CC BY
1422021, т. 11, № 2
УДК 612-092.18:575.224.232 DOI: 10.37279/2224-6444-2021-11-2-64-74
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПАТОЛОГИИ
Архипенко А. Л.1, Беренштейн М. В.1, Ухаботина А. В.1, Фомочкина И. И.2, Нуриддинова Э. С.2
'Центральная научно-исследовательская лаборатория, 2кафедра общей и клинической патофизиологии, Медицинская академия имени С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского», 295051, бульвар Ленина 5/7, Симферополь, Россия
Для корреспонденции: Фомочкина Ирина Ивановна, доктор медицинских наук, профессор кафедры общей и клинической патофизиологии, Медицинская академия имени С. И. Георгиевского, ФГАОУ ВО «1 ФУ И. Вернадского», e-mail: [email protected]
For correspondence: Fomochkina I. I., MD, Professor of the Department of General and Clinical Pathophysiology of Medical Academy named after S.I. Georgievsky of Vernadsky CFU, e-mail: [email protected]
Information about authors:
Archipenko A. L., https://orcid.org/0000-0002-0738-7936 Berenshteyn M. V., https://orcid.org/0000-0002-4569-5139 Ukhabotina A. V., https://orcid.org/0000-0001-6682-3286 Fomochkina I. I., https://orcid.org/0000-0003-3065-5748 Nuriddinova E. S., https://orcid.org/0000-0003-0096-2755
РЕЗЮМЕ
На сегодняшний день для медицинского сообщества особенно актуальна проблема своевременной диагностики генетических нарушений плода. На данный момент наиболее эффективными являются молекулярно-генетические методы - большая и разнообразная группа методов, предназначенная для выявления повреждений в структуре участка ДНК вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований. Появление молекулярно-генетических методов открыло в изучении хромосом человека и их нарушении новое измерение - субмикроскопический уровень. Основными исследованиями, используемыми в клинической практике, являются: определение кариотипа; изучение материала замерших беременностей; исследование ооцитов и сперматозоидов; пренатальная инвазивная и неинвазивная диагностика; генетическое консультирование. Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), позволяет объективно выявлять нуклеотидный состав конкретной хромосомы или локуса. FISH-анализы важны для клинической диагностики различных хромосомных аномалий, включая делеции, дупликации и транслокации.
Ключевые слова: молекулярно-генетические методы; пренатальная диагностика; хромосомные аномалии.
MOLECULAR-GENETIC APPROACHES TO DIAGNOSTICS OF HEREDITARY PATHOLOGY Archipenko A. L.1, Berenshtein M. V.1, Ukhabotina A. V.1, Fomochkina I. I.2, Nuriddinova E. S.2
'Central Research Laboratory, ^Department of General and Clinical Pathophysiology, Medical Academy named after S.I. Georgievsky of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia
SUMMARY
Today, the problem of timely diagnosis of fetal genetic disorders is especially urgent for the medical community. At the moment, the most effective are molecular-genetic methods - a large and diverse group of methods designed to detect damage in the structure of a DNA section up to deciphering the primary sequence of bases. The emergence of molecular-genetic methods has opened up a new dimension in the study of human chromosomes and their violation - the submicroscopic level. The main studies used by healthcare professionals are: determination of the karyotype; study of the material of missed pregnancies; examination of oocytes and spermatozoa; prenatal invasive and non-invasive diagnostics; genetic counseling. The method of fluorescence in situ hybridization (FISH), allows you to objectively identify the nucleotide composition of a particular chromosome or locus. FISH assays are important for the clinical diagnosis of various chromosomal abnormalities, including deletions, duplications, and translocations.
Key words: molecular-genetic methods; prenatal diagnostics; chromosomal abnormalities
В 2001 году «Nature» и «Science» опубликовали две основополагающие статьи, в которых впервые была подробно описана почти полная последовательность генома человека [1; 2]. Эти исследования стали отправной точкой для нового периода в биомедицине и позволили добиться постоянного улучшения диагностики генетиче-
ских нарушений и внедрения геномного анализа в клиническую практику. По прошествии 20 лет можно утверждать, что картирование большого числа генов, ассоциированных с развитием заболеваний, изменило проведение традиционных эпидемиологических исследований, позволило расшифровать этиологию многих генетических
болезней, разработать методы генетического прогнозирования заболеваний, расширить возможности медико-генетического консультирования [3]. Реализация проектов национального уровня, таких как «Ноев ковчег» в МГУ им. М.В. Ломоносова и «Российские геномы» в Санкт-Петербургском государственном университете способствует дальнейшему развитию и совершенствованию геномных технологий, обеспечивает создание единого биоколлекционного пространства, в котором аккумулируются самые разнообразные данные о максимально возможном количестве биологических образцов [4; 5]. Развитие и масштабирование исследований в данной области позволит в перспективе открывать новые варианты лечения различных заболеваний, основывающиеся на технологиях геномного редактирования, для улучшения здоровья человека в целом.
Молекулярно-генетические методы - большая и разнообразная группа методов, предназначенная для выявления вариаций (повреждений) в структуре участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований. Хотя ДНК-диагностика основана на сложных, трудоемких и относительно дорогостоящих исследованиях, она имеет важные преимущества перед традиционными методами диагностики. С помощью ДНК-диагностики можно решать задачи, которые часто не удается решить другими методами: подтверждение клинического диагноза или дифференциальная диагностика, досимптомати-ческая диагностика - когда клинические признаки заболевания с поздним дебютом отсутствуют, разнообразные подходы к пренатальной диагностике [6].
В настоящее время состояние репродуктивного здоровья в России вызывает обеспокоенность. Важнейшими факторами, которые влияют на процесс снижения состояния репродуктивного здоровья населения, являются мужской и женское бесплодие, невынашивание беременности, рождение детей с множественными врожденными пороками развития и др. Поскольку репродуктивные потери зачастую могут быть обусловлены генетическими факторами, для их выявления в настоящее время широко применяются цитогенетические и молекулярно-генети-ческие исследования. Рост числа супружеских пар, применяющих вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ), способствует еще более широкому внедрению указанных методов в лабораторную практику. В связи с этим, цель настоящего обзора - рассмотреть современные методы и подходы к молекулярно-генетической диагностике в сфере репродуктивного здоровья,
оценить преимущества и недостатки, выявить наиболее перспективные подходы, а также определить перспективы развития данной отрасли в междисциплинарном аспекте.
Развитие медицинской генетики в мире шло по пути создания центров, в которых можно провести любую генетическую диагностику с использованием самых современных методов, включая цитогенетические и молекулярно-цито-генетические. На национальном уровне развитие клинической цитогенетики и молекулярной генетики набирает обороты, причем широкое внедрение ВРТ отчасти явилось стимулом для их развития, поскольку генетические тесты проводятся в репродуктивной медицине для трех основных целей: выявление причин бесплодия, выявление генетических заболеваний, передающихся потомству, и оптимизация ВРТ. Основными исследованиями, направленными на совершенствование оказания медицинской помощи в сфере репродуктивного здоровья, являются:
1. исследование конституциональных особенностей индивидуума - определение кариотипа;
2. изучение материала замерших беременностей для выяснения причин как при естественной беременности, так и в циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО);
3. исследование ооцитов и сперматозоидов;
4. пренатальная инвазивная, включая пре-димплантационную генетическую диагностику (ПГД) в циклах с применением ВРТ, и неинвазивная диагностика с целью профилактики хромосомной патологии у плода;
5. генетическое консультирование.
Кариотипирование супружеской пары представляет собой основной лабораторный метод диагностики хромосомных аномалий в репродуктивной медицине. Установлено, что каждый здоровый субъект является носителем 5/8 генетических изменений, связанных с рецессивными генетическими нарушениями; следовательно, даже при отсутствии специфических симптомов планирование семьи и репродукция нести в себе определенные риски. Более того, сообщалось, что почти 50% случаев бесплодия связаны с генетическими нарушениями [6; 7]. При наличии или подозрении на генетически обусловленный репродуктивный риск генетический тест позволяет более точно диагностировать бесплодие и дает возможность проинформировать семейную пару о возможности передачи болезни потомству. Накопленный опыт свидетельствует, кари-отипирование рекомендовано следующим группам пациентов с наличием как мужского, так
и женского факторов нарушения репродукции: первичное/вторичное бесплодие; нарушение сперматогенеза: необструктивная азооспермия, тяжелая олигозооспермия (<5 млн/мл сперматозоидов в эякуляте), астенозооспермия и др.; первичная /вторичная аменорея (преждевременная менопауза); задержка полового развития; отягощенный акушерский анамнез - привычное невынашивание (наличие 2 и более самопроизвольных абортов в I триместре беременности), мертворождение, рождение ребенка с множественными врожденными пороками развития.
Присутствие в кариотипе пациента числовой хромосомной аберрации или несбалансированной перестройки (делеции, дупликации), как правило, меняет дозовое соотношение генов, поэтому такие изменения повлекут за собой существенные отклонения в фенотипе (клинической картине). Напротив, наличие в кариотипе аберраций типа сбалансированных перестроек - транслокаций (робертсоновские и реципрок-ные), инверсий, некоторых маркерных хромосом, не несущих структурных генов, зачастую не приводят к потере или добавлению генетического материала. Их носители, как правило, фенотипически здоровы, но имеют риск рождения ребенка с хромосомной патологией. По данным литературы, если популяционная частота, например, таких сбалансированных транслокаций не превышает 0,1%, то их частота в группах мужчин и женщин с репродуктивными проблемами достигает 6,1% и 8% соответственно [8].
Появление молекулярно-цитогенетических методов открыло в изучении хромосом человека и их нарушении новое измерение - субмикроскопический уровень. Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), позволяет объективно выявлять индивидуальные хромосомы и их отдельные участки на метафазных пластинках или интерфазных ядрах на основе особенностей их молекулярно-генетического строения - нуклеотидного состава конкретной хромосомы или локуса. Флуоресцентная гибридизация in situ - метод, в котором используются флуоресцентные зонды, которые связываются только с теми частями хромосомы, которые обладают высокой степенью комплементарности последовательностей. FISH-анализы важны для клинической диагностики различных хромосомных аномалий, включая делеции, дупликации и транслокации. В настоящее время мультифлуо-ресцентный FISH, в котором каждая хромосома окрашивается в свой цвет, может быстро сканировать набор хромосом с ограниченным разрешением. На практике использовать полный набор из 24 зондов нецелесообразно; вместо этого выбирают от пяти до семи зондов для хромосом,
наиболее часто участвующих в анеуплоидии (например, 13, 14, 15, 16, 18, 21, 22 и X). Основными преимуществами метода флуоресцентной гибридизации in situ является возможность анализа интерфазных и метафазных хромосом, что устраняет необходимость в культуре клеток. При FISH-анализе можно одновременно контролировать несколько сайтов, если зонды гибридизации были помечены разными флурофорами. Метод дает быстрые результаты (через 1-2 дня), предлагает высокую аналитическую специфичность (более 98%). Метод флуоресцентной гибридизации in situ превращается в необходимую аналитическую процедуру в ходе цитогенети-ческого исследования и стал востребованным сегодня в пре- и постнатальной диагностике, в мониторинге зигот после искусственного оплодотворения в процедуре ПГД в ходе селекции эмбрионов с нормальным кариотипом и т.д. При этом метод не лишен и некоторых недостатков, среди которых ограниченная количеством выбранных зондов способность обнаруживать хромосомные аномалии, отсутствие информации о других хромосомах, которые не подвергались тщательной проверке. Невозможность обнаружения некоторых структурных хромосомных аномалии (например, инверсии).
Кроме FISH-анализа, все более широкое использование инструментов, NGS (секвенирова-ния следующего поколения), как для диагностических, так и для исследовательских целей, позволяет нам эффективно расширить наши знания в этой области, что важно при кариоти-пировании пациентов с репродуктивными проблемами, поскольку хромосомные изменения в кариотипе такой группы пациентов, как правило, не имеют отклонений в фенотипе [9].
Изучение материала замерших беременностей I триместра (наиболее доступный вариант - ворсины хориона) для выяснения причин как при естественной беременности, так и в циклах экстракорпорального оплодотворения, также выступает объектом для цитогенетиче-ской диагностики супружеских пар с репродуктивными проблемами. Кариотип клеток экстраэмбриональных оболочек плода хориона (плаценты), как правило, соответствует кариотипу зародыша. Этот материал можно получить при спонтанно замершей беременности у группы женщины с диагнозом привычное невынашивание (по определению ВОЗ - наличие в анамнезе у женщины подряд трех и более самопроизвольных прерываний беременности в сроках до 22 недель). Представления о структуре хромосомных аномалий среди замерших беременностей сформированы на основе результатов многочисленных цитогенетических исследований
различных тканей зародышей, выполненных с использованием стандартного анализа метафаз-ных хромосом.
В структуре выявленных хромосомных аберраций в культуре абортного материале преобладают полиплоидии- 40%, трисомия 21 - 18% трисомия 16 -11%, трисомия 18- 8%, трисомия 13 - 4%, моносомия Х - 10%, прочие - 9% (рис.1) [10].
Я 1 V г [ 1г?с в 4 5
и в V & т tt Irl Ъ 9 п п It 10 11 12
W п т ъъ 1S tt 'ViT is 17 ia
* К * <а * (i' 1 -
19 2 21 22 X ¥
> 7
Рис.1. Транслокационная форма синдрома Дауна. 46, XY, der(14;21)(q10;q10)+21)
Однако, до 30% образцов тканей спонтанных абортусов оказываются не доступными для стандартного цитогенетического анализа вследствие дегенерации клеток [11]. Более широкие возможности исследования кариотипов материала абортусов дает молекулярно-цитогенетиче-ский анализ: FISH и NGS.
Основными задачами изучения материала замерших беременностей I триместра является выявление пациентов-носителей сбалансированных перестроек хромосом; выделение группы пациентов, у которых невынашивание неоднократно сопровождается той или иной хромосомной аномалией в кариотипе эмбриона и подготовка для них соответствующих рекомендаций. В семьях с невынашиванием и отягощенным акушерским анамнезом при нормальном кариотипе родителей и нормальном кариотипе абортуса целесообразно проведение хромосомного микроматричного анализа с целью определения микроделеций и микродупликаций. К ограничениям анализа относится невозможность выявления мозаицизма, полиплоидии, сбалансированных транслокаций, а также микроделеций и микродупликаций за границами разрешающей способности метода.
Пациентам с проблемами репродуктивного характера может быть рекомендована генетиче-
ская диагностика половых клеток - ооцитов и сперматозоидов. Если носителем хромосомной аномалии (сбалансированной или несбалансированной, например, мозаичной формы синдром Тернера), является женщина, то возможно выполнение биопсии полярных телец с их последующим генетическим тестированием. Такая процедура представляет собой один из вариантов предимплантационной генетической диагностики. В цитогенетической лаборатории полярные тельца тестируют с помощью флуоресцентной гибридизации in situ либо на наличие анеупло-идий по хромосомам (Х, Y, 18, 13, 21, 22, 16 и др.), либо на наличие структурной перестройки, которая ранее была обнаружена в кариотипе матери. Выполнение исследования способствует повышению вероятности наступления беременности в цикле ЭКО; уменьшению числа выкидышей; снижению риска потери беременности при других вариантах выполнения пренатальной диагностики - инвазивных методах (амниоцен-тез, хориоцентез), проводимых на более поздних сроках беременности. Надежность диагностического метода составляет более 90%.
Диагностика генетических нарушений сперматозоидов. Известно, что генетические факторы обусловливают, по крайней мере, 30-50% всех случаев тяжелых форм бесплодия у мужчин. Среди этих факторов выделяют основные три: изменения генетического аппарата на уровне хромосом - хромосомные аномалии (ХА), на уровне гена или группы генов (мутации), на уровне изменений тотальной ДНК (дисперсия хроматина и фрагментация ДНК). Вот почему, кроме стандартных морфологических, биохимических тестов, при мужском бесплодии рекомендовано применять молекулярно-цитогене-тические и молекулярно-генетические методы, которые позволяют оценить состояние генетического аппарата соматических и половых клеток у мужчин.
Метод FISH широко используют для исследования интерфазных ядер половых клеток (сперматозоидов) на предмет обнаружения многочисленных ХА (анеуплоидий). ХА в ядрах сперматозоидов могут встречаться у мужчин как с нормальным кариотипом, так и с измененным, однако с разной частотой. Доказано, что в последней группе их частота выше. Присутствие в кариотипе пациента числовой хромосомной аберрации или несбалансированной перестройки (дупликации), как правило, меняет дозовое соотношение генов, поэтому такие изменения повлекут за собой существенные отклонения в фенотипе (клиническая картина). Напротив, наличие в кариотипе аберраций типа сбалансированных перестроек - транслокаций (робертсо-
новские и реципрокные), инверсий, некоторых маркерных хромосом, не несущих структурных генов, зачастую не приводят к потере или добавлению генетического материала. Их носители, как правило, фенотипически здоровы, но имеют риск рождения ребенка с хромосомной патологией. По данным литературы, если популяцион-ная частота, например, таких сбалансированных транслокаций не превышает 0,1%, то их частота в группах мужчин и женщин с репродуктивными проблемами достигает 3,0-6,2% и 0,7-9,8% соответственно.
В последние годы широкую популярность приобрела гипотеза о том, что снижение репродуктивной функции иногда связано с патологическим состоянием общей ДНК сперматозоидов (фрагментированость - наличие одноцепочечных и двоцепочечных разрывов ДНК, неправильная упаковка хроматина и др.). В руководстве European Association of Urology по диагностике и лечению мужского бесплодия указано, что фрагментация ДНК сперматозоидов снижает шансы на зачатие естественным путем и повышает риск невынашивания беременности. В настоящее время патофизиологические механизмы, приводящие к фрагментации ДНК, еще не изучены. Предполагают, что причиной могут быть дефекты созревания хроматина сперматозоидов во время ремоделирования ядер в спер-матидах, сперматозоиды с апоптотическими признаками в эякуляте и окислительный стресс, когда продуцируемые активные формы кислорода подавляют антиоксидантную защиту.
Доказано, что не всегда дефектный сперматозоид внешне выглядит патологическим, а это особенно важно при проведении процедуры ICSI, поскольку сперматозоиды, которые подбирают для цикла на основе нормальной морфологии, могут иметь повреждение на уровне молекулы ДНК. Предположительно сперматозоид с фрагментированной ДНК может оказывать отрицательное влияние на ранние этапы эмбрионального развития, особенно на формирование бластоцисты, что приводит к замиранию беременности. Таким образом, анализ фрагментации ДНК сперматозоидов может служить эффективным прогностическим инструментом, выявляющим мужской фактор нарушения фертильности. В норме содержание сперматозоидов, несущих фрагментированную ДНК, не должно превышать, по данным разных авторов, 20-30%.
Наиболее часто применяемыми тестами для определения фрагментации ДНК являются Comet, TUNEL и анализ дисперсии хроматина (Halo). Метод Comet основан на принципе электрофореза, в результате которого фрагменты ДНК движутся от её основной массы в виде
«хвоста кометы». Метод TUNEL основан на флуоресцентной маркировке свободных концов нуклеоидных последовательностей, благодаря которой удаётся фиксировать количество одно-цепочечных и двуцепочечных разрывов ДНК. Метод Halo, в отличие от других, выявляет не повреждённую, а цельную ДНК, вокруг которой образуется «ореол» из двуцепочечных петель после удаления протаминов.
Подходы к преодолению повышенной фрагментации в сперматозоидах человека начинают только разрабатываться, поэтому, ввиду неблагоприятного влияния высокого уровня фрагментации ДНК сперматозоидов на вынашивание беременности и частоту выкидышей, необходимо своевременное определение индекса фрагментации ДНК сперматозоидов и его коррекция такими методами, как изменение образа жизни, медикаментозная терапия и, в особых случаях, применение тестикулярных сперматозоидов в лечебных циклах ВРТ (ЭКО + ICSI).
Пренатальная диагностика - комплекс мероприятий, направленных на выявление врожденной и наследственной патологии у плода. Её разделяют на неинвазивную и инвазивную. Пре-натальная неинвазивная диагностика призвана формировать группы высокого риска по возможности возникновения хромосомной (генной) патологии у потомства, в том числе у пациентов с репродуктивными проблемами. Основная задача такой диагностики - проведение в наиболее ранние сроки скринингов для беременных: в сроке 11-14 недель проводится ультразвуковой и биохимический скрининг с расчетом индивидуального комбинированного риска по хромосомным аберрациям с помощью специальных компьютерных программ. Группе высокого риска проводится инвазивная пренатальная диагностика, с целью кариотипирования плода. К неинвазив-ным пренатальным исследованиям в настоящее время следует отнести и неинвазивное прена-тальное тестирование (НИПТ), которое позволяет при взятии образца крови матери, начиная уже с 10 недели беременности, провести генетическое тестирование ДНК. НИПТ основано на анализе внеклеточной ДНК (вкДНК) в материнской крови. Фетальный компонент вкДНК составляет примерно 10-20% от общего количества внеклеточной ДНК. Источником феталь-ного компонента в ДНК является плацента, но она представляет весь генотип плода и быстро выводится из кровотока матери во время родов, что делает ее специфичной для беременности. Благодаря развитию генетических технологий стало возможным проводить высокоточный подсчет одиночных молекул и, таким образом, обнаруживать небольшие изменения в количестве
последовательностей на интересующем хромосоме в крови [12].
Неинвазивное пренатальное тестирование получило широкую валидацию, включая сравнение со стандартным пренатальным скринингом на анеуплоидию. Согласно современным представлениям - это высокоточный скрининговый тест с чувствительностью до 99% и специфичностью 99,5%, который можно использовать для определения риска самой распространенной хромосомной анеуплоидий - трисомии 21 хромосомы. По другим трисомиям чувствительность значительно ниже. Данный метод не лишен недостатков. В первую очередь это высокая стоимость анализа. Помимо этого, поскольку неинвазивное пренатальное тестирование исследует всю вкДНК в материнской крови (фе-тальный и материнский компоненты), результаты, которые не соответствуют кариотипу плода, могут быть получены в результате обнаружения материнских хромосомных перестроек или мозаицизма, в том числе плацентарного, и др. [13]. Так же, могут иметь место ложноотрица-тельные результаты: из-за низкого уровня фе-тальной вкДНК или технических лабораторных сложностей. Таким образом, НИПТ не является итоговым диагностическим методом и требует подтверждения положительного результата ин-вазивным исследованием.
При этом следует отметить, что НИПТ обладает гораздо большей чувствительностью, чем традиционные методы скрининга, для трисомии 21 и значительно снижает потребность в инва-зивном тестировании [14]. Так, исследование почти 16000 несостоявшихся беременностей подтвердило более высокие показатели выявления синдрома Дауна с использованием НИПТ по сравнению с традиционным комбинированным скринингом в первом триместре с ложнополо-жительным уровнем 0,06% по сравнению с 5,4% и положительной прогностической ценностью 80,9% по сравнению с 3,4% соответственно [14]. В настоящее время в разных странах проводятся когортные исследования, направленные на оценку эффективности и экономическое обоснование включения НИПТ в схему скрининговой программы 1 триместра беременности. Основными рекомендованными показаниями для проведения неинвазивного пренатального тестирования является повышенный риск хромосомной патологии по результатам комбинированного скрининга (средние скрининг-риски 1/100-1/300); невозможность проведения инвазивной ПД, в связи с наличием противопоказаний; угроза прерывания беременности в ранние сроки; желание беременной женщины. При этом существуют и некоторые ограничения, в виде многоплодной
беременности, редукции одного эмбриона по результатам УЗИ-обследования, применения донорских ооцитов или программ с вовлечением суррогатной матери и др.
В случае положительного результата НИПТ для принятия решения о пролонгировании или прерывании беременности рекомендована инва-зивная пренатальная диагностика. Биопсия ворсин хориона - один из наиболее оптимальных методов инвазивной пренатальной диагностики, проводится в период 9-12 недель беременности, риск самопроизвольного аборта при биопсии хориона составляет 1% [15]. Процедура включает аспирацию плацентарной ткани под ультразвуковым контролем и может выполняться с использованием чрескожного трансабдоминального, трансвагинального или трансцервикального доступа. В настоящее время в РФ подавляющем большинстве используется трансабдоминальный доступ.
Среди методов инвазивной пренатальной диагностики также используется амниоцен-тез - забор амниотической жидкости. В отличие от биопсии ворсин хориона метод является культуральным, так называемым «золотым стандартом» цитогенетики, т.к. позволяет исключить возможный плацентарный мозаицизм. Оптимальным сроком для проведения данного исследования является 16-20 недель. Риск самопроизвольного выкидыша - 1% (рис 2, 3).
Рис.2. Транслокационная форма синдрома Патау в биоптате ворсин хориона. 46, хх^г(13;14) ^10^10)+13.
Еще одним методом инвазивной пренаталь-ной диагностики является кордоцентез - пункция пуповины плода. Оптимальный срок выполнения кордоцентеза - 20-22 недель, риск самопроизвольного аборта - до 3%. Исследование лимфоцитов крови плода при кордоцен-
Рис.3. Синдром Дауна в биоптате ворсин плаценты. 47, ХХ,+21.
тезе позволяет выявить генные и хромосомные болезни.
Ранее множественные врожденные пороки развития, врожденные пороки развития соче-танные с хромосомными аномалиями, ультразвуковые маркеры хромосомных болезней у плода или положительные результаты НИПТ, сбалансированная хромосомная перестройка у кого-либо из родителей, высокий риск рождения ребенка с синдромом Дауна по результатам комбинированного индивидуального риска (1:100 и выше) являлись абсолютными показаниями для проведения инвазивной пренатальной диагностики с целью исключения хромосомных болезней плода, но после внедрения системы раннего пренатального скрининга они значительно изменились.
Предимплантационную генетическую диагностику можно рассматривать как один из методов пренатальной инвазивной диагностики. Проведение ПГД стало возможным благодаря появлению метода FISH. Такое генетическое тестирование эмбриона проводят еще до переноса его в полость матки и наступления беременности. Впервые ПГД провели в 1988 г. в Лондоне (Великобритания). С тех пор в рамках программы ЭКО процедура ПГД применяется все чаще, поскольку позволяет повысить шансы на наступление беременности, особенно в позднем репродуктивном периоде, а также позволяет свести к минимуму риски появления потомства с генетическими аномалиями. Взятие материала эмбриона для анализа (биопсия) может проводиться на разных сроках развития эмбриона. Одним из вариантов является биопсия полярных телец ооцита, о которой мы писали выше. Метод технически сложен и имеет существенные ограничения, так как дает косвенную информацию только о яйцеклетке, а не об эмбрионе. Применяется в основном в странах, где действуют ограничения на манипуляции с эмбрионами.
Биопсия бластомера - выполняется на 3-й день развития эмбриона, когда эмбрион состоит из 6-10 клеток. Ограничением такого метода считается высокий уровень мозаицизма эмбрионов (до 55-73% по оценкам разных авторов), то есть хотя бы одна клетка эмбриона может иметь отличное от других количество хромосом. Биопсия трофэктодермы бластоцисты - набирает все большую популярность в репродуктивной медицине - проводится на 5-6 день развития. Для анализа забирают несколько клеток наружной части бластоцисты, которая не вовлечена в последующее формирование эмбриона и дает начало плаценте. Такой метод биопсии технически сложен, но имеет преимущества: большее количество материала для анализа и гораздо более низкий уровень мозаицизма эмбрионов на этой стадии развития. Общей характеристикой всех этапов биопсии является ограниченное количество образцов, доступных для генетического анализа, - зачастую это одна клетка. Именно этот аспект ПГД наиболее технически сложный, потенциально он может усугубляться неоптимальным качеством биопсии эмбриона и/ или эмбриональных клеток.
После взятия материала проводят FISH-диагностику на заинтересованные, согласно анамнезу супружеской пары, хромосомы или диагностику ДНК одной клетки с помощью модификаций полимеразной цепной реакции. Хотя FISH-метод обеспечивает точный скрининг определенного числа хромосом, метод ограничен тем, что менее половины хромосом может быть оценено в каждой биопсированной клетке. Установлено, что применение FISH-диагностики не позволяет обнаружить до 20% эмбрионов с аномалиями [16]. Благодаря ПЦР-методу возможно провести диагностику таких заболеваний как муковисцидоз, гемофилия, выявить хромосомные нарушения, определить антигены HLA и резус-фактор [17]. Протоколы ПЦР должны соответствовать определенным условиям: результаты должны быть получены в максимально сжатые сроки, быть надежными, чувствительными и, прежде всего, абсолютно точными, чтобы исключить ошибочный диагноз. Еще одним методом оценки биоптатов является метод сравнительной геномной гибридизации на микроматрицах (CGH), который позволяет проводить исследование всех хромосом [16; 18]. Однако, самым инновационным методом диагностики считается сегодня метод NGS - высокопроизводительное секвенирование.
Предимплантационная генетическая диагностика позволяет значительно повысить эффективность лечения методами ВРТ пациентов, страдающих бесплодием, а также предотвратить
рождение ребенка с наследственным заболеванием [19]. Выявление генетического заболевания у плода методами инвазивной пренатальной диагностики предполагает необходимость прерывания беременности; предимплантационная диагностика преследует цель наступления беременности изначально здоровым плодом. Практика показала, что успех программы ВРТ с ПГД с применением NGS наступает в 70% случаев [19]. Секвенирование следующего поколения приобрело популярность благодаря его способности выявлять несбалансированные транслокации, сегментарные анеуплоидии, некоторые триплоидии и более низкие уровни мозаицизма более эффективно, чем другие методы [20]. Этот аспект имеет важное клиническое значение, поскольку у мозаичных эмбрионов, по-видимому, нарушена жизнеспособность и снижена вероятность рождения живого ребенка. В связи с этим, исходы беременности с выполнением NGS улучшаются за счет исключения таких эмбрионов из протоколов ВРТ.
При проведении предимплантационной генетической диагностики полученные бластоцисты замораживают, а затем переносят в криопрото-коле в матку. Безопасность методов ПГД для эмбрионов доказана: установлено, что биопсия эмбриона не повышает вероятности пороков развития человека, родившегося из этого эмбриона. Однако необходимо учитывать, что в ходе диагностики на эмбрион оказывается дополнительное воздействие, которое несколько снижает вероятность наступления беременности по сравнению с таким же показателем в классической программе ЭКО. Процедура ПГД прежде всего рекомендована при носительстве моногенных генетических заболеваний, хромосомных нарушениях (хромосомные перестройки, в том числе транслокации, анеуплоидии); старшем репродуктивном возрасте у женщин; невынашивании беременности; повторных неудачных попытках ЭКО; тяжелом мужском факторе бесплодия; необходимости определения резус-фактора или HLA-типирования эмбриона.
Генетическое консультирование. В настоящее время необходимости генетического обследования пациентов с нарушением репродуктивной функции уделяется все большее внимание. Неотъемлемой частью этого процесса является генетическое консультирование семьи, направленное на оценку генетического риска и пути профилактики рождения ребенка с врожденной и наследственной патологией в каждой конкретной семье. Врач-генетик собирает клинико-ге-неалогический и акушерский анамнез, проводит объективный осмотр пациентов, оценивает результаты лабораторных исследований, определя-
ет объем необходимого обследования, оценивает генетические риски и рекомендует дальнейшую тактику снижения генетического и акушерского рисков.
В ряде случаев в связи с высокими генетическими рисками для потомства (наличие моногенного наследственного заболевания в семье, наличие структурных хромосомных перестроек у одного из супругов, наличие невынашивания в семье неуточненного генеза) семье рекомендуется проведение вспомогательных репродуктивных технологий.
При высоких рисках по хромосомным патологиям рекомендуется проведение ЭКО с предимплантационной диагностикой на хромосомные патологии. При наличии в семье наследственной моногенной патологии проводится поиск мутаций в опеределенном гене вызывающей развитие данного заболевания, а в случае Х-сцепленной рецессивной патологии - определение пола плода. Для исключения микроделеций и микродупликаций используется хромосомный микроматричный анализ эмбрионов. Наиболее точным исследованием, позволяющим определить максимальное количество изменений у плода, является метод NGS. В случае мужского фактора бесплодия супруга и при нормальном кариотипе назначается моле-кулярно-генетическое исследование, позволяющее определить микроделеции У-хромосомы, носительство гена муковисцидоза и количество АR-повторов (андрогенного рецептора). Моле-кулярно-генетическое исследование назначается и женщинам с бесплодием и невынашиванием для определения мутаций в генах, отвечающих за репродуктивную функцию.
В редких случаях, супружеской паре рекомендуется ЭКО спермой донора либо ЭКО с донорской яйцеклеткой. Такое решение является оправданным в случае наличия 5 и более совпадений аллелей в трех локусах генов соединительной ткани HLA-II класса, при носительстве робертсоновской транслокации 21 хромосомы, наличие у одного из супругов моногенного заболевания или носительство у супругов ауто-сомно-рецисивного заболевания при невозможности проведения предимплантационной диагностики.
Следовательно, необходимо, чтобы врач-генетик, консультирующий по вопросам нарушения репродуктивной функции, владел знаниями или тесно сотрудничал с врачами других специальностей: эндокринологами, ре-продуктологами, андрологами, гинекологами, цитогенетиками и т.д. Однако врач-генетик решает специфический круг вопросов, которыми не занимаются врачи другого профиля, - это
определение риска передачи генетического нарушения по наследству, методы профилактики наследственной патологии, информирование о необходимости обследования для других членов семьи. Поэтому коллегиальное медико-генетическое консультирование имеет большое значение для принятия оптимальных решений.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Подходы к преодолению генетических аномалий начинают только разрабатываться, но благодаря развитию медико-генетических технологий стало возможным обнаруживать минимальные изменения в хромосомах как уже развивающегося плода, так и половых клеток родителей. Таким образом, на данный момент, для уменьшения частоты возникновения отклонений, необходимо своевременное выявление генетических нарушений, что даёт возможность их коррекции посредством изменения образа жизни, медикаментозной терапии и т.д. Дальнейшее развитие исследований в данной области позволит в перспективе открывать новые варианты лечения различных заболеваний, основывающиеся на технологиях геномного редактирования, для улучшения здоровья человека.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке в рамках государственного задания № FZEG-2020-0060 Минобрнауки России в сфере научной деятельности темы «Алгоритмы молекулярно-генетической диагностики злокачественных новообразований и подходы к их таргетной терапии с применением клеточных и генетических технологий».
Funding. This work was financially supported by state task No FZEG-2020-0060 of the Russian Ministry of Science in the field of scientific research on the topic «Algorithms for molecular-genetic diagnosis of malignant neoplasms and approaches to their targeted therapy using cellular and genetic technologies.»
ЛИТЕРАТУРА
1. Venter J. C., Adams M. D, Myers E. W. The sequence of the human genome. Science. 2001;291(5507):1304-1351. doi:10.1126/ science.1058040.
2. Lander E. S, Linton L. M, Birren B. International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 2001;409(6822):860-921. doi:10.1038/35057062.
3. Vrijenhoek T., Kraaijeveld K., Elferink M. Next-generation sequencing-based genome diagnostics across clinical genetics centers: implementation choices and their effects European Journal of Human Genetics. 2015;23:1142-1150. doi:10.1038/ejhg.2014.279.
4. Калякин М. В., Серегин А. П., Солов-ченко А. Е., Каменский П. А., Садовничий В. А. Проект «Ноев ковчег»: промежуточные итоги и перспективы развития классических коллекций. Acta Naturae. 2018;4(39):49-58.
5. Zhernakova D. V., Brukhin V., Malov S. Genome-wide sequence analyses of ethnic populations across Russia. Genomics. 2020;1:442-458. doi: 10.1016/j.ygeno.2019.03.007.
6. Hussein N., Weng S.F., Kai J., Qureshi N. Preconception risk assessment for thalassaemia, sickle cell disease, cystic fibrosis and Tay-Sachs disease. Cochrane Database Syst Rev. 2015;8:1-29. doi:10.1002/14651858.
7. Demain L. A. M., Conway G. S., Newman W. G. Genetics of mitochondrial dysfunction and infertility. Clin Genet. 2017;91:199-207. doi:10.1111/ cge.12896.
8. Cariati F., D'Argenio, V., Tomaiuolo R. The evolving role of genetic tests in reproductive medicine. J Transl Med. 2019;17:267. doi:10.1186/ s12967-019-2019-8.
9. Mastantuoni E., Saccone G., Al-Kouatly H. B., Paternoster M., D'Alessandro P., Arduino B. Expanded carrier screening: a current perspective. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2018;230:41-54. doi:10.1016/j.ejogrb.2018.09.014.
10. Баранов В. С., Кузнецова Т. В. Цитогене-тика эмбрионального развития человека: монография. СПб.: Изд-во «Н-Л»;2007.
11. Zhang T., Sun Y., Chen Z., Li T. Traditional and molecular chromosomal abnormality analysis of products of conception in spontaneous and recurrent miscarriage. BJOG: An International Journal of Obstetrics and Gynaecology, 2018;125(4):414-420. doi:10.1111/1471-0528.15052.
12. Rafi I., Hill M., Hayward J., Chitty L. S. Non-invasive prenatal testing: use of cell-free fetal DNA in Down syndrome screening. Br J Gen Pract. 2017;67(660):298-299. doi:10.3399/ bjgp17X691625.
13. Nicolaides K. H. Screening for fetal aneuploidies at 11 to 13 weeks. Prenat Diagn. 2011;31(1):7-15. doi: 10.1002/pd .2637.
14. Norton M. E., Jacobsson B., Swamy G. K., Laurent L. C., Ranzini A. C., Brar H., Tomlinson M. W., Pereira L., Spitz J. L., Hollemon D., Cuckle H., Musci T. J., Wapner R. J. Cell-free DNA analysis for noninvasive examination of trisomy. N Engl J Med. 2015; 372(17):1589-97. doi:10.1056/ NEJMoa1407349.
15. Alfirevic Z., Navaratnam K., Mujezinovic F. Amniocentesis and chorionic villus sampling for prenatal diagnosis. Cochrane Database Syst Rev. 2017;9(9). article CD003252. doi:10.1002/14651858.pub2.
16. Schoolcraft W. B., Fragouli E., Stevens J., Munne S., Katz-Jaffe M. G., Wells D. Clinical application of comprehensive chromosomal screening at the blastocyst stage. Fertil Steril. 2010;94(5):1700-6. doi:10.1016/j. fertnstert.2009.10.015.
17. Dreesen J., Destouni A., Kourlaba G. Evaluation of PCR-based preimplantation genetic diagnosis applied to monogenic diseases: a collaborative ESHRE PGD consortium study. Eur J Hum Genet. 2014;22(8):1012-1018. doi:10.1038/ ejhg.2013.277.
18. Capalbo A., Wright G., Elliott T., Ubaldi F. M., Rienzi L., Nagy Z. P. FISH reanalysis of inner cell mass and trophectoderm samples of previously array-CGH screened blastocysts shows high accuracy of diagnosis and no major diag- nostic impact of mosaicism at the blastocyst stage. Hum Reprod. 2013;28:2298-307. doi:10.1093/humrep/ det245.
19. Friedenthal J., Maxwell S. M., Munné S., Kramer Y., McCulloh D. H., McCaffrey C., Grifo J.
A. Next generation sequencing for preimplantation genetic screening improves pregnancy outcomes compared with array comparative genomic hybridization in single thawed euploid embryo transfer cycles. Fertil Steril. 2018;109(4):627-632. doi: 10.1016/j.fertnstert.2017.12.017.
20. Munne S., Wells D. Detection of mosaicism at blastocyst stage with the use of high-resolution next-generation sequencing. Fertil Steril. 2017;107:1085-91. doi:10.1016/j. fertnstert.2017.03.024.
REFERENCES
1. Venter J. C, Adams M. D, Myers E. W. The sequence of the human genome. Science. 2001;291(55 07):13 04-1351. doi:10.1126/ science.1058040.
2. Lander E. S, Linton L. M, Birren
B. International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 2001;409(6822):860-921. doi:10.1038/35057062.
3. Vrijenhoek T., Kraaijeveld K., Elferink M. Next-generation sequencing-based genome diagnostics across clinical genetics centers: implementation choices and their effects European Journal of Human Genetics. 2015;23:1142-1150. doi:10.1038/ejhg.2014.279.
4. Kaljakin M. V., Seregin A. P., Solovchenko A. E., Kamenskij P. A., Sadovnichij V. A. Proekt
«Noev kovcheg»: promezhutochnye itogi i perspektivy razvitija klassicheskih kollekcij. Acta Naturae. 2018;4(39):49-58.
5. Zhernakova D. V., Brukhin V., Malov S. Genome-wide sequence analyses of ethnic populations across Russia. Genomics. 2020;1:442-458. doi.org/10.1016/j.ygeno.2019.03.007.
6. Hussein N., Weng S. F., Kai J., Qureshi N. Preconception risk assessment for thalassaemia, sickle cell disease, cystic fibrosis and Tay-Sachs disease. Cochrane Database Syst Rev. 2015;8:1-29. doi:10.1002/14651858.
7. Demain L. A. M., Conway G. S., Newman W. G. Genetics of mitochondrial dysfunction and infertility. Clin Genet. 2017;91:199-207. doi:10.1111/cge.12896.
8. Cariati, F., D'Argenio, V., Tomaiuolo R. The evolving role of genetic tests in reproductive medicine. J Transl Med. 2019;17:267. doi:10.1186/ s12967-019-2019-8.
9. Mastantuoni E., Saccone G., Al-Kouatly H.B., Paternoster M., D'Alessandro P., Arduino B. Expanded carrier screening: a current perspective. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2018;230:41-54. doi:10.1016/j.ejogrb.2018.09.014.
10. Baranov V. S., Kuznecova T. V. Citogenetika jembrional'nogo razvitija cheloveka: monografija. SPb.: Izd-vo «N-L»; 2007.
11. Zhang T., Sun Y., Chen Z., Li T. Traditional and molecular chromosomal abnormality analysis of products of conception in spontaneous and recurrent miscarriage. BJOG: An International Journal of Obstetrics and Gynaecology, 2018;125(4):414-420. doi:10.1111/1471-0528.15052.
12. Rafi I., Hill M., Hayward J., Chitty L. S. Non-invasive prenatal testing: use of cell-free fetal DNA in Down syndrome screening. Br J Gen Pract. 2017;67(660):298-299. doi:10.3399/ bjgp17X691625.
13. Nicolaides K. H. Screening for fetal aneuploidies at 11 to 13 weeks. Prenat Diagn. 2011;31(1):7-15. doi:10.1002/pd .2637.
14. Norton M. E., Jacobsson B., Swamy G. K., Laurent L. C., Ranzini A. C., Brar H., Tomlinson M. W., Pereira L., Spitz J. L., Hollemon D., Cuckle H., Musci T. J., Wapner R. J. Cell-free DNA analysis for noninvasive examination of trisomy. N Engl J Med. 2015; 372(17):1589-97. doi:10.1056/ NEJMoa1407349.
15. Alfirevic Z., Navaratnam K., Mujezinovic F. Amniocentesis and chorionic villus sampling for prenatal diagnosis. Cochrane Database Syst Rev. 2017;9(9). article CD003252. doi:10.1002/14651858.pub2.
16. Schoolcraft W. B., Fragouli E., Stevens J., Munne S., Katz-Jaffe M. G., Wells D. Clinical application of comprehensive
chromosomal screening at the blastocyst stage. Fertil Steril. 2010;94(5):1700-6. doi:10.1016/j. fertnstert.2009.10.015.
17. Dreesen J., Destouni A., Kourlaba G., et al. Evaluation of PCR-based preimplantation genetic diagnosis applied to monogenic diseases: a collaborative ESHRE PGD consortium study. Eur J Hum Genet. 2014;22(8):1012-1018. doi:10.1038/ ejhg.2013.277.
18. Capalbo A., Wright G., Elliott T., Ubaldi F. M., Rienzi L., Nagy Z. P. FISH reanalysis of inner cell mass and trophectoderm samples of previously array-CGH screened blastocysts shows high accuracy of diagnosis and no major diag- nostic impact of mosaicism at the blastocyst stage. Hum
Reprod. 2013;28:2298-307. doi:10.1093/humrep/ det245.
19. Friedenthal J., Maxwell S. M., Munne S., Kramer Y., McCulloh D. H., McCaffrey C., Grifo J. A. Next generation sequencing for preimplantation genetic screening improves pregnancy outcomes compared with array comparative genomic hybridization in single thawed euploid embryo transfer cycles. Fertil Steril. 2018;109(4):627-632. doi.org/10.1016/j.fertnstert.2017.12.017.
20. Munne S., Wells D. Detection of mosaicism at blastocyst stage with the use of high-resolution next-generation sequencing. Fertil Steril. 2017;107:1085-91. doi:10.1016/j. fertnstert.2017.03.024.
