CC BY
19
Ф. с. околов
Кинетический принцип в применении к определению аскорбиновой кислоты в ее растворах
Из кафедры общей гигиены Киргизского государственного медицинского института
При изучении окисления аскорбиновой кислоты в хвойных настоях с помощью перекиси водорода нами был замечен феномен: после прибавления перекиси водорода к хвойному настою вскоре наступало его резкое побурение, очевидно, за счет окисления хромогенов. Побурение исключалось, если опыт ставился с прокипяченным хвойным настоем. Резкая задержка окисления хромогенов могла быть достигнута также добавлением к некипяченому настою хвои чистой аскорбиновой кислоты. В последнем случае настой долго не менял своего первоначального со-ломенножелтого цвета, но в конце концов побурение наступало. Последнее обстоятельство, как нам казалось, говорило о том, что аскорбиновая кислота является более резким восстановителем по отношению к перекиси водорода, чем хвойные хромогены. Вероятно, поэтому окисление хромогенов происходит лишь после того, как закончится окисление аскорбиновой кислоты.
Исходя из этого предположения, мы решили построить искусственную среду, в которой задерживающее влияние аскорбиновой кислоты на процессы окисления можно было бы изучать с достаточной точностью. Для чистоты опытов нам казалось целесообразным выключить влияние ферментов как катализаторов перекисного окисления.
Вместо хромогенов мы выбрали иодистый калий как менее энергичный, чем аскорбиновая кислота, восстановитель. Перекись водорода в кислой среде окисляет иодистый водород в свободный иод, а последний обнаруживается крахмальным клейстером. Эта реакция легко задерживалась включением в смесь аскорбиновой кислоты. Опыты обнаружили зависимость между длительностью задержки и количеством добавляемой аскорбиновой кислоты. Тогда мы решили применить иод-крахмальную смесь для количественного определения аскорбиновой кислоты в ее растворах.
Опыты ставились следующим образом: в колбу емкостью 250 мл вливали 80 мл воды и затем добавляли раствор аскорбиновой кислоты известной концентрации. Этот раствор готовился непосредственно перед опытом путем растворения 0,100 г аскорбиновой кислоты в объеме 100 мл. Общий объем смеси доводился водой до 100 мл. Добавление раствора аскорбиновой кислоты к воде производилось таким образом, чтобы кончик пипетки был у самой поверхности воды. После этого в колбу добавлялось 5 мл 10°/о серной кислоты (концентрация кислоты устанавливалась по удельному весу), затем 2 мл 5% иодистого калия (без свободного иода), 3 мл 1% раствора крахмала и, наконец, 1,25 мл 1% раствора перекиси водорода.
Сразу после добавления перекиси водорода секундомером отмечалось время. Затем в колбу вставлялся термометр и прибор оставлялся с покое до появления синей окраски, равной по интенсивности стандартной. Стандарт готовится так: к 100 мл воды добавляют 3 мл 1% крахмала, 5 мл 10% серной кислоты и столько капель 0,01 нормального раствора иода, чтобы смесь приняла естественный голубовато-синий цвет.
В момент посинения до стандартного цвета отмечалось время опыта и температура смеси (с точностью до 0,2°). Так как посинение жидкости до стандартного цвета происходило не мгновенно, то вслед за
4 Гигиена и санитария, № 3
основным опытом производилось определение времени посинения. Жидкость обесцвечивалась несколькими каплями 0,01 нормального раствора гипосульфита, прибавляемого из бюретки, и вновь оставлялась на белом фоне до появления стандартного синего цвета. Этот контрольный опыт повторялся 3 раза. Средняя из результатов трех контрольных опытов вычиталась из общей длительности реакции в основном опыте. Обычно на посинение смеси до стандартного цвета требовалось 10—12 секунд.
Как показали наблюдения над влиянием температуры среды, скорость реакции укладывалась в известное эмпирическое правило (повышение температуры на 10° вызывает увеличение скорости реакции в 2—3 раза).
В нашем опыте повышение температуры на 10° вызывало ускорение реакции в 2,2 раза. Эмпирически нами было установлено, что при колебании температуры на +3° (от 18°) можно олраничиться увеличением или уменьшением срока реакции на 10% на каждый градус. При температуре, большей чем 18°, срок уменьшался, при температуре меньшей — увеличивался. Мы считаем необходимым производить опыт при 18°, иначе это эмпирическое правило может себя не оправдать.
Химическая и кинетическая сторона реакций может быть представлена следующим образом:
Св06Н8 + Н20г = С606Н6 + 2Н20. (1>
аскорбиновая дегидзо-
кислота аскорбиновая
кислота
Перекись водорода в водном растворе окисляет йодистый водород, в свободный иод следующим образом:
Н402 + 2Н- + 2Л' = Л2 + 2Н,0. (2)
По этому стехиометрическому уравнению можно было ожидать реакции пятого порядка. Неслл и Скот твердо установили, что она протекает бимолекулярно по следующей схеме:
Н202 + Л'=Н,0-Ы0'; Л0' + 2Н'+Л=Н,0 + Л2. (3)
Из этих процессов, в сумме дающих вышеприведенное уравнение,, первый — бимолекулярный — протекает медленно, с измеримой скоростью и определяет тип суммарного процесса, в то время как второй— тетрамолекулярный — идет очень быстро и, возможно, в свою очередь состоит из ряда последовательных ближе еще неизвестных, простых процессов. Поэтому суммарный процесс носит бимолекулярный характер (изложено по Эгерту и Гок, Учебник физической химии, 1933, стр. 553).
По какому типу проходит окисление аскорбиновой кислоты в присутствии иодистого водорода, сказать с полной уверенностью трудно. В наших опытах перекись водорода всегда находилась в большом избытке (на 0,006—0,114 молекулы аскорбиновой кислоты — 0,7 молекулы перекиси водорода), и поэтому можно предполагать, что реакция (1) протекает по типу псевдомономолекулярной.
Окисление аскорбиновой кислоты избытком перекиси водорода в отсутствие иодиСтого калия было нами изучено в другой работе. Мы показали, что реакция эта протекает именно по типу псевдомономолекулярной
Может показаться, что в системе перекись водорода + иодистый калий + аскорбиновая кислота происходит обычное окисление аскорбиновой кислоты за счет свободного иода, выделяемого перекисью водорода из иодистого калия (см. реакции 2 и 3). Однако сопоставление некоторых данных показывает, что здесь процесс идет не так просто.
1 Околов и Бдеян, Ферментный катализ в процессах окисления аскорбиновой кислоты (рукопись).
Характер реакции Скорость течения реакции
Окисление иодистого калия до свободного иода перекисью водорода в кислой среде Окисление аскорбиновой кислоты иодом в кислой среде Окисление аскорбиновой кислоты в системе иодноватокислый калий + иоди-стый калий кислота -)- аскорбиновая кислота Окисление иодистого калия в системе перекись водорода + иодистый калий -р кислота аскорбиновая кислота Практически мгновенно » г ъ > Реакция течет медленно. Задержка реакции зависит от количества прибавленной аскорбиновой кислоты
Индикатором конца реакции всюду является крахмальный клейстер.
Надо полагать, что присутствие аскорбиновой кислоты влияет на скорость реакции (см. первую часть уравнения 3) и тем сильнее, чем больше имеется аскорбиновой кислоты в данной смеси.
'Возможно также, что за счет громадного избытка восстановителя (иодистого калия) реакция течет по типу псевдомономолекулярной с малой константой скорости. Это обстоятельство может привести к последовательному окислению легко окисляющихся, а затем менее легко окисляющихся веществ (аскорбиновой кислоты и иодистого калия).
Точное соблюдение выработанной методики позволило нам установить, что между количеством добавляемой к смеси аскорбиновой кислоты и временем задержки реакции окисления иодистого калия существует линейная зависимость, выражаемая формулой у= ах, где у—количество взятой аскорбиновой кислоты, х — длительность задержки, выраженная в минутах, и а — константа, оказавшаяся равной в наших случаях 0,56. Если время выражать в секундах, то константа будет равна 0,009.
Результаты опытов представлены в таблице. Для наших опытов мы применяли аскорбиновую кислоту в количестве от 1 до 20 мг в общем объеме смеси 100 мл. Мы считаем вопрос изученным только в этих пределах, вполне достаточных, однако, для практических целей.
Материал, представленный в таблице, удается легко превратить в график — прямую с коэфициентом (константой) 0,56. Подобным графиком (в увеличенном масштабе) удобно пользоваться для быстрых расчетов. у = 0,56 х (если х выражен в секундах, то формула будет такой: у = 0,009 х).
Мы полагаем, что представленная формула отражает процесс только в пределах взятых концентраций аскорбиновой кислоты (до 20 мг в общем объеме 100 мл). Можно ожидать, что при больших концентрациях прямая превратится в кривую.
Таблица и график показывают, что между длительностью реакции и количеством взятой аскорбиновой кислоты существует прямо пропорциональное соответствие (если взять для расчета две константы, а именно, до 10 мг — 0,5 и от 10 мг — 0,56, то соответствие получится
4* -—-
27
ю
00
о." м м и
У-В й га "й
О СС
О
н о л
к в н
т в о
Ю >о ч
Темпера-тура среды
•а к
§ «
■О 8
5 га н
Л а ^
я к
а> 5
£ «
й о-
¡3 05
О. ш
С щ
£ °
5 а
О 3
«1 о «
О и о °
= 5 = 2
и £
.5 к о ч
5 ч м о
■Е а га ¡£
¿.о § ■ ~
О
О м О и „ НОЯ КВН .я в о ИЗ >о ч
15,0° 18,0* 18,0° 18,0е 18,0° 19,0° 19,0° 19,0° 20,5° 21,0° 21,5° 21,5°
Среднее
14,5° 15,0° 15,5° 18.0° 18,0* 18,0° 18,0° 19,0° 19,0° 19,0° 21,0°
2,7 2,2 2,0 2,0 2,0 1,75 1,83 1,81 1,45 1,36 1,27 . 1,37
1,8
2,2 2,0 2,0 2,0 1,93
2Л
1,99 1,81 1,76 1,71 1,85
5,5
5.8 5,0 4,0
4.0 4,25 3,й 3,7 3,77
3.9
3.1
Среднее
1,92
3.7 4,1 3,75 4,0
4.0 4,25
3.8
4.1 4,15 4,29 4,0
4,0
1,0 1,23 1,12 1,12 1,12 1,08 1,12 1.11 1,01 0,98 0,96 1,04
1,07
2,07
2,3
2,1
2,24
2,24
2,38
2,13
2.3 2,32
2.4 2,24
2,24
3 3 3 3
Температура среды
18,5° 19,0° 19,0° 21,03
Среднее.
16,0° 18 0° 19,0° 19,0° 21,0°
Среднее. .
10 10 Ю 10 10 10
16.5й 18,0° 18,0* 18,0° 19,0° 21,0°
Среднее .
-2 В
Н 5
О "
в 05
£ 65
н а й
П и га
§ га н
Ч О, в
<и о X
е-я
5,6 5,61 3,42 4.57
12 0 10,0 8,75 10.8 7,25
21,0 18,0 18,75 17,0 16,0 14,75
18,0
«а и
о я «о«
= о в 3
.2 с о в
ь: ч
5,Ь8 6.17 5,96 5,94
5,99
9,6 10,0 9,6 11,9 9,42
10,01
17,0
18,0
18,75
17,0
17,6
19,0
3,29 3,46 3,34 3,32
3,35
5,38 5,56 5,38 6,66 5,15
5,6
9,97 10,08 10,4 9,52 9,86 10,64
10,08
и *
га« и О
о в 2
н О (_
к в о £ = ч СОю и
Температура среды
Йя
о а в
■а в
ч в
н а га Й га н ч и >, с1 С. в
«
й К я
С ю
£ о.
Л. В
15 15 15 15 15 15
16,5* 18,0° 18,0° 18,5е 19,0* 20,0°
Среднее.
19,0° 18,0° 19,0° 19,5° 19,0°
Среднее. .
20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20
17,0° 17,5° 17,5° 18,53 18,0° 18,0е 19,0° 19,0° 19,0° 19,5е 19,0° 19,7е
33,0 26.5 •Л,0 27,5 23,25 20,8
28,0
26.5 27.0 28,9
25.6 25,0
Среднее.
29,5
32,0
29,75
28,5
29,5
26,8
32,45
32,0
32,72
32,77
32,45
эВ О и X
о о ю аз
со
■ н в Я
4) ч э1 ю о. н о ч
га Г г; О и и а га 5
40,0
36,25
36,0
34,5
35,0
35,75
32,0
32,5
32,0
31,0
32,5
30,0
32,46
36,0
34,45
34,2
36,2
35,0
35,75
35,2
35,8
35,2
35,6
35.0
35.1
35,29
15.Г8 14,84 15,12 16,18 14,39 14,0
15,0
18,17
17,92 18,32 18,35 18,17
18,18
20,16 19,29 19,15 20,27
19.6 20,02
19.7
20.05 19,7 19,94
19.6 19,65
19,75
еще более точным). Отсюда можно сделать вывод, что если прибавить к нашей системе (иодистый калий + перекись водорода) раствор, содержащий неизвестное количество аскорбиновой кислоты, то можно по длительности торможения основной реакции (окисления иодисгого водорода) определить с достаточной точностью концентрацию аскорбиновой кислоты в испытуемом растворе.
Здесь, однако, приходится сделать важную оговорку. Описанное соотношение между скоростью окисления иодистого калия и наличием аскорбиновой кислоты, как оказалось, сохраняло свое постоянство только для данного образца серной кислоты (эта кислота содержала примесь железа). Когда мы взяли другую, тоже химически не чистую кислоту, а затем использовали химически чистые кислоты, то результаты получились несколько иные. Данные, полученные для различных кислот, сопоставлены в следующей схеме. Исследования произведены с 1 мл I0/» раствора перекиси водорода.
Название кислоты Константа скорости а Примечание
Серная кислота химически не чистая . . Химически чистая серная кислота .... Химически чистая соляная кислота . . . Химически чистая азотная кислота • . . 0,0077 0,005 0,005 0,007 Кислота во всех случаях употреблялась в виде двунормального раствора х выражен в секундах
Эти результаты понятны: недостаточно чистые кислоты могут содержать различные катализаторы, ускоряющие в разной степени реакцию окисления аскорбиновой кислоты и иодистого калия.
Подобное препятствие полностью устраняется при использовании химически чистых кислот. При этом удается отметить постоянство констант для серной и соляной кислоты. Азотная кислота дала большую константу скорости, видимо, за счет самостоятельных окислительных свойств.
Описанный кинетический принцип определения аскорбиновой кислоты приобрел бы особый смысл, если бы его удалось применить для изучения содержания витамина С в растительных объектах. Однако в этих случаях пришлось бы столкнуться со следующими обстоятельствами.
1. Настои растительных объектов могут содержать различные катализаторы (например, соединения железа), и наличие этих катализаторов, без сомнения, может повлиять на величину константы скорости реакции.
2. Как показано Околовым и Бдеяном, синтетическая аскорбиновая кислота окисляется несколько медленнее, чем естественная аскорбиновая кислота (содержащаяся, например, в хвое). Отсюда можно ожидать, что константа реакции окисления для растительных объектов будет иной, чем для растворов чистой аскорбиновой кислоты: наличие катализаторов будет увеличивать ее абсолютную цифру; большая чувствительность к перекиси водорода, наоборот, приведет к некоторому ее снижению.
Трудно сказать, в какую величину выльется результирующая константа. Это обстоятельство должно быть выяснено в дальнейшем.
Заключение
Представленный материал может быть использован в трех направлениях: 1) для изучения различных биологических восстановителей и расположения их в порядке нарастания восстановительных свойств, 2) для
изучения влияния этих восстановителей на процессы окисления, протекающие в биологических средах, и 3) для целей количественного определения аскорбиновой кислоты. Дальнейшие исследования выяснят, применим'ли кинетический принцип для изучения биологических жидкостей.
Б. С. ГОЛОГОРСКИЙ. Е. Н. КЛОБУКОВА-АЛИСОВА и М. В. ГОЛЬДШТЕЙН
Витамин С в растительности Башкирской АССР (район Уфы)
Из Уфимского института эпидемиологии и микробиологии им. Мечникова и Башкирского ботанического сада
Содержание аскорбиновой кислоты в растениях подвержено значительным колебаниям, в зависимости от географического фактора (Букин, Курсанов и Крюкова, Гребинский, Благовещенский, Кирсанова).
В 1944—1945 гг. проводилось изучение содержания аскорбиновой кислоты в растительности Уфы и ее окрестностей, преимущественно на базе Башкирского ботанического сада. Определение аскорбиновой кислоты производилось главным образом в листьях. В съедобных или могущих быть использованными в пищу растениях содержание аскорбиновой кислоты определялось также и в съедобных частях, а в лекарственных растениях — в частях, имеющих фармакологическое значение. Большинство растений исследовалось повторно в течение всего вегетационного периода. Определение аскорбиновой кислоты производилось иодатным методом и по Тильмансу. Оба метода в параллельных определениях давали близкие, нередко совпадающие результаты.
Всего было изучено 392 вида растений, принадлежащие к 60 семействам. Из них древесных — 40 видов (10,2%), кустарниковых — 58 (14,8%) и травянистых — 294 (75%). Среди обследованных растений -было пищевых 114 (29,1%), кормовых — 37 (9,4%), лекарственных — •58 (14,8%), технических — 27 (6,9%), декоративных — 101 (25,&»/о) и сорных — 55 (14%).
Анализ собранного материала обнаружил крайне неодинаковую способность различных видов растений к накоплению аскорбиновой кислоты. Так, например, в одно и то же время (в августе) мы определили в плодах шиповника (Rosa cinnamomea L.) 2185,9 <мг% и в плодах терна (Prunus spinosa L.)—5,3 мгР/о, в листьях ореха маньчжурского из семейства ореховых (Juglans mandschurica Max.) — 1 184,2 мг%, а в листьях барбариса (Berberís vulgaris L.)— всего лишь 0,5 мп% аскорбиновой кислоты.
По степени С-витаминности изученные нами виды растений распределяются следующим образом: видов с содержанием в листьях менее 50 мг%—87 (22,2%), от 50 до 100 мП%—118 (30,1%), от 100 до 200 мг%—115 (29.3%) и более 200 мгР/« — 72 (18,4%). Таким образом, в 205 из 392 видов, или 52,3%, содержание аскорбиновой кислоты менее 100 мг%, а в 47,7% видах растений — более 100 мг%.
В Ставрополе на Северном Кавказе видов растений, содержащих менее 100 мг%, было лишь 21,6%, а более 100 мг%—78,4% (Гологор-ский и Агамян). Это сопоставление еще раз подтверждает влияние географического фактора на содержание аскорбиновой кислоты в одних и тех же видах растений. Однако в некоторых видах башкирской флоры содержание аскорбиновой кислоты значительно больше, чем у одноимен-
