CC BY
6
потенциал, аналогичный КМ-МСК. Способность к диф-ференцировке ИМ-МСК отличалась от КМ-МСК. Клоны ИМ-МСК не реагировали на индукторы адипогенной дифференцировки, 67% из них дифференцировались в сторону остеогенной линии. Остальные клоны не дифференцировались. Часть клонов ИМ-МСК содержала ЭРР. ИМ-МСК экспрессировали гены С-МУС и ЫЕБ значительно выше, чем КМ-МСК, в то время как экспрессия 0СТ4 была ниже. По-видимому, в состав ИМ-МСк входит субпопуляция, обладающая некоторыми свойствами эмбриональных стволовых клеток. Таким образом, КМ-МСК обнаруживали функциональную гетерогенность после имплантации под капсулу почки. Повторный перенос мезенхимных стромальных клеток-предшественников, вероятно, активировал дремлющую субпопуляцию стволовых клеток. Можно заключить, что популяция КМ-МСК состоит из мезенхимных клеток-предшественниц различной степени дифференцировки, в том числе и из стволовых клеток. Эти недавно открытые свойства КМ-МСК мини пигов требуют дальнейшего изучения, поскольку они открывают новые возможности и ограничения манипуляций с ними.
МАТРИКСЫ ИЗ ФИБРОИНА, СШИТОГО
ДЖЕНИПИНОМ, ДЛЯ ТКАНЕВОЙ
ИНЖЕНЕРИИ: ПОЛУЧЕНИЕ, ИЗУЧЕНИЕ
И ОЦЕНКА IN VITRO
М.Г. Дроздова1, В.Н. Бирюкова1, Н.А. Сажнев2,
Н.Р. Кильдеева2, Е.А. Марквичева1
1 ГНЦ ФГБУН Институт биоорганической химии им. Шемякина-Овчинникова РАН, Москва, Россия
2 ФГБОУН ВО Российский государственный университет им. А.Н. Косыгина, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: тканевая инженерия, фиброин, дженипин,
фибробласты L929, мезенхимальные стволовые клетки.
Фиброин (Фб) — перспективный материал для тканевой инженерии (ТИ), благодаря хорошим механическим свойствам, биосовместимости и биоразлагаемости. Однако матриксы из регенерированного Фб водорастворимы. Использование химической сшивки для предотвращения растворимости Фб может оказаться неэффективным из-за низкого содержания первичных аминогрупп в его структуре. Поскольку растворимость Фб зависит от конформационного состояния: водорастворимые а-спирали и нерастворимые ß-складчатые структуры, создание условий для конформационного перехода а ^ ß при образовании гидрогеля из Фб позволяет влиять на его растворимость.
Целью исследования было получение матриксов на основе Фб, сшитого дженипином (Дж), и изучение их структуры, физико-химических свойств, а также оценка биосовместимости in vitro.
Для получения пористых матриксов растворы Фб (20 и 30 масс. %) замораживали при -10°С и лио-филизовали. Полученные матриксы сшивали инкубацией в растворе Дж (10 масс. %) в этаноле в течение 24 часов. С помощью конфокальной лазерной микроскопии (КЛМ) было показано, что матриксы образуют систему с открытыми порами средним размером 149 ± 7 мкм и 355 ± 14 мкм для матриксов Фб-20 (20 масс.%) и Фб-30 (30 масс.%) соответственно. Отсутствие растворимости обеспечивалось как переводом Фб в ß-конформацию, так и химической сшивкой Дж в спиртовой среде.
Цитотоксичность Фб матриксов изучали с помощью экстракт теста с использованием мышиных фибробластов 1_929 в качестве модельных клеток. Жизнеспособность клеток определяли методом МТТ. После инкубации клеток в неразбавленных экстрактах происходило некоторое снижение их жизнеспособности, однако изменений в морфологии не наблюдали. После разбавления экстрактов жизнеспособность клеток повышалась. Распределение и морфологию клеток _929 и имморта-лизованных мезенхимальных стволовых клеток человека (ИТЕРТ-МБС) оценивали с помощью КЛМ через 7 дней культивирования в матриксах. Для этого клетки окрашивали витальным красителем Кальцеин АМ. Клетки сохраняли жизнеспособность, имели характерную веретенообразную морфологию и образовывали плотный клеточный монослой на матриксах Фб. Таким образом, макропористые матриксы Фб являются перспективными для ТИ. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 22-13-00261).
КЛЕТОЧНАЯ МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА, АССОЦИИРОВАННОЙ С МУТАЦИЕЙ В ГЕНЕ GBA
Е.С. Дроздова1, 2, Е.В. Григорьева2,
С.В. Павлова2, С.П. Медведев2, Д.А. Сорогина1, 2,
А.Е. Копытова3, Г.В. Байдакова4,
Е.Ю. Захарова4, С.Н. Пчелина3, С.М. Закаян2
1 Новосибирский государственный университет, Новосибирск, Россия
2 ФГБНУ ФИЦ Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия
3 ФГБУ Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра Курчатовский институт, Гатчина, Россия
4 ФГБНУ Медико-генетический научный центр, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: инуцированные плюрипотентные стволовые клетки, болезнь Паркинсона, дофаминергические нейроны, глюкоцереброзидаза, мутация p.N370S, амброксол.
Вторым по распространенности нейродегенератив-ным заболеванием является болезнь Паркинсона (БП) — хроническая патология, поражающая дофаминергические (ДА) нейроны черной субстанции. Одна из причин развития БП — мутации в гене GBA, которые приводят к снижению уровня мРНК GBA и белка глюкоцеребро-зидазы (GCase). Снижение активности GCase приводит к накоплению липидного продукта метаболизма, способствующего формированию нейротоксичных агрегатов белка а-синуклеина.
Для изучения механизмов мультифакторных заболеваний и поиска способов их лечения необходимо создавать адекватные модели, что является достаточно нетривиальной задачей, особенно в случае нейро-дегенеративных патологий: работа с образцами клеток мозга пациентов лимитирована постмортальными материалами, а использование животных моделей для тестирования новых лекарственных препаратов ограничивается из-за различий в метаболизме ксенобиотиков. Решением данных проблем стали индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), способные
неограниченное время жить в культуре и дифференцироваться в релевантные типы клеток.
Технологией репрограммирования мононуклеарных клеток двух пациентов с GBA-ассоциированной формой БП (мутация p.N370S) и двух потенциально здоровых доноров получены линии ИПСК, проведена их характеристика (кариотипирование, иммунофлуоресцентный анализ и кПЦР на экспрессию маркеров плюрипотентно-сти, тест на спонтанную дифференцировку) [1]. Путем направленной дифференцировки ИПСК получены культуры дофаминергических нейронов, экспрессирующих специфичные маркеры (TH, LMX1A).
Проведено тестирование полученной культуры: оценен уровень экспрессии гена GBA и удельной активности ЭСазе.Относительно здорового контроля оба показателя снижены, что соответствует литературным данным [2].
В полученных нейронах наблюдается повышение активности фермента GCase в ответ на действие амброк-сола, который, согласно литературе, специфически связывается с белком и стабилизирует его конформацию. Амброксол — известное муколитическое средство — сейчас находится на стадии клинических испытаний в качестве лекарственного препарата для БП [3]. Наблюдаемый ответ культуры на действие препарата говорит об адекватности полученной модели.
Таким образом, в ходе работы получена перспективная клеточная модель, которая воспроизводит молекулярный фенотип мутации, вызывающей развитие БП, а также показано, что культура пригодна для поиска способов фармакотерапии данной патологии. Работа поддержана грантом РНФ № 19-75-20063.
Литература:
1. Grigor'eva E. V., Drozdova E.S., Sorogina D.A. et al. Stem Cell Research. 2022. V. 59. P. 102651.
2. Sanchez-Martinez A., Beavan M., Gegg M.E. et al. Scientific Reports. 2016. V. 6. P. 31380.
3. Mullin S., Smith L., Lee K. et al. JAMA Neurology. 2020. V. 77. P. 427-434.
ПОЛУЧЕНИЕ МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ БИОИСКУССТВЕННЫХ КОНСТРУКЦИЙ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ
А.Д. Дубко, А.В. Свирская, М.Ю. Юркевич, Д.Б. Нижегородова, М.М. Зафранская
УО Международный государственный экологический институт им. АД. Сахарова Белорусского государственного университета, Минск, Республика Беларусь
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: скаффолд, рецеллюляризация, ко-культура, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, тканеинженерная конструкция.
Разработка функционально состоятельных тканеинже-нерных конструкций печени (ТИК) обладает высоким практическим потенциалом и является перспективной научной платформой для исследований фармакологического, биоинформационного, клинического профилей, расширяет возможности для изучения межклеточного взаимодействия в ткани печени, оценки механизмов деактивации ксенобиотиков и действие их на метаболические пути.
Для сборки ТИК использованы изолированные доли скаффолда печени крысы (n=4) объёмом от 0,66 до 4,38 см3, полученные путем перфузионной
децеллюляризации [1]. Рецеллюляризацию образцов скаффолда проводили инъекционным способом в два этапа: сначала формировали подложку из мультипотент-ных мезенхимальных стромальных клеток (2,5х105 кл/ см3), затем через 24 часа вводили ко-культуру гепато-цитов и перитонеальных макрофагов (соотношение 3:1) в концентрации 3,25х106 кл/см3. Клеточные потери после рецеллюляризации вследствие выхода через капсулу скаффолда составили 18,3 ± 0,9%. Собранные ТИК культивировали течение 9 суток при 37°С и 5% СО2. Для поддержания собранных тИк в жизнеспособном состоянии разработана перфузионная система, обеспечивающая равномерное распределения питательной среды.
Оценку функциональной состоятельности ТИК проводили по синтезу альбумина и мочевины на 1, 3, 6, 9 сутки. На 1 сутки культивирования ТИК обладали максимальной синтезирующей активностью: продукция альбумина составила 24,6 ± 0,14 мг/млн кл/сут, что в 15,4 раза больше, чем в монослойной ко-культуре (1,6 ± 0,3 мг/млн кл/сут), мочевины — 8,65 ± 0,11 мкг/млн кл/сут. Однако, во всех образцах в период с 1 по 9 сутки культивирования наблюдалось стойкое снижение синтезирующей активности. Так, на 9 сутки продукция альбумина составила 4,6 мг/млн кл/сут, мочевины — 1,38 ± 0,21 мкг/млн кл/сут.
Таким образом, собранные ТИК обладали способностью продуцировать альбумин и мочевину на протяжении 9 суток с тенденцией постепенного снижения синтетической активности. Дальнейшая работа сконцентрирована по трем направлениям: разработка цельноорганных функционально состоятельных конструкций, обладающих высоким самоподдерживающим и регенеративным потенциалом; изучение и модификация метаболического потенциала ТИК; модернизация перфузионной системы обеспечения и длительной поддержки ТИК с целью создания условий культивирования максимально приближенных к физиологическим. Работа выполнена при финансовой поддержке Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований, грант № М19АРМ-016 от 02.05.2019.
Литература:
1. Дубко А.Д., Юркевич М.Ю., Лобай М.В. и др. Докл. НАН РБ,
2021. Т.65. № 4. С. 461-468.
НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ФОРМИРОВАНИЮ НАНОСТРУКТУРИРОВАННОЙ ПОВЕРХНОСТИ ТИТАНОВЫХ ИМПЛАНТАТОВ
А.Б. Дымников1, Е.А. Гостева2
1 Российский университет дружбы народов, Москва, Россия
2 Кафедра материаловедения полупроводников
и диэлектриков, Национальный исследовательский технологический университет МИСиС, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: дентальные имплантаты, остеоинтегра-ция, поверхность дентального имплантата, технологии обработки поверхности, стволовые клетки.
Основным материалом для изготовления дентальных имплантатов исторически является титан [3]. Всем известные качества титана, такие как биоинертность и высокая биосовместимость, коррозионная стойкость, низкая теплопроводность, немагнитность обусловливают его выбор в качестве материала для изготовления дентальных имплантатов.
