа от использования радионуклидов, сцинтилляционных жидкостей и радиометрической аппратуры, а также существенное сокращение затрат времени (несколько минут вместо 36-48 часов). Очевидно, что подобные технологии могут оказаться весьма ценными при необходимости оперативной и точной оценки состояния эффекторных иммуноцитов.
Говоря о возможном диагностическом значении ЦТ, следует отметить, что традиционно получаемая в процессе определенния иммунного статуса иммунограмма, содержит сведения лишь о содержании в крови ЦТЛ и/или ЕКК и не позволяет объективно оценивать функциональную активность этих иммуноцитов [25]. Между тем, способность инициировать КЦТ является одной из важных функциональных характеристик этих клеток.
Именно поэтому определив интенсивность цитотоксического деструктивного воздействия этих иммуноцитов, можно составить объективное суждение о функциональном состоянии ВИМ и, даже ПИМ, а в итоге, и всей иммунной системы, в целом. Это и составляет важнейший момент, демонстрирующий диагностическую ценность доступных и достаточно точных методических подходов к количественной оценке КЦТ иммуноцитов у пациентов или лабораторных животных, с помощью которых решаются не только фундаментальные, но и важные прикладные научные задачи.
_БИОМЕДИЦИНА | т.20«№1«2022 / BIOMEDICINE |voL20«NM«2022
DOI: 10.24412/1815-3917-2022-1-14-23 ОБЗОРЫ И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ / REVIEWS AND PROBLEMATIC ARTICLES
Литература
1. Кадырова А.А. Иммунная система: два механизма и одна цель. Биомедицина (Баку). 2003;3:12-16. Режим доступа: https://biomedicine.az/download/biomedicine_3_2003.pdf
2. Мамедов М.К., Дадашева А.Э. Структурный гомеостаз и его уровни и механизмы. Здоровье (Баку). 2001;6:6-
10.
3. Мамедов М.К., Кадырова А.А. Патогенетическое значение и особенности обеспечения гомеостаза и реактивности в защите организма от инфекционных и онкологических заболеваний. Современные достижения азербайджанской медицины. 2022;1:5-16. Режим доступа: https://maamjournal.az/download/dost_n1_2022.pdf
4. Vainio T., Koskimes O., Perlmann P. et al. In vitro cytotoxic effect of lymphoid cell from mice immunized with allogenic tissue. Nature. 1964 Oct 31;204:453-5. doi: 10.1038/204453a0.
5. Gorer P., O'Gorman P. The cytotoxic activity of isoantibodies in mice. Transp. Bull., 1956, v.3, p.142-143.
6. Terasaki P., McClelland J. Microdroplet Assay of Human Serum Cytotoxins. Nature 204, 998-1000 (1964). https://doi.org/10.1038/204998b0
7. Энгерс Г. Д., Макдональд Х.Р. Возникновение, выявление и характеристика цитотоксической активности Т-лимфоицтов in vitro. Лимфоциты: выделение, фракционирование и характеристика. Под ред. Б.Натвга, П.Перлман-на, Х.Вигзеля. М.: Мир. 1980;201-214.
8. Шульце Х.А. Цитотоксические лимфоциты. Иммунологические методы. Под ред. Х.Фримеля. М.: Медицина. 1987;282-294.
9. Семененко Т.А., Мамедов Г.М. Система естественных киллерных клеток как звено неспецифической имму-нологически обусловленной резистентности. Биомедицина (Баку). 2006;4:40-43. Режим доступа: https://biomedi-cine.az/download/biomedicine_4_2006.pdf
10. Мамедов М.К., Кадырова А.А. Открытие естественных киллерных клеток, как важная веха осмысления механизмов обеспечения врожденного иммунитета. Биомедицина (Баку). 2016;1:54-56. Режим доступа: https://biomed-icine.az/download/biomedicine_1_2016.pdf
11. Мамедов М.К. Врожденный иммунитет: современная концепция. Биомедицина (Баку). 2010;2:3-9. Режим доступа: https://biomedicine.az/download/biomedicine_2_2010.pdf
12. Пастер Е.У, Овод В.В., Позур В.К., Вихоть Н.К. Иммунология. Практикум. Киев: Вища школа. 1989;380 c.
13. Brunner KT, Mauel J, Cerottini JC, Chapuis B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 1968 Feb; 14(2): 181-96. PMID: 4966657.
14. Riccardi C, Puccetti P, Santoni A, Herberman RB. Rapid in vivo assay of mouse natural killer cell activity. J Natl Cancer Inst. 1979 Oct;63(4):1041-5. PMID: 480377.
15. Рыкова М.П., Спиранде И.В., Зедгенидзе М.С. и др. Новая высокочувствительная техника тестирования нормальных киллеров. Иммунология. 1981;3:88-90.
16. Мамедов М.К., Семенов Б.Ф., Ожерелков С.В. и др. Влияние персистентной вирусной инфекции на естественную противоопухолевую резистентность. Вопросы вирусологии. 1991;2:125-127.
17. Хромых Л.М., Анфалова Т.В., Казанский Д.Б. Колориметрический метод определения Т-клеточной цитоток-сичности in vitro. Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 2003;9:356-360.
18. Шпакова А.П., Павлова К.С., Булычева Т.И МТТ-колориметрический метод определения цитотоксической активности естественных киллерных клеток. Клин. лаб. диагн. 2000;2:20-23.
19. Northoff Н, Resch K. Cytotoxicity of human mononuclear cells against chicken and human red blood cells, induced by treatment of the effector cells with phospholipase C. Eur J Immunol. 1979 Oct;9(10):757-61. doi: 10.1002/eji. 1830091004.
20. Семененко Т.А., Михайлов М.И., Мамедов М.К. и др. Биохимическая регистрация результатов оценки ци-тотоксической оценки активности естественных киллерных клеток. Мат-лы научной конференции, посвященная 150-летию со дня рождения И.П.Павлова. Баку. 1999;463-465.
21. Кадырова А.А., Гамидова Н.А., Мамедов М.К. и др. Нерадиометрическая модификация метода оценки цитотоксической активности иммуноцитов. Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии. Баку. 2002;175-178.
22. Кадырова А.А., Кабулов Г.Г., Мамедов М.К. и др. Показатели неспецифической иммунологически обусловленной резистентности у здоровых жителей г.Баку. Экоэнергетика (Баку). 2004;1:24-27.
23. Мамедов Г.М., Гамидова Н.А. Изменение определяемых in vivo показателей неспецифической иммунологически обусловленной резистентности у мышей после воздействия на них низких доз ионизирующего излучения. Биомедицина (Баку). 2009;3:12-14. Режим доступа: https://biomedicine.az/download/biomedicine_3_2009.pdf
24. Мамедов М.К., Гудратов Н.О., Кадырова А.А. и др. Биохимический метод количественной оценки цитоток-сической активности эффекторных иммуноцитов естественной резистентности в клинических и экспериментальных исследованиях. Азерб. Ж. метаболизма. 2004;1:51-54.
25. Хаитов Р.М., Пинягин Б.В. Оценка иммунного статуса человека в норме и при патологии. Иммунология. 2001;4:4-6.
БИОМЕДИЦИНА | т.20«№1«2022 / BIOMEDICINE | VOl.20«№1«2022_
ОБЗОРЫ И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ / REVIEWS AND PROBLEMATIC ARTICLES DOI: 10.24412/1815-3917-2022-1-14-23
References
1. Kadyrova А.А. Immune system: two mechanisms and one aim. Biomedicine (Baku). 2003;3:12-16. (In Russian). Available at: https://biomedicine.az/download/biomedicine_3_2003.pdf
2. Mammadov M.K., Dadasheva A.E. Structural homeostasis and its levels and mechanisms. Zdorovye (Baku). 2001;6:6-10. (In Russian).
3. Mamedov M.K., Kadyrova A.A. Pathogenetical significance and peculiarity of providing of homeostasis and reactivity in organism defense against infectious and oncological diseases. Modern Achiev. Azerb. Med. 2022;1:5-16. (In Russian). Available at: https://maamjournal.az/download/dost_n1_2022.pdf
4. Vainio T., Koskimes O., Perlmann P. et al. In vitro cytotoxic effect of lymphoid cell from mice immunized with allogenic tissue. Nature. 1964 Oct 31;204:453-5. doi: 10.1038/204453a0.
5. Gorer P., O'Gorman P. The cytotoxic activity of isoantibodies in mice. Transp. Bull., 1956, v.3, p. 142-143.
6. Terasaki P., McClelland J. Microdroplet Assay of Human Serum Cytotoxins. Nature 204, 998-1000 (1964). https://doi.org/10.1038/204998b0
7. Engers G.D., Makdonald K.R. [Vozniknovenie, vyjavlenie i kharakteristika citotoksicheskoj aktivnosti T-limfocitov in vitro. Limfocity: vydelenie, frakcionirovanie i khapakteristika]. Eds. B.Hatvg, P.Perelmann, H.Vigzel. M.: Mir. 1980;201-214. (In Russian).
8. Shulce K.A. [Citotoksicheskie limfocity. Immunologicheskie metody]. Eds. K.Frimel. M.: Medicina. 1987;282-294. (In Russian).
9. Semenenko T. A., Mamedov G.M. [Sistema estestvennykh killernyh kletok kak zveno nespecificheskoj immunologiches-ki obuslovlennoj pezistentnosti]. Biomedicine (Baku). 2006;4:40-43. (In Russian). Available at: https://biomedicine.az/down-load/biomedicine_4_2006.pdf
10. Mamedov M.K., Kadyrova A.A. The discovery of natural killer cells as an important milestone understanding of innate immunity mechanism. Biomedicine (Baku). 2016;1:54-56. (In Russian). Available at: https://biomedicine.az/download/bio-medicine_ 1_2016.pdf
11. Mamedov M.K. Innate immunity: modern conception. Biomedicine (Baku). 2010;2:3-9. (In Russian). Available at: https://biomedicine.az/download/biomedicine_2_2010.pdf
12. Paster E.U., Ovod VV, Pozur VK., Vikhot H.K. [Immunologiya]. Praktikum. Kiev: Visha shkola. 1989;380 p.
13. Brunner KT, Mauel J, Cerottini JC, Chapuis B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 1968 Feb;14(2):181-96. PMID: 4966657.
14. Riccardi C, Puccetti P, Santoni A, Herberman RB. Rapid in vivo assay of mouse natural killer cell activity. J Natl Cancer Inst. 1979 Oct;63(4):1041-5. PMID: 480377.
15. Rykova M.P., Spirande I.V., Zedgenidze M.S. et al. [Novaya vysokochuvstvitelnaya tekhnika testirovaniya normalnykh killerov]. Immunologiya. 1981;3:88-90. (In Russian).
16. Mamedov M.K., Semenov B.F., Ozhepelkov S.V. et al. [Vliyanie persistentnoj virusnoj infekcii na estestvennuju pro-tivoopukholevuyu rezistentnost]. Voprosy virusologii. 1991;2:125-127. (In Russian).
17. Khromykh L.M., Anfalova T.V, Kazanskij D.B. [Kolorimetricheskij metod opredelenija T-kletochnoj citotoksichnosti in vitro]. Bull. eksperim. biologii i mediciny. 2003;9:356-360. (In Russian).
18. Shpakova A.P., Pavlova K.S., Bulycheva T.I. [MTT-kolorimetricheskij metod opredeleniya citotoksicheskoj aktivnosti estestvennykh killernykh kletok]. Klin. lab. diagn. 2000;2:20-23. (In Russian).
19. Northoff H, Resch K. Cytotoxicity of human mononuclear cells against chicken and human red blood cells, induced by treatment of the effector cells with phospholipase C. Eur J Immunol. 1979 Oct;9(10):757-61. doi: 10.1002/eji.1830091004.
20. Semenenko T.A., Mikhaylov M.I., Mamedov M.K. et al. [Biokhimicheskaja registracija rezultatov ocenki citotoksicheskoj ocenki aktivnosti estestvennykh killernyh kletok]. Mat-ly nauchnoj konferencii, posvjashhennaja 150-letiju so dnja rozhdenija I.P.Pavlova. Baku. 1999;463-465. (In Russian).
21. Kadyrova A.A., Gamidova H.A., Mamedov M.K. et al. [Neradiometricheskaja modifikacija metoda ocenki citotoksicheskoj aktivnosti immunocitov]. Aktualnye problemy gematologii i transfuziologii. Baku. 2002;175-178. (In Russian).
22. Kadyrova A.A., Kabulov G.G., Mamedov M.K. et al. Pokazateli nespecificheskoj immunologicheski obuslovlennoj rezistentnosti u zdorovykh zhitelej g.Baku. Ekoenergetika (Baku). 2004;1:24-27. (In Russian).
23. Mamedov G.M., Gamidova N.A. Changes in vivo quantitated parameters of nonspecific immunologically-mediated resistance at mice irradiated with low doses of ionizing radiation. Biomedicine (Baku). 2009;3:12-14. (In Russian). Available at: https://biomedicine.az/download/biomedicine_3_2009.pdf
24. Mamedov M.K., Gudratov N.O., Kadyrova A.A. et al. [Biohimicheskij metod kolichestvennoj ocenki citotoksicheskoj aktivnosti effektornykh immunocitov estestvennoj rezistentnosti v klinicheskih i eksperimentalnykh issledovanijakh]. Azerb. Zh. Metabolizma. 2004;1:51-54. (In Russian).
25. Khaitov R.M., Pinyagin B.V. [Ocenka immunnogo statusa cheloveka v norme i pri patologii]. Immunologija. 2001;4:4-6. (In Russian).
Информация о соавторах: А.А.Кадырова
Профессор, доктор медицинских наук, зав. кафедрой микробиологии и иммунологии, Азербайджанский Медицинский Университет, г. Баку, Азербайджан Н.О.Гудратов
Доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент
МЭА, г. Баку, Азербайджан
Г.М.Мамедов
Доктор философии по медицине, ассистент кафедры лучевой диагностики, Азербайджанский Институт усовершенствования врачей им. А.Алиева, г. Баку, Азербайджан.
Information about co-authors: Kadyrova A.A.
Professor, Doctor of Medical Sciences, Head of Microbilogy and Immunology Chair, Azerbaijan Medical University, Baku, Azerbaijan Gudratov N.O.
Doctor of Sciences in Biology, Professor, Corr. Member of IEA, Baku, Azerbaijan Mamedov G.M.
PhD, Assistant of X-ray diagnostics Chair, A.Aliyev's State Institute of Physician's Improvement, Baku, Azerbaijan.
