CC BY
9
морфологическое (анатомическое и гистологическое) представление об эпидуральном фиброзе. В исследовании использовали оборудование центра коллективного пользования «Диагностические изображения в хирургии».
Литература:
1. Животенко А.П., Гольдберг О.А., Сороковиков В.А. и др. Современные проблемы науки и образования. 2019. № 4. С. 60.
2. Гольдберг О.А., Животенко А.П., Самойлова Л.Г. и др. Acta Biomedica Scientifica. 2020. Т. 5. № 6. С. 259.
3. Шурыгина И.А., Шурыгин М.Г. Способ приготовления препарата костной ткани и набор для его осуществления. Пат. РФ № 2500104, кл. A01N 1/02, G01N 1/28.2013.
4. Shurygina I.A., Shurygin M.G., Ayushinova N.I. et al. Front. Chem. Sci. Eng. 2012. V. 6. N 2. P. 232.
5. Животенко А.П., Шурыгина И.А., Кошкарёва З.В. и др. Современные проблемы науки и образования. 2020. № 4. С. 151.
ДИНАМИКА ЭКСПРЕССИИ КАВЕОЛИНА В ЭПИДЕРМИСЕ ПРИ РЕГЕНЕРАТИВНЫХ ПРОЦЕССАХ
И.А. Шурыгина, И.С. Трухан, Н.Н. Дремина, М.Г. Шурыгин
ФГБНУ Иркутский научный центр хирургии и травматологии, Иркутск, Россия
e-mail: shurygina@rambler.ru
Ключевые слова: кавеолин, эпидермис, регенерация, рана.
Кавеолины — мембранные белки, участвующие в формировании липидных рафтов и кавеол плазматической мембраны, структур, ответственных за процессы клатрин-независимого эндоцитоза, трансдукцию сигналов и липидный обмен. Уровень экспрессии кавеолинов варьирует в разных тканях. Предполагается, что кавео-лин-1 играет важную роль в регенерации тканей, однако по разным сообщениям эта роль может быть отрицательной или положительной в зависимости от типа ткани и характера процесса восстановления.
Цель исследования: изучить изменение экспрессии кавеолина 1 в клетках эпидермиса в условиях моделирования кожно-мышечной раны.
Материалы и методы: Кожно-мышечную рану моделировали с использованием крыс линии Wistar. Выведение животных из эксперимента проводили в сроки от 2 часов до 30 суток. Иммуногистохимические исследования тканей проводили по описанной ранее методике [1-3] с применением первичных моноклональных антител, специфичных к кавеолину 1 (Caveolin 1 Monoclonal Antibody (7C8), Cat. No MA3-600, Invitrogen) и вторичные антитела Alexa fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) (Cat. No A11-031, Invitrogen). Исследование одобрено комитетом по этике.
Результаты: Отмечено повышение уровня экспрессии кавеолина в сроки от 1 до 7 суток, предшествующих и совпадающих с активным пролиферативным и регенеративным процессами в области раны. Снижение экспрессии к 14 сутках эксперимента, характеризующихся формированием рубцовой ткани, свидетельствует о том, что данный белок играет существенную роль в регуляции физиологических процессов заживления ткани после механическом повреждения. В исследовании использовали оборудование центра коллективного пользования «Диагностические изображения в хирургии».
Литература:
1. Shurygina I.A., Shurygin M.G., Ayushinova N.I. et al. Frontiers of Chemical Science and Engineering. 2012. V. 6. N 2. P. 232.
2. Shurygina I.A., Shurygin M.G., Granina G.B., Zelenin N.V. Journal of Regenerative Medicine & Tissue Engineering. 2013. V. 2.
3. Shurygin M.G., Shurygina I.A., Dremina N.N., Kanya O.V. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2015. V. 158. N 4. P. 528.
РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
АДИПОЦИТОВ 3T3-L1 С ПОМОЩЬЮ
СИСТЕМЫ CRISPRA/I
А.Д. Юдаева1, С.С. Мичурина2' 3, Ю.С. Стафеев2,
М.Ю. Меньшиков2, Е.В. Парфёнова2, 3
1 Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
2 ФГБУ НМИЦ кардиологии Минздрава России, Москва, Россия
3 МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: aleksa.yudaeva@gmail.com
Ключевые слова: CRISPRai, бакуловирус, генная терапия,
бежевая дифференцировка, термогенез.
Ожирение является широко распространённым заболеванием в мире. Индукция бежевой дифференцировки и изменение метаболизма белой жировой ткани могут иметь большой потенциал для лечения метаболических нарушений. Канонический механизм термогенеза в ади-поцитах осуществляется за счет активности разобщающего белка митохондрий UCP1, рассеивающего энергию протонного градиента в виде тепла. Кроме активности UCP1, важную роль в термогенезе играют метаболические пути, снабжающие митохондрии энергией. В нашей работе мы разрабатываем систему для изменения экспрессии генов, являющихся регуляторами липогенеза (SREBP1 с, ChREBPIb), липолиза (ATGL, Cesld, G0s2), окисления жирных кислот (PPARa, PGCIa), генов, чья экспрессия способствует бежевой дифференцировке и термогенезу (PGCIa, UCP1). Регуляция экспрессии указанных белков позволит разработать более эффективные подходы для получения термогенных адипоцитов и дальнейшего их использования в борьбе с ожирением.
В нашей работе мы использовали систему регуляции транскрипции CRISPRa/i (CRISPR activation/ interference), которая состоит из деактивированной нуклеазы Cas9 (dCas9), гидовой РНК со шпильками, рекрутирующими комплекс активаторов транскрипции MCP-p65-HSF1 или комплекс ингибиторов транскрипции Com-KRAB к промоторам целевых генов. Подбор гидовых РНК осуществляли с помощью интернет ресурса https:www.benchling.com. Для доставки генетических конструкций использовались бакуловирусные частицы. Полученные конструкции использовали для трансдукции зрелых адипоцитов 3T3-L1. Эффективность регуляции экспрессии целевых генов оценивали на 3 и 5 день после трансдукции методом ПЦР в реальном времени.
В результате были созданы бакуловирусные вектора для активации экспрессии генов UCP1, Cesld, PPARa, PGCIa, ChREBPIb, SREBPIa ATGL и для инги-бирования G0s2 и Cesld. После применения системы CRISPRa/i на адипоцитах 3T3-L1 наблюдалось увеличение экспрессии мРНК UCP1 более чем в 40 раз, а также 2-кратное повышение экспрессии SREBPIc. В остальных случаях бакуловирусная трансдукция не оказывала
влияния на экспрессию целевых генов. При добавлении в качестве контроля вектора, содержащего только dCas9 и домены активации или ингибирования транскрипции, наблюдалось незначительное снижение экспрессии генов, что вероятно связано с ингибирующим действием самого dCas9.
Таким образом, в результате применения системы CRISPRa/i возможна индукция UCP1-зависимого термогенеза в адипоцитах за счет ко-активации транскрипции генов UCP1 и SREBP1c. Увеличение экспрессии разобщающего белка митохондрий UCP1 вероятно приведет к увеличению расхода энергии за счет использования в качестве субстрата свободных жирных кислот. Регуляция липогенеза активированным транскрипционным фактором SREBP1c может способствовать восполнению запаса жирных кислот, используемых в термогенезе.
ПРИМЕНЕНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, В ТЕРАПИИ НЕФРОТУБЕРКУЛЕЗА
Н.М. Юдинцева1, М.Г. Хотин1, М.А. Шевцов1,
М.И. Сулацкий1, Д.Ф. Гончарова1,
Т.И. Виноградова2, А.Н. Муравьев2, А.Н. Ремезова2,
М.З. Догонадзе2, Н.В. Заболотных2,
М.Е. Дьякова2, Д.С. Эсмедляева2, И.А. Гарапач2,
О.С. Маслак2, Н.А. Михайлова1
1 ФГБУН Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
2 ФГБУ Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: yudintceva@mail.ru
Ключевые слова: мезенхимные стволовые клетки, внеклеточные везикулы, бесклеточная терапия, нефротуберкулез.
Благодаря уникальным свойствам мезенхимные стволовые клетки (МСК) являются привлекательными в различных областях регенеративной медицины. Терапевтический потенциал МСК связан с антибактериальной, иммуномодулирующей активностью клеток, способностью восстанавливать альвеолярный эпителий и поврежденные ткани легких [1]. Терапевтические эффекты МСК связывают с паракринной активностью и секретомом, который состоит из внеклеточных везикул (ВВ), белков, цитокинов и ростовых факторов [2]. Благодаря способности преодолевать большие расстояния и биологические барьеры, ВВ играют важную роль при осуществлении бесклеточной терапии, позволяют решить проблемы клеточной терапии, такие как изменчивость, неконтролируемое деление и загрязнение онко-генными клетками.
В работе оценивали терапевтическую эффективность ВВ в комплексной противотуберкулезной терапии (ПТТ) нефротуберкулеза (НТб) кролика. НТб моделировали в введением штамма M. tuberculosis H37Rv в корковый слой паренхимы почки. Контроль развития НТб подтверждали результатами Диаскинтеста, данными биохимического исследования и компьютерной томографии (КТ). Исследовали три группы животных: контроль заражения (без ПТТ); контроль лечения (ПТТ); экспериментальная группа (ПТТ+ВВ). ВВ вводили в краевую вену уха кролика в объеме 1 мл с концентрацией белка 10 мкг/мл. Параметры и содержимое ВВ анализировали с помощью
ТЭМ и протеомного анализа. Терапевтическую эффективность ВВ оценивали через 1 мес после введения с помощью гистологического, биохимических методов и КТ.
Применение ВВ в комплексной ПТТ приводило к снижению активности и распространенности специфического воспаления в почках, уменьшению фиброзных изменений и ускорению репаративной реакции организма с формированием зрелой соединительной ткани. Таким образом, бесклеточная терапия представляется перспективным направлением в комплексном лечении НТб. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 19-58-45012 и Государственного задания № 0103-2019-0012.
Литература:
1. Zhang X., Xie Q., Ye Z. et al. Frontiers in Immunology. 2021. V. 12.
2. Crivelli B., Chlapanidas T., Perteghella S. et al. J. Control. Release. 2017. V. 262. P. 104.
ОЦЕНКА ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК КАК
МАРКЕРА АНЕУПЛОИДИЙ ПЛАЦЕНТАРНЫХ
КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ
В.В. Юницкая1, Т.А. Мараховская1 4,
О.И. Боровикова2, И.Б. Васина2, Н.Э. Скобликов1, 3, 5
1 ООО «СЛ МедикалГоуп», Краснодар, Россия
2 ООО «ОКСИ-центр», Краснодар, Россия
3 ФГБНУ КНЦЗВ, Краснодар Россия
4 Академия биологии и биотехнологии, ЮФУ, Ростов-На-Дону, Россия
5 ФГБОУ ВО Кубанский государственный медицинский университет, Краснодар, Россия
e-mail: yunitskaya96@mail.ru
Ключевые слова: ткани плаценты, мозаицизм, НИПТ, сек-
венирование, геномика.
В отличие от большинства соматических органов и тканей, плацента стала объектом исследования специалистов по клеточным технологиям и регенеративной медицине относительно недавно: трофобластный органоид был получен лишь в ноябре 2018 года [1]. Важность исследований именно провизорных органоидов очевидна. В то же время, исследователи, работающие в данном направлении, будут сталкиваться с проблемой проявления геномного непостоянства органоидов, приводящего к появлению клеточных линий, характеризующихся анеу-плоидным набором хромосом. Возможно, для специалистов данной области будет полезен опыт лабораторной диагностики и клинического наблюдения случаев плацентарной анеуплоидии (ограниченного плацентарного мозаицизма), выявленной по результатам геномных исследований.
В отделе геномной диагностики лаборатории «CL» исследовано 638 образцов крови беременных женщин в рамках проведения НИПТ — «неинвазивного прена-тального тестирования», являющегося скрининговым методом выявления анеуплоидий плода на раннем сроке беременности. В рамках теста анализируют количество фрагментов свободно циркулирующей внеклеточной ДНК (сцвДНК) плода относительно материнской сцвДНК, выделяемой из плазмы венозной крови беременной женщины. Исследование сцвДНК NIPT SAGE (Yourgene Health) проводилось методом полупроводникового секвенирования на платформе IonS5 со станцией пробоподготовки IonChef (Thermo Fisher Scientific).
