CC BY
7ЭФФЕКТИВНОЕ ЖИВОТНОВОДСТВО
генеральный
партнер выпуска
+ аик
ЙЫ551Д
39
ООО «НПФ «ЭЛЕСТ»
Малков М.А. - профессор, Малков Н.В. рНД, Данькова Т.В. к.э.н.
КАК ПРАВИЛЬНО СКОНСТРУИРОВАТЬ НЕЙТРАЛИЗАТОР ТОКСИНОВ?
Вокруг проблемы устранения токсинов из корма достаточно много спекуляций. Каждый производитель т.н. нейтрализаторов токсинов считает необходимым представить ситуацию таким образом, что эффективность сорбции всех токсинов, включая трихотецены, составляет не менее 80-90%. При норме ввода 0,2% и меньше. Не всегда указывается нагрузка токсинов в кормах. Это важно, поскольку нагрузка на уровне, ПДК при низкой норме ввода (0,2%) сорбентов не может обеспечить высокий уровень сорбции токсинов, в частности, трихотеце-новой группы (Т - 2 и др.). То есть этого не может быть, потому что не может быть никогда. Для улучшения понимания ситуации с сорбцией токсинов на неорганических сорбентах мы предлагаем рассмотреть химическую структуру отдельных токсинов и прогнозировать возможные механизмы сорбции.
Т-2 токсин. ДОН (рис. 1)
Эти токсины обладают неплоским каркасным скелетом и сравнительно невысокой полярностью, но если молекула ДОН имеет сопряженный фрагмент, хотя и небольшой, но всё-таки способный к п-п взаимодействиям (имеется ввиду С=С связь, сопряженная с С=0 группой), а также 2 протоно-донорных гидроксигрупы, то в случае Т-2 токсина, где нет элементов сопряжения и содержится всего
одна гидроксигруппа, возможности к связыванию с сорбентами совсем мизерны, тем более в щелочной среде. Таким образом, можно предполагать, что используемые в составе нейтрализаторов природные сорбенты (цеолиты, бентониты и др.) не могут обладать какой-либо значимой емкостью по Т-2 в связи с особенностями его структуры, 10 лет назад нами были проведены исследования, подтверждающие эти обстоятельства.
Тем не менее, нами были найдены и включены в состав нейтрализатора токсинов - «Фунгистат ГПК» композиции природных цеолитов, бентонитов, способные обеспечить некоторую сорбцию трихо-теценов даже в условиях нагрузки на уровне МДУ. Нами использованы 2 сорбента с оптимальным составом, а именно монтмориллонит коллоид - 2325%, опал-кристобалит - 45-52%, кальций - 1-5%, гидрослюда - 2-4%. Далее мы установили, что если норму ввода найденных сорбентов увеличить до 1 % (избыток) в случае высоких нагрузок токсинов, то эффективность сорбции возрастает до 84%.
Как можно объяснить такой эффект усиления сорбции? Известно, что диспергированные алюмосиликаты содержат в своём составе частицы, обладающие сложной наноструктурой, в частности, они могут содержать наноразмерные поры, ячеистые системы с диаметром от 1-2 нм до нескольких сотен нм. Размер и удельное содержание таких нанопор зависит от происхождения материала и способа обработки. Размеры молекулы Т-2 токсина соответствуют наноразмерам с диаметром примерно 1,52,5 нм. Попадание молекулы Т-2 токсина в такую ячейку приведёт к специфической и практически необратимой сорбции данной молекулы. Это особый эффект (эффект специфической сорбции), однако для него характерна низкая сорбционная емкость. Этот эффект проявляется только при большом избытке сорбента к сорбирующему веществу. Причина в том, что содержание нанопор, соответствующих по размеру молекулы Т-2 токсина, относительно невелико, статистически такие поры попадаются примерно одни на сотню других. Поэтому можно предположить, что 1кг сорбента способен специфически связать никак не более 1гтоксина(необходимо оценить в эксперименте). Однако
Рисунок 1. Структура токсинов
40 Корма и кормление
шшш. agroyug.ru
та доля токсина, которая свяжется специфически, будет связана прочно и практически не будет де-сорбироваться. В этой связи не следует испытывать никаких иллюзий в отношении того, что при высоких нагрузках токсинов можно получить какую-то заметную сорбцию при нормах ввода 0,2% и ниже. Подобное утверждение - это введение покупателя в заблуждение в отношении свойств продукта. А это уже недобросовестная конкуренция. Поэтому применительно к «Фунгистат ГПК» мы рекомендуем использовать норму ввода найденных нами сорбентов в пределах 0,5-1% на тот период, пока не будет снижена нагрузка токсинов в кормах, что позволит вернуться к обычным нормам ввода.
Что касается других токсинов.
Охратоксин (рис.1).
Является достаточно активным и содержит про-тонодонорные функции, благодаря чему склонен к связыванию с полярными сорбентами (окись алюминия, алюмосиликат, кремнезем и др.). Для охратоксина в принципе можно подобрать комплек-сообразующий реагент, но, судя по нашим данным, ни один из компонентов кормовой смеси и ни один из сорбентов не образует комплексов с охратокси-ном. По нашим данным, сорбция охратоксина для разных сорбентов при норме ввода 0,2% на уровне МДУ составляет в кислой среде от 35 до 44%, в щелочной от 35 до 67%.
ДОН (дезоксиниваленол) (рис. 1).
Молекула ДОН нейтральна, и её форма не изменяется при смене рН раствора. Но в отличие, например, от афлатоксина, ДОН содержит 2 ги-дроксильные группы и способен к образованию водородных связей с полярными кислородсодержащими группами. Например, (х) А1 = 0 или (х2) Si = 0 связывание ДОН происходит только в кислой среде и максимально 47% при норме ввода 0,2%.
Зеараленон и фумонизин (рис. 1).
Оба токсина достаточно полярны и содержат пртонодонорные функции, благодаря чему склонны к связыванию с полярными сорбентами (окись алюминия, алюмосиликаты, кремнезем и др.).
Фумонизин (рис. 1) содержит 4 карбоксильные группы, из которых 3 свободны от внутримолекулярного соле-образования. В кислой среде ионизация карбоксигруппы подавлена, поэтому молекула фумонизина находится в виде катиона или нейтрального цвиттер-иона и хорошо сорбируется. В слабощелочной среде при рН 7,3 эти 3 карбоксигруппы ионизируются, и в результате резко увеличивается гидрофильность молекулы, то есть сродство к водной фазе. Соответственно, фумонизин хорошо сорбируется в кислой зоне и не сорбируется в слабощелочной.
Аналогичная ситуация возникает в случае зеараленона (рис. 1). В кислой среде ионизация зеараленона подавлена, что способствует его сорбции. В слабощелочной среде зеараленон ионизируется, хотя и не полностью. Этого достаточно, чтобы резко понизилась сорбция при
рН 7,3. Ранее мы показали («Животноводство России» № 1-2 2010 г.), что при переходе из кислой в слабощелочную среду в экспериментах на смеси корм - сорбент - токсин десорбция фумонизина и зеараленона не происходит. Дело в том, что если бы удерживание на смеси корм - сорбент было исключительно за счет неспецифической сорбции, то десорбция наверняка наблюдалась. Но как мы выше упоминали, удержание фумонизина и зеараленона на смеси обусловлено в значительной степени комплексообразованием. Если комплекс образовался, то его разрушение требует значительной энергии (более 10 ккал/моль) и последующая смена рН раствора уже не изменяет связанное состояние токсина. Отсутствие десорбции явилось бы положительным фактором, если бы не очевидное разрушение корма в кишечнике под влиянием ферментов и микробиоты кишечника. В этом случае освободившиеся токсины, не имея возможности сорбции на сорбентах в условиях слабощелочной среды, попадут в русло крови и далее в печень.
Афлатоксин (рис. 1).
Молекула афлатоксина нейтральна, и её форма не изменяется при смене рН раствора. Поэтому различия в сорбирующей способности сорбента по отношению к афлатоксину следует искать в самих сорбентах и в их трансформациях под влиянием рН.
Как видно из результатов (таб. 1) для всех сорбентов, содержащих те или иные органические субстанции (в т.ч. различные полисахариды), сорбция для афлатоксина в слабощелочной среде выше, чем в кислой. Для двух из них (3, 4 поз. таб. 1), содержащих в рецептуре повышенное количество полисахаридов, сорбция в кислой среде вообще отсутствует. Можно предположить, что причиной этому является экранирование полисахаридных цепочек органических сорбентов в кислой среде, в том числе с участием ионной сольватации (катионами алюминия, кальция меди и др.). Заметим, что в кислой среде данные ионы приобретают активность, в отличие от щелочной среды. В результате такой
Таблица 1.
Адсорбция Афлатоксина В1 (МДУ= 50 мкг/кг).
Адсорбция в кислой среде Адсорбция в слабо-
№ п/п Сорбент щелочной среде
в мкг/кг в % в мкг/кг в %
1 №1 Фунгистат - алюмосиликаты+бентониты+органические кислоты+гепатостимуляторы+протеолитический комплекс+фунгистатики+нуклеозиды 30,5 60,9 33 65,8
2 №2 - неорганический сорбент (специальным образом обработанные цеолиты) +биотрансформирующий фермент 11,2 22,3 20,8 41,5
3 №3 - смесь из адсорбентов + дрожжи+ соли пропионовой кислоты 0 0 39,2 78,4
4 №4 - сорбент органической природы (полисахариды) 0 0 30,6 61
5 №5 - бентониты+ дрожжи+ полисахариды растительного происхождения 9,0 17,9 22,0 44
6 №6 - глинистые субстанции+ продукты переработки дрожжей+ органические кислоты+ антиоксиданты+ растительные экстракты 4,2 8,4 30,0 60
7 №7 - модифицированные бентониты, минералы, силикаты,хелаты 1,9 3,8 3,7 7,4
8 №8 - клиноплитонит, природный минерал, специальным образом обработанный 9,7 19,3 6,6 13,2
ЭФФЕКТИВНОЕ ЖИВОТНОВОДСТВО
генеральный
партнер выпуска
+ BUSS
Й и 5 51А
41
сольватации экранируются и дезактивируются центры органических сорбентов, отвечающие за сорбцию малополярных веществ, в частности, афлатоксина. Однако часто алюмосиликатные сорбенты обладают весьма незначительной сорбцией афлатоксина как в кислой, так и в слабощелочной зонах. Исключением является «Фунгистат ГПК», который имеет не доминирующую органическую часть (гепатопротектор), однако его основное преимущество - это наличие двух различных по природе сорбентов, обеспечивающих высокий уровень сорбции афлатоксина при различных рН.
Все токсины связаны с кормом, по-видимому, за счет неспецифических ван-дер-ваальсовых взаимодействий. Это обстоятельство следует учитывать, поскольку так или иначе корм подвергается деструкции микробиотой кишечника, рубца и толстого кишечника, а также собственными ферментами животных и птицы. В этом случае важно понять дальнейшую судьбу токсинов. Свободные от корма токсины, как хотелось бы думать, должны сорбироваться на соответствующих минеральных или органических сорбентах. Что касается органических сорбентов, например сухой биомассы дрожжей, других микроорганизмов, водорослей и т.д., то очевидно, что они будут утилизированы живой и растущей микробиотой и токсины будут снова на свободе. Опубликовано много данных о потенциальной возможной сорбции токсинов на органических сорбентах, но мы не нашли данных о дальнейшей судьбе токсинов. В соответствии с вышеизложенным, при нагрузке токсинов в кормах на уровне МДУ емкость сорбции на нейтрализаторах недостаточна при нормах ввода 0,2%, и в этом случае значительные дозы токсинов попадут в русло крови и печень. Необходимо также понимать, что значительную часть активных центров на сорбентах, при деструкции кормов будет занята витаминами, аминокислотами, микроэлементами, ионами двухвалентных металлов. Поэтому при создании отечественного нейтрализатора токсинов «Фун-гистат-ГПК» мы не только полностью исключили использование импортных компонентов, и создали научно-обоснованную композицию из неорганических сорбентов, но и сопроводили её правилами оптимальной дозировки, как было выше показано.
Глюконеогенез в печени нарушается при захвате токсинов. На самом деле это наиболее серьезное повреждающее действие токсинов. Было установлено, что захват токсинов гепатоцитами печени приводит к торможению синтеза РНК и белков в гепатоцитах, что соответственно, значительно снижает скорость синтеза глюкозы крови. Это, в свою очередь, создает дефицит энергии для производства целевых продуктов у сельскохозяйственных животных и птицы, снижает иммунитет и ухудшает конверсию корма. Также известно, что единственным путем блокировки захвата токсинов гепатоцитами печени является использование антиоксидантов, в том числе флавоноидов, которые способны занимать активные центры в гепатоцитах. В процессе работы над «Фунгистатом - гПк» мы предусмотрели необходимость такой функции и ввели в состав продукта антиоксиданты в найденной концентрации.
Возможно ли в широком масштабе использовать ферменты для дезактивации микотоксинов?
В настоящее время имеется достаточно много исследований на эту тему. Известно, что ряд штаммов микроорганизмов обладает способностью к деструкции токсинов. Также в мире выпускаются нейтрализаторы токсинов с включением в их состав ферментов, инактивирующих определенные токсины (например, Т-2 токсин). Разумеется, стоимость
таких сорбентов достаточно высока. Мы установили недавно, что имеющийся у нас штамм Lactobacillus acidophilus обладает способностью к деструкции афлатоксина. В настоящее время мы организовали производство закваски на основе этого штамма с использованием её в составе жидкого сорбента «Хитолоза». Однако установленные факты разрушения отдельных токсинов определенными видами микроорганизмов не означают, что все токсины подпадают под это правило. Вместе с тем достаточно много спекуляций на эту тему. В том числе в список тотальных деструкторов попадают обычные штаммы Bac. subtilis. Известно, что для такого рода заявлений необходимо несколько лет серьезных исследований. Хотя и так очевидно, что этого не может быть. Тем не менее микробиота рубца и кишечника моногастричных может при определенных условиях выступить в качестве серьезного деструктора токсинов.
Что это за условия?
Прежде всего необходимо понимать, что токсины, большинство которых образуются грибами рода Fusarium, Pénicillium, Aspergillus и др., относятся, как известно, к «вторичным метаболитам» наряду с антибиотиками, пигментами, каротиноидами, для бактерий - полипептидами, нуклеозидами, витаминами. Для этой группы веществ различной структуры характерно одно общее свойство - они образуются в условиях замедления роста продуцентов, поэтому «вторичны». Почему они образуются именно в этот период: III - IV фаза развития грибов и «стационарная» фаза бактерий? После долгих дискуссий ученые пришли к выводу, что активный синтез «вторичных» метаболитов - это вынужденная реакция клетки - утилизировать и запасать в определенной структурной форме (эволюционно обозначенной для каждого вида) значительный избыток углеводов, белков, полисахаридов, липидов, невостребованных для процессов роста и в ряде случаев токсичных для самого продуцента. «Вторичные метаболиты» обладают антагонизмом как в отношении различных микроорганизмов, так и в отношении макроорганизма сельскохозяйственных животных и птицы. Поэтому термин «токсины» является достаточно условным и во многом зависит от дозы. Очень показательный пример с продуцентом Pénicillium patulum, который образует одновременно два метаболита: патулин - хорошо известный токсин для сельскохозяйственных животных и птицы и гризеофульвин - противогрибковый антибиотик, используемый в медицине, который при длительном применении также обладает токсическим действием.
В последней фазе развития продуцента, при снижении содержания углеводов до 0,3 - 0,4% происходит деградация обоих метаболитов с различной скоростью, то есть эти продукты в условиях голодания культуры используются в качестве источников углерода и энергии. Из практики хорошо известно, что вторичные метаболиты - антибиотики - быстро деградируют в условиях голодания продуцентов по глюкозе. Также установлено, что в условиях обсемененности целевых продуктов происходит их значительная деградация при хранении. Мы предположили, что при создании голодных условий в рубце коров и кишечнике моногастричных токсины, поступающие с кормом, могут разрушаться микробным сообществом. Каким образом можно создать такие условия? Мы провели серию исследований, выбрав в качестве модели группу коров в раздое в весенний период, когда силос (и корм) имеют значительную нагрузку по токсинам. В качестве контроля использовали группу коров в раздое с
42 Корма и кормление
шшш. agroyug.ru
Рисунок 2. Лактационная кривая при введении в рацион «Фунгистат-ГПК» на фоне повышенной нагрУзки токсинов.
Рисунок 3. Промывка навоза на анализаторе переваривания «NASCO».
низкой нагрузкой по токсинам (свежий силос). Обе группы животных находились на концентратном кормлении, соответственно, с прогнозируемыми результатами.
На рис. 2 приведены данные по «персистентно-сти» лактационных кривых, из которых видно, что устойчивость лактационной кривой не превышает 75%, [рис. 2 кривая 1], причем в условиях повышенной токсичности заметно ниже [рис. 2 кривая 2]. В обеих группах мы наблюдаем низкую биоусвояемость концентратов и грубых кормов, тогда как при введении «Фунгистат ГПК» достигалась идеальная биоусвояемость (Рис. 3).
Промывка имеет идеальные пропорции: верхнее сито - полностью переваренная клетчатка, среднее сито - нормально сформированный мат, нижнее сито - полностью переваренная мелкая не усваиваемая фракция.
Это вполне объяснимо, если принять во внимание депрессирующую роль глюкозы в рубце, эффект токсинов в отношении роста микробиоты и, как конечный результат, инсулинрезистентность и снижение молочной продуктивности. Как было ранее установлено, начало деструкции «вторичных метаболитов» коррелирует со снижением концентрации легкоусвояемых углеводов до 0,3-0,4% и повышением рН в культуральной жидкости. Поскольку в рубце коровы и кишечнике моногастричных имеет место совместное культивирование многих видов микробиоты, необходимо создать условия для возникновения давно известного феномена «диаук-сии», когда снижение концентрации глюкозы и её катаболитов до определенного уровня индуцирует активность ферментных систем, расщепляющих более сложные молекулы, в том числе «вторичные метаболиты», к которым относятся и токсины. С целью анализа ситуации мы внедрили датчики рН в рубец сухостойных коров и далее наблюдали динамику рН [рис. 4] в раздое.
Как оказалось, в обеих группах раздойных коров рН находился в кислой зоне в течение длительного времени, что коррелировало с низкой биоусвояемостью и наличием признаков ацидоза в рубце. Очевидно, что в присутствии только лактата в рубце уже не может быть проявлений «диауксии», в том числе деградации сложных молекул, а, следовательно, и деградации токсинов. Далее мы усилили состав «Фунгистат - ГПК» незаменимыми факторами роста микробиоты, в том числе для лак-тат-утилизаторов, пребиотиками и пробиотиками и подобрали дозировку продукта, наблюдая за изменением биоусвояемости и динамикой рН в группе коров с повышенной токсичной нагрузкой. В итоге мы получили необходимую форму изменения рН в рубце (рис. 5), когда быстро накапливаются кислые продукты (снижение рН до 6,4-6,6), которые затем утилизируются в системе биогенеза молока, при этом рН возрастает до 6,9-7,2.
Мы полагаем, что это могут быть уже частично условия голода, способствующие проявлению «диауксии» и распаду сложных молекул, в том числе токсинов. Полученный автоколебательный процесс изменений рН обеспечивает хорошую биоусвояемость (рис. 3) и заметно улучшенный (до 85 %) характер «персистентности» лактационной кривой (рис. 2, кривая 2), что соответственно повысило и молочную продуктивность. Это, на наш взгляд, можно объяснить усилением активности микробиоты рубца в отношении токсинов. Полученные результаты показывают, что улучшенная композиция «Фунгистата - ГПК» позволила в дополнение к сорбционной активности задействовать естественный эффективный механизм деградации токсинов, используя активированную микробиоту рубца.
Рисунок 4. Динамика рН в рубце в условиях низкой и высокой нагрузках токсинов.
Рисунок 5. Схема изменений рН в рубце при введении в рацион «Фунгистат ГПК» новой композиции.
