CC BY
6
микроокружения. C помощью интравитальной микроскопии показана миграция флюоресцентно-меченных TIL и опухоль-ассоциированных МСК в очаг солидной опухоли. Полученные результаты могут лечь в основу новых технологий адоптивной иммунотерапии солидных опухолей, преодоления иммуносупрессивного микроокружения и дальнейших модификаций иммунных клеток, усиливающих их противоопухолевую активность. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда № 21-74-20110 и № 22-64-00057.
НАРУШЕНИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИЦ И ИХ МИКРООКРУЖЕНИЯ КАК ОСНОВА ПАТОЛОГИИ
Б.Г. Юшков
Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург, Россия ГАУЗ СО Институт медицинских клеточных технологий, Екатеринбург, Россия
e-mail: b.yushkov@iip.uran.ru
Ключевые слова: стволовые клетки, микроокружение, патология.
В последние годы все больше внимания привлекает проблема взаимоотношения клеток-предшественниц с их микроокружением. Считается, что активность стволовых клеток подлежит неклеточно-автономной регуляции из локального микроокружения или «ниши». Вместе с тем, не только микроокружение влияет на пролиферацию и дифференцировку клеток, но и последние могут оказывать влияние на формирование нужного им микроокружения.
Физиологически ниша состоит из различных тканевых компонентов, клеточных популяций (фибробласты, макрофаги, тучные клетки, Т-лимфоциты) и растворимых факторов, которые жестко регулируют поведение стволовых клеток.
Исследования при экстремальных состояниях свидетельствуют об изменении в экстрацеллюлярном матрик-се соотношения между гликопротеидами и кислыми ГАГ. Последние выступают в качестве факторов, блокирующих или запускающих механизмы митоза. При иммоби-лизационном стрессе в экстрацеллюлярном матриксе костного мозга снижается концентрация глюкозы, что предотвращает репликативное старение, усиливает ми-тохондриальное дыхание в мезенхимальных стволовых клетках человека. Кроме того, снижаются концентрации ЛДГ, щелочной и кислой фофатаз и возрастают концентрации холестерина, триглицеридов и фосфора, изменяется характер образуемых таким матриксом кристаллов. При воспалении в межклеточной среде костного мозга повышается концентрация витаминов В1, В2, В12, РР, С и падает В6.
В результате перестройки микроокружения может исчезнуть «ниша» резидентной стволовой клетки, что дает основание ввести термин «мигрирующая ниша», который хорошо объясняет феномен «клональной сукцессии». Некоторые авторы считают предпочтительным использование термина «непрерывное высвобождение стволовых клеток для дифференцировки».
Патология взаимодействия может быть результатом поражения самих стволовых клеток или дефекта микроокружения. При этом нормальные ССК животных с врожденным дефектом микроокружения могут
компенсировать дефект ССК, что показано на примере кроветворной ткани, сперматогенеза, развития молочной железы.
Признание нарушений микроокружения в патогенезе заболеваний требует разработки методов целенаправленной их коррекции путем модулирования микроокружения. В качестве примера можно привести направленную на фибробласты терапию при раке молочной железы, предлагаемую Ashleigh Unsworth et al.
ДВУХВЕКТОРНАЯ СИСТЕМА НА ОСНОВЕ АДЕНОАССОЦИИРОВАННОГО ВИРУСА ДЛЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ ДИСФЕРЛИНОПАТИИ
И.А. Яковлев1, 2, А.М. Емелин3, И.С. Лимаев3, О.Н. Чернова3, М.О. Мавликеев3, В.О. Солдатов4, А.В. Дейкин4, М.В. Корокин4, М.В. Покровский4, А.А. Ризванов5, Р.В. Деев1, 3, А.А. Исаев1
1 ПАО «Институт Стволовых Клеток Человека», Москва, Россия
2 ООО «Генотаргет», Москва, Россия
3 ФГБОУ ВО Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия
4 НИУ Белгородский государственный университет, Белгород, Россия
5 ФГАОУ ВО Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
e-mail: ivan@ivan-ya.ru
Ключевые слова: адено-ассоциированный вирус, миоди-строфия, дисферлинопатия, генная терапия, регенерация мышечной ткани.
Дисферлинопатия — орфанное фенотипически гетерогенное заболевание, вызываемое патогенными вариантами в гене DYSF, и нарушении синтеза трансмембранного белка дисферлина, одной из главных функций которого является участие в репарации дефектов клеточных мембран мышечных волокон (МВ). Неуклонное развитие дисферлинопатии приводит к тяжелой инвалидности в трудоспособном возрасте. На сегодняшний день не существует одобренных методов этиопатогенетиче-ского лечения дисферлинопатии.
Для реализации генотерапевтического подхода к лечению дисферлинопатии был использован аденоассо-циированный вирус (ААВ) 9 серотипа. Для доставки кодон-оптимизированного гена дисферлина, размер которого превышает лимит ёмкости ААВ, была использована двухвекторная система, в которой 2 вируса несли
2 части кДНК дисферлина (AAV9.DYSF). Эксперимент проводился на трансгенных мышах B6.A-Dysfprmd/GeneJ Bla/J. В 1 группе 12 самцам линии Bla/J была выполнена внутривенная инъекция вируса, забор биоматериала на 3, 6 и 12 недель. Во 2 группе выполнялось внутримышечное введение (в 3 дозировках) и внутривенное введение (в 1 дозировке), забор биоматериала через
3 недели. Для оценки влияния трансгенного дисфер-лина на состояние мышечной ткани были выполнены: ПЦР-РВ для количественной оценки копий ДНК и РНК, иммунофлюоресцентные реакции с диагностическими антителами, окраска гематоксилином и эозином для оценки морфометрических показателей. Во всех группах определен продукт иммунофлюоресцентной реакции, свидетельствуя о выработке дисферлина как минимум до 12 недели. В группе 2 количество дисферлин-позитив-ных МВ зависело от количества введенного ААВ. Таким
образом, AAV9.DYSF обеспечивает продукцию дисфер-лина de novo, характеризующегося мембранным и цито-плазматическим расположением в инфицированных МВ, что соответствует локализации этого белка в МВ здоровых мышей. Результаты морфометрического исследования в группе 1 показали, что введение AAV9.DYSF проявляется статистически значимым уменьшением доли некротизированных МВ и повышением регенераторной функции скелетных мышц (увеличением доли ЦЯМВ, снижением средней площади поперечного сечения).
AAV9.DYSF может рассматриваться как кандидат в препараты для лечения дисферлинопатии. Проводятся расширенные исследования для оценки влияния AAV9. DYSF на физиологические показатели, оценки биобезопасности препарата. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ, Соглашение № 075-15-2021-1346.
СКАНИРУЮЩАЯ ЗОНДОВАЯ МИКРОСКОПИЯ В РЕШЕНИИ ЗАДАЧ РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ
И.В. Яминский1' 2
1 Физический и химический факультеты МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Центр перспективных технологий, Москва, Россия
e-mail: YaminskY@nanoscopy.ru
Ключевые слова: атомно-силовая микроскопия, сканирующая капиллярная микроскопия, опухолевые клетки, клетки крови, нейроны, 3D визуализация.
Методы сканирующей зондовой микроскопии — атом-но-силовая микроскопия и сканирующая капиллярная микроскопия — превратились в информативный инструмент, позволяющий получать трехмерные изображения клеток и клеточных структур с точностью до единиц нанометра и измерять локальные механические, физико-химические и электрофизиологические свойства клеток [1,2].
На примере наблюдений клеток крови, нейронов, эпителиальных клеток, опухолевых клеток продемонстрированы возможности атомно-силовой и капиллярной микроскопии при детальном исследовании морфологии и локальных свойств образцов. Показано, что сканирующая капиллярная микроскопия позволяет с помощью химически модифицированного капилляра реализовать биохимический наносенсор на активные формы кислорода и провести измерения их концентрации как вблизи мембраны клетки, так и внутри её. Рассмотрены возможные решения биосенсора на различные мишени при анализе единичных живых клеток. Представлен краткий обзор по использованию сканирующей капиллярной микроскопии для 3D печати биологическими молекулами.
Детально рассмотрены новые режимы сканирующей зондовой микроскопии, позволяющие максимально уменьшить воздействие на клетку при измерениях, как на воздухе, так и в жидкости. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ и Лондонского Королевского Общества (проект № 21-58-10005), Фонда содействия инноваций (проект № 71108).
Литература:
1. Akhmetova A.I., Gukasov V.M., Rybakov Y.L., Yaminsky I.V. BioMedical Engineering. 2021. N 54(6). P. 434.
2. Яминский И.В. Наноиндустрия. 2021. Т. 14. № 2. С. 136.
НАРУШЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ПРИ АПЛАЗИИ МАТКИ И ПОИСК ПУТЕЙ ИХ КОРРЕКЦИИ МЕТОДАМИ РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ
Н.К. Ярыгина1' 3, В.В. Бурунова1, А.М. Гисина1, К.К. Сухинич1' 2, З.Н. Макиян3
1 ФГБНУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, Москва, Россия
2 ФГБУН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, Россия
3 ФГБУ НМИЦ акушерства, гинекологии
и перинатологии им. академика В.И. Кулакова, Москва, Россия
e-mail: n.yarygina17@yandex.ru
Ключевые слова: клеточная дифференцировка, маркеры эмбриональных клеток, врожденные дефекты развития, Oct-4, Nanog, SSEA-4.
Врожденные дефекты развития представляют собой серьезную медицинскую проблему, которую современная медицина пытается решить хирургическими методами. Одним из ключевых элементов патогенеза врожденных дефектов является аномальное поведение стволовых (СК) и прогениторных (ПК) клеток, что приводит к дефектному гистогенезу и морфогенезу. В нормальном пренатальном онтогенезе зачатки органов содержат большое количество плюрипотентных СК, экспрессирующих Oct-4, Nanog и другие транскрипционные факторы, активно экспрессируемые эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК), а также другие характерные для ЭСК белки, в частности, мембранный белок SSEA-4. Позже количество таких клеток сокращается и взрослая ткань состоит в основном из паренхимы, стромы и небольшого количества мультипотентных «региональных», не экспрессирующих эмбриональные белки СК, находящихся в специальном тканевом компартменте, «стволовой нише», и обеспечивающих регенерацию ткани. Несколько исследовательских групп обнаружили во взрослых тканях небольшое количество плюрипотентных клеток, экспрессирующих эти белки и способных к триплобласт-ной дифференцировке, но эти результаты пока не получили единодушного признания. Логично предположить, что зачатки органов, обнаруживаемые при их врожденном недоразвитии, могут содержать клетки, остановившиеся на каком-то этапе их нормального онтогенеза, в частности, плюрипотентные клетки, экспрессирующие эмбриональные маркеры. Действительно, проведенное нами исследование биопсийного материала взрослых пациенток с неполной аплазией матки показало, что зачатки эндометрия и миометрия содержат большое количество таких клеток, значительно превосходящее их количество во взрослых тканях. При культивировании в обычных условиях эти клетки вступали в дифференцировку с образованием клеток подобных клеткам эндометрия и миометрия. Ткань зачатков матки содержала также уже полностью дифференцированные клетки эндометрия и миометрия, причем в части биопсий клетки экспрессировали, а в части биопсий не экс-прессировали рецепторы эстрогенов и рецепторы прогестерона. Таким образом, в зачатках матки мы наблюдали замедление или остановку дифференцировки клеток. Для лечения подобных состояний разрабатываются методы их ранней диагностики и in situ терапии путем местного введения стимулирующих дифференцировку и нормальный гистогенез агентов. Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021-2030 годы) (№ 122022800499-5).
