CC BY
6
трансплантация адипоцитарной
тканеинженерной конструкции
с crispr-опосредованной активацией
экспрессии ucp1
С.С. Мичурина1, 2, Ю.С. Стафеев1, В.А. Труонг3,
М.Ю. Меньшиков1, Ю.Ч. Ху3, Е.В. Парфёнова1, 2
1 ФГБУ НМИЦ кардиологии Минздрава России, Москва, Россия
2 МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
3 Национальный университет Цинь Хуа, Синчжу, Тайвань
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: CRISPRa, бакуловирус, UCP1, генная терапия, термогенез.
Нарушение системного энергетического гомеостаза, заключающееся в избыточном поступлении и сниженном расходовании энергетических субстратов, приводит к развитию ожирения и сахарного диабета 2 типа. Активация термогенеза жировой ткани сопровождается окислением глюкозы или жирных кислот с последующим выделением полученной энергии в виде тепла при активации разобщающего белка внутренней мембраны митохондрий UCP1. Благодаря способности утилизировать избыточную энергию трансплантация термогенной жировой ткани может способствовать предотвращению метаболических заболеваний. В настоящей работе мы разработали систему активации транскрипции (CRISPRa) для получения и трансплантации зрелых адипоцитов с повышенной экспрессией UCP1.
Для трансплантации использовали мезенхимные стромальные клетки мыши, дифференцированные в зрелые адипоциты. Для активации экспрессии UCP1 мы создали систему CRISPRa-UCP1, содержащую dCas9, комплексы активации транскрипции и гидовые РНК, специфичные к UCP1. Доставку CRISPRa-UCP1 в адипо-циты осуществляли с помощью бакуловирусной транс-дукции. Модифицированные адипоциты смешивали с матриксом Matrigel и вводили мышам C57BL/6 в область ингвинального жирового депо. Через 7 дней проводили глюкозотолерантный тест, измерение массы тела животных, сбор сыворотки крови. Тканеинженерные конструкции извлекали для анализа экспрессии UCP1 и белков метаболизма адипоцитов методами ПЦР в реальном времени и иммуногистохимии.
На 7 день после трансплантации мы наблюдали увеличение мРНК UCP1 в 40 раз и белка в 4 раза в адипо-цитарных тканеинженерных конструкциях, модифицированных CRISPRa-UCP1. Полученные тканеинженерные конструкции содержали зрелые адипоциты с жировыми каплями. Адипоциты экспрессировали гормончувстви-тельную липазу и транскрипционный фактор PGC1 a, регулирующий белую и бежевую адипогенную диффе-ренцировку. Трансплантация не повлияла на массу тела животных и толерантность к глюкозе за 7 дней воздействия. Трансплантация конструкций, не сопровождалась инфильтрацией CD68+ макрофагами и не повышала концентрацию провоспалительных цитокинов ФНОа и ИЛ-6 в сыворотке животных.
Разработанная система CRISPRa-UCP1 позволяет эффективно активировать экспрессию UCP1 для создания термогенных адипоцитов. Отсутствие системных метаболических эффектов тканеинженерных конструкций может быть связано с низкой продолжительностью воздействия и отсутствием метаболических нарушений у животных. Aдипоциты, модифицированные системой
CRISPRa-UCP1, сохраняют морфологию и метаболические свойства после трансплантации и не вызывают активацию локального и системного воспаления. Полученные результаты свидетельствуют об эффективности и отсутствии иммуногенности CRISPRa-UCP1 и бакуловирусной системы доставки. Работа поддержана грантом РНФ #20-45-08003.
дифференциальная экспрессия микрорнк в условиях модели церебральной ишемии у крыс при использовании контралатерального полушария в качестве контроля: избыточные и упущенные результаты
И.В. Мозговой1, И.Б. Филиппенков1, Ю.А. Ремизова1, В.В. Ставчанский1, А.Е. Денисова2, Л.В. Губский2, 3, С.А. Лимборская1, Л.В. Дергунова1
1 ФГБУ Институт молекулярной генетики НИЦ Курчатовский институт, Москва, Россия
2 ФГАОУ ВО Российский национальный исследовательский медицинский университет
им. Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, Россия
3 ФГБУ Федеральный центр мозга и нейротехнологий ФМБА, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: ишемический инсульт, tMCAO, ипсилате-ральное полушарие мозга, контралатеральное полушарие мозга, транкриптомика, RNA-Seq, микроРНК, микроРНК-мРНК взаимодействия.
Ишемический инсульт — одно из наиболее значимых заболеваний, нарушающих функции мозга. Изучение роли микроРНК как молекул со значительным регуля-торным потенциалом позволяет составить более полное представление о молекулярном патогенезе инсульта. Подобные исследования обычно проводят на моделях животных, и особое значение имеет интерпретация получаемых данных в приложении к клинике. Часто для изучения процессов, протекающих в ипсилатеральном полушарии (ИП) мозга, в качестве контроля используют контралатеральное полушарие (КП) [1, 2]. Однако показано, что после инсульта в КП могут протекать процессы (распространяющаяся депрессия/деполяризация, трансполушарный диашиз), отражающиеся на профиле экспрессии генов. В этой связи рациональной альтернативой КП является использование в качестве контроля образцов мозга ложнооперированных (ЛО) животных.
В данной работе с помощью RNA-Seq был исследован профиль экспрессии микроРНК в подкорковых структурах мозга крыс через 24 ч после обратимой окклюзии правой средней мозговой артерии (tMCAO), выполненной под контролем магнитно-резонансной томографии. Мы проанализировали серию образцов из ИП, КП ишемизированных крыс и правого полушария мозга ЛО животных.
В результате, из 768 аннотированных микроРНК, 26 и 29 оказались дифференциально экспрессирован-ными (ДЭМ) в ИП относительно КП и ЛО соответственно (кратность>1,5; Padj < 0,05). Только 16 ДЭМ оказались общими для обоих сравнений и могли отражать эффект ишемии в ИП вне зависимости от выбора контролей. При этом 1 0 ДЭМ были уникальными для сравнения с КП и 13 ДЭМ — с ЛО. Эти ДЭМ могли представлять
«избыточные» и «упущенные» результаты, соответственно, при использовании КП в качестве контроля. Для установления роли выявленных ДЭM при инсульте с помощью баз данных mirDB и Targetscan были отобраны мРНК, являющиеся мишенями ДЭM. Функциональный анализ генов, кодирующих мРНК-мишени, выявил 44 метаболических пути (KEGG), которые могут быть связаны с активностью ДЭM. Только 13 путей (GnRH, MAPK, Dopaminergic synapse и др.) выделялись при использовании как КП, так и ЛО в качестве контроля, в то время как 31 путь (Focal adhesion, Wnt, GABA и др.) выделялся только с помощью одного из контролей. Большинство из них (29 путей) относились к «упущенным» результатам при использовании КП в качестве контроля.
Таким образом, использование КП и ЛО контролей позволило выявить микроРНК-сигналы биполушарных изменений в мозге крыс после tMCAO. Показано значительное влияние выбора контролей на получаемые результаты анализа ДЭM в ИП и их функциональную интерпретацию. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Правительства Mосквы в рамках научного проекта № 21-34-70048.
Литература:
1. Ramsay L.A., Quille M.L., Orset C. et al. Ann Clin Transl Neurol.
2019. V. 6. № 9. P. 1681-95.
2. Wegner S., Uhlemann R., Boujon V. et al. Mol Neurobiol. 2020.
V. 57. № 3. P. 1446-58.
влияниe нестероидных противовоспалительных средств на аденовирусную трансдукцию культур ммск
В.О. Мокроусова1 2, И.А. Недорубова1, А.Ю. Меглей2, А.В. Васильев2, Т.Б. Бухарова1, Д.В. Гольдштейн1
1 ФГБНУ Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова, Москва, Россия
2 ФГБУ НМИЦ ЦНИИСиЧЛХ Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: нестероидные противовоспалительные средства, ибупрофен, диклофенак, кетопрофен, аденовирусная трансдукция.
На данный момент генная терапия с использованием аденовирусных конструкций является одним из наиболее перспективных направлений в регенеративной медицине. Такой подход обеспечивает высокую эффективность трансдукции как делящихся, так и неделящихся клеток, позволяет переносить трансгены до 35 т.п.о. и исключает риск инсерционного мутагенеза. Однако, существенным недостатков применения аденовирусных конструкций является иммунный ответ организма и, как следствие, невозможность повторного использования данной вирусной системы. Для снижения иммунной реакции могут быть использованы нестероидные противовоспалительные средства (НПВС). Целью исследования была оценка влияния различных НПВС на эффективность аденовирусной трансдукции и жизнеспособность мультипотент-ных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК).
Материалы и методы. В работе использовали ММСК, полученные из жировой ткани крыс. Клетки инкубировали в присутствии аденовирусных векторов с геном зеленого флуоресцентного белка (Ad-GFP) с вирусной нагрузкой
320 ТСЮ50/мл в течение 16 ч. В качестве НПВС были выбраны: ибупрофен (1Ьи) в концентрации 0,5 мг/мл, 0,25 мг/мл и 0,125 мг/мл, диклофенак Юю) в концентрации 0,015 мг/мл, 0,03 мг/мл, 0,3 мг/мл и кетопрофен (Ке^ в концентрации 0,25 мг/мл, 1,25 мг/мл, 2,5 мг/мл. НПВС присутствовали в среде на протяжении всего исследуемого периода. На 1 и 3 сутки исследовали жизнеспособность клеток методом МТТ-теста и эффективность вирусной трансдукции по наличию клеток, содержащих флуоресценный белок ЭРР с помощью микроскопии и проточной цитофлуориметрии.
Результаты. Были подобраны оптимальные концентрации для каждого НПВС, не оказывающие существенного цитотоксического действия на ММСК (гибель не более 20% клеток). Жизнеспособность клеток через 3 суток инкубации для 0,125 мг/мл 1Ьи составляла 96,3 ± 3,8%, для 0,015 мг/мл Ио - 81,0 ± 2,5%, а для 0,25 мг/мл ^ -79,9 ± 1,0%. Эффективность трансфекции ММСК АС-ЭРР через 3 суток составила при добавлении 1Ьи 60,0 ± 1,6%, Ио - 31,4 ± 7,9%, ^ - 51,7 ± 5,7%, а в контрольной группе - 48,5 ± 2,0% (в отсутствие НПВС).
Таким образом, 1Ьи является наиболее предпочтительным НПВС для использования с аденовирусными векторами, не вызывает гибели клеток и оказывает положительное влияние на трансдукцию ММСК. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, грант № 21-75-10147.
локальное введение секретома мезенхимных стромальных клеток снижает количество м2 макрофагов в моделях повреждения сперматогенеза
A.О. Монакова1, 2, Г.Д. Сагарадзе2, Н.А. Басалова2, В.С. Попов1, 2,
B.Ю. Балабаньян1 2, А.Ю. Ефименко1 2
1 Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Институт регенеративной медицины, Медицинский научно-образовательный центр, МГУ
им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: мезенхимные стромальные клетки, секретом, М2 макрофаги, сперматогенез, бесплодие.
Идиопатическое мужское бесплодие относится к состояниям с неудовлетворённой медицинской потребностью, для которой практически не существует эффективных методов лечения. Среди новых перспективных подходов терапии этого заболевания нами исследуется секретом мезенхимных стволовых клеток (МСК), эффективность которого была ранее продемонстрирована на различных животных моделях. Однако для продвижения в клинику препаратов на основе секретома МСК требуются дальнейший поиск их основных клеточных мишеней и исследование механизмов действия. Ранее мы показали, что секретом МСК оказывает воздействие на различные клетки ниши сперматогониальных стволовых клеток, стимулируя восстановление ниши после повреждения. В данной работе в качестве клеточной мишени секретома МСК мы рассматриваем М2 макрофаги, поскольку изменение их количества и функции может играть решающую роль в патогенезе нарушений сперматогенеза. Кроме того, в составе секретома МСК содержится множество факторов, которые способны регулировать функции макрофагов.
