CC BY
65
УДК 577.21:616; 577.2:591.2
Л. Н. Маслов, А. В. Крылатое, О. В. Ласукова, И. Г. Халиулин
КАННАБИНОИДЕРГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ СОКРАТИМОСТИ СЕРДЦА ПРИ ИШЕМИИ/РЕПЕРФУЗИИ
Авторы исследовали влияние селективных лигандов каннабиноидных (СВ) рецепторов на сократимость изолированного перфузируемого сердца крысы во время глобальной ишемии и реперфузии. Перфузия раствором, содержащим селективный СВ-агонист Ни-210, усугубляла реперфузионную сократительную дисфункцию сердца. Этот каннабиноид во время реперфузии уменьшал давление, развиваемое левым желудочком, максимальную скорость сокращения и расслабления сердца, но не оказывал эффекта на частоту сердечных сокращений и конечное диастолическое давление. Отрицательный инотропный эффект Ни-210 был транзиторным и исчезал после 5-минутной реперфузии. Предварительное введение селективного агониста СВ1 рецепторов 8Ю41716Л и селективного агониста СВ2 рецепторов 8Я144528 не оказывает эффекта на сократимость миокарда во время реперфузии. Таким образом, настоящие результаты указывают, что стимуляция СВ рецепторов может усугублять реперфузионную сократительную дисфункцию сердца. Эндогенные каннабиноиды не участвуют сократительной дисфункции сердца во время ишемии/реперфузии сердца.
Ключевые слова: каннабиноидныерецепторы, сократимость сердца, ишемия, реперфузия, изолированное сердце.
Общеизвестно, что ишемия и реперфузия приводят к развитию сократительной дисфункции миокарда [1], которая достаточно часто нивелирует положительный эффект тромболитической терапии у больных с острым инфарктом миокарда и осложняет течение послеоперационного периода у кардиохирургических больных [2]. Лекарственных средств, способных эффективно устранять и предупреждать появление этой грозной патологии, не существует. Во многом это может быть связано с недостаточностью наших знаний о патогенезе «реперфузионного оглушения» сердца. В частности, практически не изучена роль эндогенных каннабиноидов в механизме формирования сократительной дисфункции миокарда. Между тем литературные данные говорят о том, что агонисты каннабиноидных (СВ) рецепторов могут оказывать отрицательный инотропный эффект как in vitro [3, 4], так и in vivo [5, 6] и, следовательно, могут участвовать в возникновении реперфузионного снижения сократимости миокарда.
Каннабиноидные рецепторы были открыты в ткани мозга крыс в 1998 г. [7]. Практически одновременно с открытием СВ рецепторов были обнаружены эндогенные агонисты СВ рецепторов: арахидонилэта-ноламид (анан-дамид), 2-арахидонилглицерол и паль-митоилэтаноламид [8]. Установлено, что СВ рецепторы делятся на два типа: СВ1 и СВ2 [7]. Каннабиноид-ные рецепторы относят к семейству трансмембранных 0!/о-белок сопряженных рецепторов, активация которых способствует снижению активности адени-лат-циклазы [9]. В миокарде СВ рецепторы были идентифицированы A. Bonz и соавт. в 2003 г. [3]. Известно и то, что каннабиноиды оказывают гипотензивный и отрицательный хронотропный эффект при системном введении [5, 6]. Есть единичные работы, свидетельствующие о влиянии каннабиноидов на сократимость изолированного перфузируемого сердца [3, 4,
10, 11]. Однако до настоящего времени нет единого мнения о роли этих соединений в регуляции инотроп-ной функции сердца при ишемии/реперфузии.
Целью исследования явилось изучение роли каннабиноидных рецепторов в регуляции сократимости миокарда при ишемии/реперфузии.
Методика
Исследования были проведены на изолированных сердцах крыс-самцов массой 250-300 г линии Вис-тар. После торакотомии сердце быстро извлекали, помещали в ванночку с охлажденным (+4 °С) раствором Кребса-Хензелайта. В восходящую дугу аорты вводили канюлю, через которую поступал изотонический раствор. Ретроградную перфузию сердца проводили по методу Лангендорфа под постоянным давлением 55 мм рт. ст. раствором Кребса-Хензелайта, насыщенным карбогеном (+37 °С, рН 7.4) и содержащим (в мМ): NaCl - 120; KCl - 4.8; CaCl2 - 2.0; MgSO4- 1.2; KH2PO4- 1.2; NaHCO3 - 20.0; D-глюкоза - 10.0. Для приготовления этого раствора применялись реактивы компании «ICN Biomedicals» (Costa Mesa, США). Раствор Кребса-Хензелайта и все реактивы готовились на деионизованной воде, которая подвергалась очистке на установке «Simplicity» компании Millipore (Millipore, Франция).
Для измерения параметров сократительной функции в полость левого желудочка вводили катетер с латексным баллончиком. Баллончик заполняли водой, устанавливая диастолическое давление в желудочке на уровне 10-15 мм рт. ст. Показателями насосной функции сердца служили: частота сердечных сокращений (ЧСС, уд./мин); давление, развиваемое левым желудочком (ДРЛЖ, мм рт. ст.); максимальная скорость сокращения (МСС, мм рт. ст./с); максимальная скорость расслабления (МСР, мм рт. ст./с). Давление, развиваемое левым желудочком, вычисляли как разницу между систолическим и конечным диасто-
лическим давлением (КДД, мм рт. ст.). В качестве блокаторов СВ рецепторов использовали: селективный антагонист СВ1 рецепторов SR141716A (N-[piperidin-1-yl]-1-[1,2-dichlorophenyl]-4-methyl-1H-pyrazole-3-caboxamid HCl) [12] и селективный антагонист СВ2 рецепторов SR144528 (N-(1S)-endo-1,3,3-trimethylbicyclo[2.2.1]hepta-2-yl]-5-(4-chloro-3-methylphenyl)-1-(4-methylbenzyl)-pyrazole-3-carboxamide) [13]. Эти препараты растворяли в диме-тилсульфоксиде (DMSO) и после стабилизационного периода добавляли в перфузионный раствор в конечной концентрации 1 мкМ/л. Отдельно была проведена серия с DMSO, который добавляли в конечной концентрации не более 0.01 %. Оказалось, что DMSO в указанной концентрации не влияет на сократимость сердца. После 10-минутной перфузии сердца раствором Кребса-Хензелайта, содержащим один из антагонистов, регистрировали параметры сократимости. Антагонисты СВ рецепторов были синтезированы в Research Triangle Institute (Research Triangle Park, США). Активацию СВ-рецепторов проводили in vitro путем добавления в перфузионный раствор селективного агониста СВ рецепторов HU-210 ((6aR)-trans-3-(1,1-Dimethylheptyl)-6a,7,10,10a-tetrahydro-1-hydroxy-6,6-dimethyl-6H-dibenzo[b,d]pyran-9-methanol) в конечной концентрации 1 мкМ/л [14]. Препарат разводили в DMSO непосредственно перед экспериментом. После 20-минутной адаптации сердца перфузи-ровали в течение 10 мин раствором Кребса-Хензе-лайта, содержащим HU-210, и 10 мин без препарата. Затем следовал 45-минутный период тотальной нормотермической ишемии и 30-минутной реперфузии. Контролем служили изолированные сердца крыс, которые перфузировали раствором Кребса-Хензелай-та, содержащим DMSO в конечной концентрации не более 0.01 % по той же схеме, что и HU-210. Селективный агонист СВ рецепторов HU-210 был синтезирован компанией Tocris Cookson (Bristol, Великобритания).
Полученные данные обработаны статистически с применением t-критерия Стьюдента и критерия Манна-Уитни.
Результаты исследования
В контрольной серии экспериментов возобновление коронарной перфузии после 45 мин тотальной ишемии приводило к развитию депрессии сократимости. Так, ЧСС, составляющая до моделирования тотальной ишемии 223+10 уд./мин, в период реперфузии снизилась в 1.5-2 раза (рис. 1, а). Брадикар-дия сохранялась до конца реоксигенации. Сила сокращений изолированного сердца в доишемическом периоде равнялась 80.4±4.2 мм рт. ст., на 5-й минуте реперфузии этот показатель достигал 30 % от исходного доишемического уровня (рис. 1, б). К концу ре-перфузионного периода давление, развиваемое левым же-лудочком, несколько возросло, составив 50 % от исходных значений (рис. 1, б).
Тотальная ишемия способствовала почти двукратному росту конечного диастолического давления по отношению к исходному уровню. После возобновления коронарной перфузии изолированного сердца наблюдалось увеличение КДД на всем протяжении реперфузионного периода (рис. 1, в). Максимальная скорость сокращения в начале реперфузии снизилась в среднем в 3.5 раза по отношению к доишемическим значениям этого показателя (31.4±2.2 мм рт. ст./с). К концу 30-й минуты реперфузии этот показатель составлял 50 % от исходных доишемических значений (рис. 2, а). Изменения максимальной скорости расслабления были аналогичны изменениям скорости сокращения (рис. 2, б).
Применение селективного агониста СВ рецепторов HU-210 (1 мкМ) не влияло на частоту сокращений изолированного сердца в период постишемической реперфузии (рис. 1, а). Динамика ЧСС в этой серии опытов статистически достоверно не отличалась от соответствующих изменений данного показателя в контроле (рис. 1, а). В ответ на активацию каннаби-ноидных рецепторов достоверных изменений КДД в реперфузионном периоде по отношению к контролю также не наблюдалось (рис. 1, б). В то же время предварительная активация СВ рецепторов сопровождалась кратковременным угнетением сократимости изолированного сердца в реперфузионном периоде с последующим восстановлением этого параметра до соответствующих контрольных величин (рис. 1, б).
Так, на 5-й минуте реперфузии ДРЛЖ оказалось в 1.5 раза ниже аналогичных значений в контроле, а к 15-й и 30-й минутам сила сокращений изолированного сердца возросла до соответствующих значений контрольной серии (рис. 1, б). Кроме того, в ответ на активацию каннабиноидных рецепторов отмечалось и более медленное восстановление скорости сокращений по сравнению с контролем. Так, на 5-й минуте реперфузии этот параметр был в 2 раза ниже, чем в контроле (рис. 2, б), к концу эксперимента скорость сокращения увеличилась до соответствующих показателей в контроле (рис. 2, б). Динамика скорости расслабления в этой серии опытов была аналогичной изменениям скорости сокращений (рис. 2, а). В начале реперфузии, на 5-й минуте, МСР была в 1.5 раза меньше, чем в контроле, но уже к 15-й и 30-й минутам произошло увеличение скорости расслабления до контрольных значений (рис. 2, а).
Следующей задачей данного исследования было изучение вклада эндогенных агонистов СВ рецепторов в регуляцию инотропной функции сердца в условиях ишемии и последующей реперфузии.
В ходе экспериментов было установлено, что на фоне предварительной блокады СВ1 рецепторов с помощью SR141716A (1 мкМ) достоверных изменений частоты и силы сердечных сокращений изолированного сердца в постишемический период не происходит. Динамика этих показателей на всем протяжении
уд./мин
60
50
40
30
20
10
0
!4 1
■ контроль — НИ-210 12 ■ контроль — НИ-210
И
5 15 30 5 15 30
15
Время реперфузии, мин
мм рт. ст.
Время реперфузии, мин
200
%
контроль
НИ-210
контроль
НИ-210
0
5 15 30
Время реперфузии, мин
Рис. 1. Влияние селективного агониста каннабиноидных рецепторов Ни-210 (1 мкМ) на частоту сердечных сокращений (а), давление, развиваемое левым желудочком (б), конечное диастолическое давление (в) в период 30-минутной постишемической реперфузии. *- Р0.05 по сравнению с контролем.
реперфузии остается такой же, как и в контрольной серии экспериментов (рис. 3, а-е). Применение БЯ141716Л (1 мкМ) не привело к каким-либо заметным, в сравнении с этим же показателем в контроле, изменениям КДД (рис. 3, в). В проведенных экспериментах нами не было обнаружено и достоверных изменений скоростей сокращения и расслабления по отношению к контролю (рис. 2).
Блокада СВ2 рецепторов путем 10-минутной перфузии изолированного сердца раствором, содержащим БЯ144528 в конечной концентрации 1 мкМ, также не выявила достоверных изменений частоты и силы сердечных сокращений в сравнении с аналогичными показателями в контроле на всем протяжении 30-минутной реперфузии (рис. 3, а). Как видим, динамика ЧСС и ДРЛЖ в этой серии экспериментов оказалась такой же, как в контроле. Изменения КДД на фоне блокады СВ2 рецепторов были также аналогичными динамике этого параметра в контроле (рис. 3). Скорости сокращения и расслабления также не отлича-
Рис. 2. Влияние селективного агониста каннабиноидных рецепторов Ни-210 (1 мкМ) на максимальную скорость сокращения (а) и максимальную скорость расслабления (б) изолированного сердца крыс в период 30-минутной постишемической реперфузии. *- Р<0.05 по сравнению с контролем
лись от соответствующих показателей контрольной серии на всем протяжении реперфузионного периода (рис. 4).
Обсуждение результатов
Таким образом, результаты проведенных нами экспериментов указывают на то, что стимуляция канна-биноидных рецепторов миокарда сопровождается снижением ДЛРЖ, скорости сокращения и расслабления левого желудочка во время реперфузии. Следовательно, есть веские основания полагать, что активация СВ рецепторов усугубляет реперфузионную сократительную дисфункцию сердца. Этот отрицательный инотропный эффект носит транзиторный характер, поскольку уже к 15-й минуте реоксигенации наблюдается восстановление этих показателей. Мы полагаем, что преходящий характер инотропного эффекта НИ-210 связан с диссоциаций комплекса НИ-210-СВ рецептор или с десенситизацией СВ рецепторов, поэтому отрицательное инотропное действие НИ-210, отмеченное в условиях нормоксии, ослабевает к 15-й минуте реперфузионного периода. Наши данные согласуются с результатами Ш. Я. Богё и соавт. [4]. Эти исследователи установили, что активация СВ рецепторов приводит к снижению силы и скорости сердечных сокращений интактного изолированного сердца крысы [4]. Результаты нашей работы позволяют утверждать, что отрицательное инотропное действие каннабиноидов сохраняется и в условиях возобновления коронарной перфузии.
Мы полагаем, что в реализации инотропных эффектов агониста СВ рецепторов принимает участие цАМФ. Основанием для подобного предположения
50-і ■ контроль _ SR141716 □ SR144528 п
20 ■ контроль _ SR141716 □ SR144528
ШЛИ Ни и
SR141716 □ SR144528
15
30
15
контроль _ SR141716 □ SR144528
350 -300 -250 -200 -150 -100 -50 0
контроль
- SR141716
□ SR144528
30
□ SR144528
Рис. 3. Влияние антагонистов каннабиноидных рецепторов БР141716 и БР144528 (1мкМ) на частоту сердечных сокращений (а), давление развивиемое левым желудочком (б), конечное диастолическое давление (в) в период 30-минутной постишемической реперфузии. Пунктирной линией обозначены значения в контроле до ишемии
явились данные ряда авторов о дозозависимом ингибировании синтеза цАМФ в клетке в ответ на стимуляцию СВ рецепторов [9]. Кроме того, существуют публикации о том, что 8-бром-цАМФ (синтетический энзимо-устойчивый аналог цАМФ) увеличивает силу сокращений изолированной папиллярной мышцы морской свинки, а также ускоряет ее сокращение и расслабление [15]. Следовательно, можно предположить, что падение силы сокращений, уменьшение скорости сокращения и расслабления сердца в ответ
14
12
10
8
0
Рис. 4. Влияние селективного агониста каннабиноидных
рецепторов SR141716 и SR144528 (1мкМ) на максимальную скорость сокращения (а) и максимальную скорость расслабления (б) изолированного сердца крыс в период 30-минутной постишемической реперфузии. Пунктирной линией обозначены значения в контроле до ишемии
на стимуляцию каннабиноидных рецепторов является результатом снижения продукции цАМФ.
Нами было установлено, что на фоне предварительной селективной блокады СВ1 рецепторов с достоверных изменений частоты и силы сердечных сокращений изолированного сердца в постишемичес-кий период не происходит. Селективная блокада СВ2 рецепторов также не вызвала достоверных изменений ЧСС и силы сердечных сокращений. Следовательно, нарушение насосной функции сердца in vitro в реперфузионном периоде также не связано с активацией СВ1 или СВ2 рецепторов эндогенными канна-биноидами.
Таким образом, стимуляция СВ рецепторов in vitro усугубляет нарушения сократимости сердца при ишемии/реперфузии. Эндогенные каннабиноиды не участвуют в формировании реперфузионной сократительной дисфункции изолированного перфузируемого миокарда.
Работа выполнена при поддержке гранта Министерства образования и науки РФ (рег. № 2.1.1/530) Российского фонда фундаментальных исследований, Федерального агентства по науке и инновациям.
Список литературы
1. Литвицкий П. Ф. Патогенетические и адаптивные изменения в сердце при его региональной ишемии и последующем возобновлении коронарного кровотока // Пат. физ. эксперим. тер. 2002. № 2. С. 2-12.
2. Дебейки М. A., Готто A. M. Новая жизнь сердца / Пер. с англ. под ред. Р. С. Акчурина. М., 1998. 500 с.
3. Bonz A., Laser M., Kullmer S. et al. Cannabinoids acting on CB1 receptors decrease contractile performance in human atrial muscle // J. Cardiovasc. Pharmacol. 2003. V. 41. N 4. P. 657-664.
ft. H. Macnoe, A. B. Kpunamoe, O. B. ftacyKoea, H. r. Xanuynun. KannaSuHoudepzuHecKan pezyn^un...
4. Ford W. R., Honan S. A., White R., Hiley C.R. Evidence of a novel site mediating anandamide-induced negative inotropic and coronary vasodilatator responses in rat isolated hearts // Br. J. Pharmacol. 2002. V. 135. P. 1191-1198.
5. Cavero I., Lokhandwala M. F., Buckley J. P., Jandhyla B. S. The effect of (-)-fl9-trans-tetrahydrocannabinol on myocardial contractility and
venous return in anaesthetized dogs // Eur. J. Pharmacol. 1974. V. 29. N 1. P. 74-82.
6. Vidrio H. et al. Cardiovascular effects of (-)-11-OH-D8-tetrahydrocannabinol-dimethylheptyl in rats // J. Cardiovasc. Pharmacol. 1996. V. 28. P. 332-336.
7. Howlett A. C., Barth F., Bonner T. I. et al. International Union of Pharmacology. XXVII. Classification of cannabinoid receptors // Pharmacol. Rev. 2002. V. 54. N 2. P. 161-202.
8. Felder C. C., Veluz J. S., Williams H. L. et al. Cannabinoid agonists stimulate both receptor- and non-receptor-mediated signal transduction pathways in cells transfected with and expressing cannabinoid receptor clones // Mol. Pharmacol. 1992. V. 42. P. 838-845.
9. Howlett A. C., Champion T. M., Wilker G. H., Mechoulam R. Stereochemical effects of 11-OH-fl8-tetrahydrocannabinol-dimethylheptyl to inhibit adenylate cyclase and bind to the cannabinoid receptor // Neuropharmacology. 1990. V. 29. P. 161-165.
10. Li D. M. F. The lack of B-adrenoceptor involvement in the cardiac action of fl1-tetrahydrocannabinol in rats // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.
1980. V. 7. P. 23-29.
11. Smiley K. A. et al. Effects of cannabinoids on the perfused rat heart // Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 1976. V. 14. P. 659-675.
12. Mansbach R. S., Rovertti C. C., Winston E. N., Lowe J. A. Effects of the cannabinoid CB1 receptor antagonist SR141716A on the behavior of pigeons and rats // Psychopharmacology. 1996. V. 124. P. 315-322.
13. Bouaboula M., Desnoyer N., Carayon P. et al. G, protein modulation induced by a selective inverse agonist for the peripheral cannabinoid receptor CB2: Implication for intracellular signalization cross-regulation // Mol. Pharmacol. 1999. V. 55. P. 473-480.
14. Mechoulam R., Feigenbaum J. J., Lander N. et al. Enantiomeric cannabinoids: Stereospecificity of psychotropic activity // Experientia. 1990. V. 44. P. 762-764.
15. Korth M., Engels J. Inotropic and electrophysiological effects of 8-substituted cyclic AMP analogues on guina-pig papillary muscle // Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1987. V. 335. P. 77-85.
