CC BY
12
МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ
267
влияния на экспрессию целевых генов. При добавлении в качестве контроля вектора, содержащего только dCas9 и домены активации или ингибирования транскрипции, наблюдалось незначительное снижение экспрессии генов, что вероятно связано с ингибирующим действием самого dCas9.
Таким образом, в результате применения системы CRISPRa/i возможна индукция UCP1-зависимого термогенеза в адипоцитах за счет ко-активации транскрипции генов UCP1 и SREBP1c. Увеличение экспрессии разобщающего белка митохондрий UCP1 вероятно приведет к увеличению расхода энергии за счет использования в качестве субстрата свободных жирных кислот. Регуляция липогенеза активированным транскрипционным фактором SREBP1c может способствовать восполнению запаса жирных кислот, используемых в термогенезе.
ПРИМЕНЕНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, В ТЕРАПИИ НЕФРОТУБЕРКУЛЕЗА
Н.М. Юдинцева1, М.Г. Хотин1, М.А. Шевцов1,
М.И. Сулацкий1, Д.Ф. Гончарова1,
Т.И. Виноградова2, А.Н. Муравьев2, А.Н. Ремезова2,
М.З. Догонадзе2, Н.В. Заболотных2,
М.Е. Дьякова2, Д.С. Эсмедляева2, И.А. Гарапач2,
О.С. Маслак2, Н.А. Михайлова1
1 ФГБУН Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
2 ФГБУ Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: yudintceva@mail.ru
Ключевые слова: мезенхимные стволовые клетки, внеклеточные везикулы, бесклеточная терапия, нефротуберкулез.
Благодаря уникальным свойствам мезенхимные стволовые клетки (МСК) являются привлекательными в различных областях регенеративной медицины. Терапевтический потенциал МСК связан с антибактериальной, иммуномодулирующей активностью клеток, способностью восстанавливать альвеолярный эпителий и поврежденные ткани легких [1]. Терапевтические эффекты МСК связывают с паракринной активностью и секретомом, который состоит из внеклеточных везикул (ВВ), белков, цитокинов и ростовых факторов [2]. Благодаря способности преодолевать большие расстояния и биологические барьеры, ВВ играют важную роль при осуществлении бесклеточной терапии, позволяют решить проблемы клеточной терапии, такие как изменчивость, неконтролируемое деление и загрязнение онко-генными клетками.
В работе оценивали терапевтическую эффективность ВВ в комплексной противотуберкулезной терапии (ПТТ) нефротуберкулеза (НТб) кролика. НТб моделировали в введением штамма M. tuberculosis H37Rv в корковый слой паренхимы почки. Контроль развития НТб подтверждали результатами Диаскинтеста, данными биохимического исследования и компьютерной томографии (КТ). Исследовали три группы животных: контроль заражения (без ПТТ); контроль лечения (ПТТ); экспериментальная группа (ПТТ+ВВ). ВВ вводили в краевую вену уха кролика в объеме 1 мл с концентрацией белка 10 мкг/мл. Параметры и содержимое ВВ анализировали с помощью
ТЭМ и протеомного анализа. Терапевтическую эффективность ВВ оценивали через 1 мес после введения с помощью гистологического, биохимических методов и КТ.
Применение ВВ в комплексной ПТТ приводило к снижению активности и распространенности специфического воспаления в почках, уменьшению фиброзных изменений и ускорению репаративной реакции организма с формированием зрелой соединительной ткани. Таким образом, бесклеточная терапия представляется перспективным направлением в комплексном лечении НТб. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 19-58-45012 и Государственного задания № 0103-2019-0012.
Литература:
1. Zhang X., Xie Q., Ye Z. et al. Frontiers in Immunology. 2021. V. 12.
2. Crivelli B., Chlapanidas T., Perteghella S. et al. J. Control. Release. 2017. V. 262. P. 104.
ОЦЕНКА ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК КАК
МАРКЕРА АНЕУПЛОИДИЙ ПЛАЦЕНТАРНЫХ
КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ
В.В. Юницкая1, Т.А. Мараховская1 4,
О.И. Боровикова2, И.Б. Васина2, Н.Э. Скобликов1, 3, 5
1 ООО «СЛ МедикалГоуп», Краснодар, Россия
2 ООО «ОКСИ-центр», Краснодар, Россия
3 ФГБНУ КНЦЗВ, Краснодар Россия
4 Академия биологии и биотехнологии, ЮФУ, Ростов-На-Дону, Россия
5 ФГБОУ ВО Кубанский государственный медицинский университет, Краснодар, Россия
e-mail: yunitskaya96@mail.ru
Ключевые слова: ткани плаценты, мозаицизм, НИПТ, сек-
венирование, геномика.
В отличие от большинства соматических органов и тканей, плацента стала объектом исследования специалистов по клеточным технологиям и регенеративной медицине относительно недавно: трофобластный органоид был получен лишь в ноябре 2018 года [1]. Важность исследований именно провизорных органоидов очевидна. В то же время, исследователи, работающие в данном направлении, будут сталкиваться с проблемой проявления геномного непостоянства органоидов, приводящего к появлению клеточных линий, характеризующихся анеу-плоидным набором хромосом. Возможно, для специалистов данной области будет полезен опыт лабораторной диагностики и клинического наблюдения случаев плацентарной анеуплоидии (ограниченного плацентарного мозаицизма), выявленной по результатам геномных исследований.
В отделе геномной диагностики лаборатории «CL» исследовано 638 образцов крови беременных женщин в рамках проведения НИПТ — «неинвазивного прена-тального тестирования», являющегося скрининговым методом выявления анеуплоидий плода на раннем сроке беременности. В рамках теста анализируют количество фрагментов свободно циркулирующей внеклеточной ДНК (сцвДНК) плода относительно материнской сцвДНК, выделяемой из плазмы венозной крови беременной женщины. Исследование сцвДНК NIPT SAGE (Yourgene Health) проводилось методом полупроводникового секвенирования на платформе IonS5 со станцией пробоподготовки IonChef (Thermo Fisher Scientific).
2B8
МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ
Количество сцвДНК по каждой хромосоме выражалась через статистический показатель «Z-score», отражающий риск анеуплоидии: чем больше его отклонение от нулевого значения, тем более выражена вероятность анеуплоидии. Референсный интервал значения Z-score для аутосом составляет от — 6,0 до 2,8.
Нами выявлены два случая, которые могут быть охарактеризованы как ограниченный плацентарный моза-ицизм. В обоих случаях при геномном анализе сцвДНК пациенток по результатам проведения НИПТ были получены значения показателя Z-score по 18-й хромосоме, которые значительно превосходили референсные (15,31 и 27,61 соответственно), что свидетельствовало о высоком риске трисомии по 18-й хромосоме.
Следует учитывать, что исследуемая в рамках НИПТ сцвДНК поступает в кровоток матери не столько от тканей самого плода, сколько из тканей плаценты. По этой причине результат анализа сцвДНК, полученный в рамках НИПТ требует обязательного подтверждения соче-танным анализом тканей плаценты и плода, полученных в результате инвазивного вмешательства. При проведении дополнительного инвазивного исследования амнио-тической жидкости, пуповинной крови и ворсин хориона в обоих случаях была подтверждена анеуплоидия (три-сомия по 1 8-й хромосоме) клеток ворсин хориона при отсутствии признаков анеуплоидии в пуповинной крови, полученной при кордоцентезе. При проведении УЗИ на сроках 13 и 20 недель врождённые пороки развития плода не были обнаружены у обеих пациенток.
Полученные результаты были расценены как проявление ограниченного плацентарного мозаицизма, который характеризуется наличием клеток с аномальным хромосомным набором в плаценте при нормальном кариотипе плода [2-4]. Частота выявления такого состояния невелика [5]. Однако трисомия клеток плаценты является риском потери беременности, поэтому ведение таких пациенток должно осуществляться по специальному протоколу, направленному на сохранение беременности. В обоих случаях женщин вели как беременных с трисомией по 18-й хромосоме в плаценте. В результате в обоих описанных нами случаях родились в срок здоровые дети без клинических и лабораторных признаков анеуплоидий.
Возможно, предоставленная информация будет важна для специалистов, работающих в области геномных и клеточных технологий, а также для разработчиков аналитических систем геномного секвенирования. Динамический анализ внеклеточной ДНК в культураль-ных жидкостях in vitro может использоваться как инструмент в работе с клеточными линиями и при выращивании органоидов (не только плаценты).
Исследование выполнено при финансовой поддержке Кубанского научного фонда и ООО «СЛ МедикалГруп» в рамках научного проекта МФИ-П-20.1/10, а также при финансовой поддержке РФФИ и Краснодарского края в рамках научного проекта № 19-44-230040-р_а.
Литература:
1. Turco M.Y., Gardner L., Kay R.G. et al. Nature (2018). V. 564. P. 263-267.
2. Yang J., Qi Y., Guo F. et al. Mol. Cytogenet. (2017). V. 10. P. 1-4.
3. Барков И.Ю. Совершенствование системы пренатального скрининга анеуплоидий плода внеклеточной крови ДНК материна основе анализа. Диссертация на соискание степени к.м.н. Москва, 2018. 151 с.
4. Li X. et al. Medicine (2020). V. 99(29).
5. Hayata K. et al. Acta Medica Okayama (2017). V. 71. P. 181-185.
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОТЕРАПИЯ СОЛИДНЫХ
ОПУХОЛЕЙ
Г.М. Юсубалиева1, 2, C.B. Кулемзин3,
A.A. Калинкин1, П.А. Мельников1, 4,
М.В. Ширманова5, В.В. Белоусов6,
B.П. Баклаушев1, 2 7
1 ФНКЦ (ФНКЦ) ФМБА России, Москва, Россия
2 Институт молекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта, Москва, Россия
3 Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, Москва, Россия
4 НМИЦ психиатрии и наркологии им. В.П. Сербского Минздрава РФ, Москва, Россия
5 Приволжский национальный исследовательский медицинский университет, Н. Новгород, Россия
6 Федеральный центр мозга и нейротехнологий ФМБА России, Москва, Россия
7 НИИ пульмонологии ФМБА России, Москва, Россия
e-mail: gaukhar@gaukhar.org
Ключевые слова: адоптивная иммунотерапия, солидные
опухоли, опухоль инфильтрирующие лимфоциты, TILs, PD-1.
В экспериментах in vitro на опухолевых сфероидах и in vivo — на модели ортотопической глиобластомы оценивали противоопухолевую эффективность опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (TIL), NK-клеток из пупо-винной крови и модифицированных/таргетированных NK клеток линии YT (VAV1+, CISH-/-, B2M-/-, EGFRvIII-CAR, IL13-Her2-CAR). TILs получали из интраопераци-онного опухолевого материала пациентов, получавших хирургическое лечение мультиформной глиобластомы в ФНКЦ ФМБА России. Для визуализации клеток в экспериментах in vitro и in vivo применяли бицистронные лентивирусные векторы для одновременной экспрессии флюоресцентного белка mKate2 и люциферазы Luc2. В выделенных TILs с помощью проточной цито-метрии определяли субпопуляционый состав: доли ци-тотоксических CD8+ Т-клеток (CTL), CD4+ Т-хелперов, CD4+CD25+, FoхP3+ Т регуляторных клеток, CD56+ NK, CD56+CD3+ NKT, CD19+ В-клеток до и после активации. Взаимодействие иммунных клеток с опухолевыми клетками в экспериментах in vitro и in vivo изучали с помощью интравитальной конфокальной микроскопии и метаболического биоимджинга.
Было обнаружено, что исходные культуры TIL характеризовались высоким уровнем экспрессии PD1 , низким относительным содержанием CD8+ CTL и, наоборот, высоким содержанием CD4+CD25+CD127-FOXP3+ иммуносупрессивных Т-регуляторных клеток. Разработанный нами модифицированный протокол активации в среде, содержащей комбинации IL-2/IL-15/ IL-21/IL-7, анти-ЮЗ, анти^28, анти-CDW и анти-PDL1-антитела позволяет получить клеточный препарат, содержащий до 95% CD8+ PD1- активированных CTL в количестве, достаточном для проведения адоптивной терапии (5x108 и более). В экспериментах in vitro активированные TIL так же, как пуповинные NK клетки и модифицированные YT клетки способны мигрировать внутрь сфероида глиобластомы человека, разрушая его, приводя к метаболическим нарушениям и апоптозу опухолевых клеток.
На сингенных ортотопических моделях GL-261 и ST-2A глиобластомы мыши изучали межклеточное взаимодействие аутологичных мышиных TIL с клетками глиомы, а также особенности иммуносупрессивного опухолевого
