CC BY
19
2B8
МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ
Количество сцвДНК по каждой хромосоме выражалась через статистический показатель «Z-score», отражающий риск анеуплоидии: чем больше его отклонение от нулевого значения, тем более выражена вероятность анеуплоидии. Референсный интервал значения Z-score для аутосом составляет от — 6,0 до 2,8.
Нами выявлены два случая, которые могут быть охарактеризованы как ограниченный плацентарный моза-ицизм. В обоих случаях при геномном анализе сцвДНК пациенток по результатам проведения НИПТ были получены значения показателя Z-score по 18-й хромосоме, которые значительно превосходили референсные (15,31 и 27,61 соответственно), что свидетельствовало о высоком риске трисомии по 18-й хромосоме.
Следует учитывать, что исследуемая в рамках НИПТ сцвДНК поступает в кровоток матери не столько от тканей самого плода, сколько из тканей плаценты. По этой причине результат анализа сцвДНК, полученный в рамках НИПТ требует обязательного подтверждения соче-танным анализом тканей плаценты и плода, полученных в результате инвазивного вмешательства. При проведении дополнительного инвазивного исследования амнио-тической жидкости, пуповинной крови и ворсин хориона в обоих случаях была подтверждена анеуплоидия (три-сомия по 1 8-й хромосоме) клеток ворсин хориона при отсутствии признаков анеуплоидии в пуповинной крови, полученной при кордоцентезе. При проведении УЗИ на сроках 13 и 20 недель врождённые пороки развития плода не были обнаружены у обеих пациенток.
Полученные результаты были расценены как проявление ограниченного плацентарного мозаицизма, который характеризуется наличием клеток с аномальным хромосомным набором в плаценте при нормальном кариотипе плода [2-4]. Частота выявления такого состояния невелика [5]. Однако трисомия клеток плаценты является риском потери беременности, поэтому ведение таких пациенток должно осуществляться по специальному протоколу, направленному на сохранение беременности. В обоих случаях женщин вели как беременных с трисомией по 18-й хромосоме в плаценте. В результате в обоих описанных нами случаях родились в срок здоровые дети без клинических и лабораторных признаков анеуплоидий.
Возможно, предоставленная информация будет важна для специалистов, работающих в области геномных и клеточных технологий, а также для разработчиков аналитических систем геномного секвенирования. Динамический анализ внеклеточной ДНК в культураль-ных жидкостях in vitro может использоваться как инструмент в работе с клеточными линиями и при выращивании органоидов (не только плаценты).
Исследование выполнено при финансовой поддержке Кубанского научного фонда и ООО «СЛ МедикалГруп» в рамках научного проекта МФИ-П-20.1/10, а также при финансовой поддержке РФФИ и Краснодарского края в рамках научного проекта № 19-44-230040-р_а.
Литература:
1. Turco M.Y., Gardner L., Kay R.G. et al. Nature (2018). V. 564. P. 263-267.
2. Yang J., Qi Y., Guo F. et al. Mol. Cytogenet. (2017). V. 10. P. 1-4.
3. Барков И.Ю. Совершенствование системы пренатального скрининга анеуплоидий плода внеклеточной крови ДНК материна основе анализа. Диссертация на соискание степени к.м.н. Москва, 2018. 151 с.
4. Li X. et al. Medicine (2020). V. 99(29).
5. Hayata K. et al. Acta Medica Okayama (2017). V. 71. P. 181-185.
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОТЕРАПИЯ СОЛИДНЫХ
ОПУХОЛЕЙ
Г.М. Юсубалиева1, 2, C.B. Кулемзин3,
A.A. Калинкин1, П.А. Мельников1, 4,
М.В. Ширманова5, В.В. Белоусов6,
B.П. Баклаушев1, 2 7
1 ФНКЦ (ФНКЦ) ФМБА России, Москва, Россия
2 Институт молекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта, Москва, Россия
3 Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, Москва, Россия
4 НМИЦ психиатрии и наркологии им. В.П. Сербского Минздрава РФ, Москва, Россия
5 Приволжский национальный исследовательский медицинский университет, Н. Новгород, Россия
6 Федеральный центр мозга и нейротехнологий ФМБА России, Москва, Россия
7 НИИ пульмонологии ФМБА России, Москва, Россия
e-mail: gaukhar@gaukhar.org
Ключевые слова: адоптивная иммунотерапия, солидные
опухоли, опухоль инфильтрирующие лимфоциты, TILs, PD-1.
В экспериментах in vitro на опухолевых сфероидах и in vivo — на модели ортотопической глиобластомы оценивали противоопухолевую эффективность опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (TIL), NK-клеток из пупо-винной крови и модифицированных/таргетированных NK клеток линии YT (VAV1+, CISH-/-, B2M-/-, EGFRvIII-CAR, IL13-Her2-CAR). TILs получали из интраопераци-онного опухолевого материала пациентов, получавших хирургическое лечение мультиформной глиобластомы в ФНКЦ ФМБА России. Для визуализации клеток в экспериментах in vitro и in vivo применяли бицистронные лентивирусные векторы для одновременной экспрессии флюоресцентного белка mKate2 и люциферазы Luc2. В выделенных TILs с помощью проточной цито-метрии определяли субпопуляционый состав: доли ци-тотоксических CD8+ Т-клеток (CTL), CD4+ Т-хелперов, CD4+CD25+, FoхP3+ Т регуляторных клеток, CD56+ NK, CD56+CD3+ NKT, CD19+ В-клеток до и после активации. Взаимодействие иммунных клеток с опухолевыми клетками в экспериментах in vitro и in vivo изучали с помощью интравитальной конфокальной микроскопии и метаболического биоимджинга.
Было обнаружено, что исходные культуры TIL характеризовались высоким уровнем экспрессии PD1 , низким относительным содержанием CD8+ CTL и, наоборот, высоким содержанием CD4+CD25+CD127-FOXP3+ иммуносупрессивных Т-регуляторных клеток. Разработанный нами модифицированный протокол активации в среде, содержащей комбинации IL-2/IL-15/ IL-21/IL-7, анти-ЮЗ, анти^28, анти-CDW и анти-PDL1-антитела позволяет получить клеточный препарат, содержащий до 95% CD8+ PD1- активированных CTL в количестве, достаточном для проведения адоптивной терапии (5x108 и более). В экспериментах in vitro активированные TIL так же, как пуповинные NK клетки и модифицированные YT клетки способны мигрировать внутрь сфероида глиобластомы человека, разрушая его, приводя к метаболическим нарушениям и апоптозу опухолевых клеток.
На сингенных ортотопических моделях GL-261 и ST-2A глиобластомы мыши изучали межклеточное взаимодействие аутологичных мышиных TIL с клетками глиомы, а также особенности иммуносупрессивного опухолевого
МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ
269
микроокружения. C помощью интравитальной микроскопии показана миграция флюоресцентно-меченных TIL и опухоль-ассоциированных МСК в очаг солидной опухоли. Полученные результаты могут лечь в основу новых технологий адоптивной иммунотерапии солидных опухолей, преодоления иммуносупрессивного микроокружения и дальнейших модификаций иммунных клеток, усиливающих их противоопухолевую активность. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда № 21-74-20110 и № 22-64-00057.
НАРУШЕНИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИЦ И ИХ МИКРООКРУЖЕНИЯ КАК ОСНОВА ПАТОЛОГИИ
Б.Г. Юшков
Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург, Россия ГАУЗ СО Институт медицинских клеточных технологий, Екатеринбург, Россия
e-mail: b.yushkov@iip.uran.ru
Ключевые слова: стволовые клетки, микроокружение, патология.
В последние годы все больше внимания привлекает проблема взаимоотношения клеток-предшественниц с их микроокружением. Считается, что активность стволовых клеток подлежит неклеточно-автономной регуляции из локального микроокружения или «ниши». Вместе с тем, не только микроокружение влияет на пролиферацию и дифференцировку клеток, но и последние могут оказывать влияние на формирование нужного им микроокружения.
Физиологически ниша состоит из различных тканевых компонентов, клеточных популяций (фибробласты, макрофаги, тучные клетки, Т-лимфоциты) и растворимых факторов, которые жестко регулируют поведение стволовых клеток.
Исследования при экстремальных состояниях свидетельствуют об изменении в экстрацеллюлярном матрик-се соотношения между гликопротеидами и кислыми ГАГ. Последние выступают в качестве факторов, блокирующих или запускающих механизмы митоза. При иммоби-лизационном стрессе в экстрацеллюлярном матриксе костного мозга снижается концентрация глюкозы, что предотвращает репликативное старение, усиливает ми-тохондриальное дыхание в мезенхимальных стволовых клетках человека. Кроме того, снижаются концентрации ЛДГ, щелочной и кислой фофатаз и возрастают концентрации холестерина, триглицеридов и фосфора, изменяется характер образуемых таким матриксом кристаллов. При воспалении в межклеточной среде костного мозга повышается концентрация витаминов В1, В2, В12, РР, С и падает В6.
В результате перестройки микроокружения может исчезнуть «ниша» резидентной стволовой клетки, что дает основание ввести термин «мигрирующая ниша», который хорошо объясняет феномен «клональной сукцессии». Некоторые авторы считают предпочтительным использование термина «непрерывное высвобождение стволовых клеток для дифференцировки».
Патология взаимодействия может быть результатом поражения самих стволовых клеток или дефекта микроокружения. При этом нормальные ССК животных с врожденным дефектом микроокружения могут
компенсировать дефект ССК, что показано на примере кроветворной ткани, сперматогенеза, развития молочной железы.
Признание нарушений микроокружения в патогенезе заболеваний требует разработки методов целенаправленной их коррекции путем модулирования микроокружения. В качестве примера можно привести направленную на фибробласты терапию при раке молочной железы, предлагаемую Ashleigh Unsworth et al.
ДВУХВЕКТОРНАЯ СИСТЕМА НА ОСНОВЕ АДЕНОАССОЦИИРОВАННОГО ВИРУСА ДЛЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ ДИСФЕРЛИНОПАТИИ
И.А. Яковлев1, 2, А.М. Емелин3, И.С. Лимаев3, О.Н. Чернова3, М.О. Мавликеев3, В.О. Солдатов4, А.В. Дейкин4, М.В. Корокин4, М.В. Покровский4, А.А. Ризванов5, Р.В. Деев1, 3, А.А. Исаев1
1 ПАО «Институт Стволовых Клеток Человека», Москва, Россия
2 ООО «Генотаргет», Москва, Россия
3 ФГБОУ ВО Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия
4 НИУ Белгородский государственный университет, Белгород, Россия
5 ФГАОУ ВО Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
e-mail: ivan@ivan-ya.ru
Ключевые слова: адено-ассоциированный вирус, миоди-строфия, дисферлинопатия, генная терапия, регенерация мышечной ткани.
Дисферлинопатия — орфанное фенотипически гетерогенное заболевание, вызываемое патогенными вариантами в гене DYSF, и нарушении синтеза трансмембранного белка дисферлина, одной из главных функций которого является участие в репарации дефектов клеточных мембран мышечных волокон (МВ). Неуклонное развитие дисферлинопатии приводит к тяжелой инвалидности в трудоспособном возрасте. На сегодняшний день не существует одобренных методов этиопатогенетиче-ского лечения дисферлинопатии.
Для реализации генотерапевтического подхода к лечению дисферлинопатии был использован аденоассо-циированный вирус (ААВ) 9 серотипа. Для доставки кодон-оптимизированного гена дисферлина, размер которого превышает лимит ёмкости ААВ, была использована двухвекторная система, в которой 2 вируса несли
2 части кДНК дисферлина (AAV9.DYSF). Эксперимент проводился на трансгенных мышах B6.A-Dysfprmd/GeneJ Bla/J. В 1 группе 12 самцам линии Bla/J была выполнена внутривенная инъекция вируса, забор биоматериала на 3, 6 и 12 недель. Во 2 группе выполнялось внутримышечное введение (в 3 дозировках) и внутривенное введение (в 1 дозировке), забор биоматериала через
3 недели. Для оценки влияния трансгенного дисфер-лина на состояние мышечной ткани были выполнены: ПЦР-РВ для количественной оценки копий ДНК и РНК, иммунофлюоресцентные реакции с диагностическими антителами, окраска гематоксилином и эозином для оценки морфометрических показателей. Во всех группах определен продукт иммунофлюоресцентной реакции, свидетельствуя о выработке дисферлина как минимум до 12 недели. В группе 2 количество дисферлин-позитив-ных МВ зависело от количества введенного ААВ. Таким
