CC BY
30Journal of Siberian Federal University. Biology 2 (2015 8) 220-235
УДК 579.222
To the Question About Intracellular Polyhydroxybutyrate Degradation
Natalia O. Zhilaab, Galina S. Kalacheva*a,b and Tatiana G. Volovaa,b
aInstitute of Biophysics SB RAS 50/50 Akademgorodok, Krasnoyarsk, 660036, Russia
bSiberian Federal University 79 Svobodny, Krasnoyarsk, 660041, Russia
Received 12.01.2015, received in revised form 19.02.2015, accepted 18.04.2015
The investigation of dynamics of 1,214С-acetate flows was carried out in three different regimes of bacteria Cupriavidus eutrophus B-10646 biosynthesis on fructose and acetate: a) in the phase of accumulation of polyhydroxybutyrate; b) in the phase of intracellular PHB degradation and the synthesis of nitrogen compounds; c) in the phase of resynthesis of PHB. It has been shown that in regime of PHB accumulation 80 % of labeled carbon was used for synthesis of PHB. At the condition of PHB degradation both synthesis and degradation take place simultaneously. This confirms the cyclic nature of PHB methabolism.
Keywords: cupriavidus eutrophus B-10646, 1,214С-acetate, polyhydroxybutyrate, biosynthesis, intracellular degradation.
DOI: 10.17516/1997-1389-2015-8-2-220-235.
© Siberian Federal University. All rights reserved
* Corresponding author E-mail address: kalach@ibp.ru
К вопросу о внутриклеточной деградации полигидроксибутирата
Н.О. Жилаа б, Г.С. Калачеваа б, Т.Г. Воловаа б
аИнститут биофизики СО РАН Россия, 660036, Красноярск, Академгородок, 50/50 бСибирский федеральный университет Россия, 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79
Исследованы в динамике потоки меченого углеродного субстрата (1,214С-ацетата) в меняющихся режимах биосинтеза бактерий Cupriavidus eutrophus В-10646 при росте на фруктозе и ацетате: а) в ходе накопления запасного соединения - полигидроксибутирата (ПГБ), б) эндогенной деградации ПГБ и синтеза азотсодержащих компонентов, в) ресинтеза ПГБ. Показано, что при выращивании бактерий С. eutrophus В-10646 в режиме аккумуляции ПГБ на фруктозе и ацетате в период накопления полимера в среднем около 80 % радиоуглерода направляется на его синтез. Установлено, что в условиях, благоприятных для внутриклеточной деградации ПГБ, также происходит синтез полимера, что подтверждает предположение об одновременном синтезе и деградации полимера в клетках бактерий.
Ключевые слова: Cupriavidus eutrophus В-10646, 1,214С-ацетат, полигидроксибутират, биосинтез, внутриклеточная деградация.
Введение
Полигидроксиалканоаты (ПГА), активно изучаемые в настоящее время в связи с их биодеградируемостью, относятся к резервным макромолекулам и образуются прокариотами при несбалансированном росте как эндогенное депо энергии и углерода. ПГА синтезируются в ходе сложного многоступенчатого биосинтетического процесса, каждую стадию которого катализируют специфические ферменты. Синтез ПГА в общих чертах сходен у различных микроорганизмов, но наиболее изучены пути синтеза полигидроксибутирата (ПГБ) у типового штамма КаЫота вихорка Ш6 в различных условиях несбалансированного роста (Lee, 1996; Fukui et э1., 2013; Shimizu et э1., 2013; Przybylsky et Э1., 2015).
Биосинтез ПГБ начинается с конденсации двух молекул ацетил-КoA до
ацетоацетил-КoA, восстанавливающийся затем до D(-)-3-гидроксибутирил-КoA и далее включающийся в полимерную цепь. Все эти этапы катализируются в основном тремя ферментами: ß-кетотиолазой, НАДФH зависимой ацетоацетил-КоА-редуктазой и ПГБ-полимеразой (синтазой) (Haywood et al., 1989). Факторы, регулирующие их активности на генетическом и молекулярном уровнях, интенсивно изучаются, и считается, что ß-кетотиолаза запускает синтез полимера, ре-дуктаза регулирует скорость синтеза ПГБ, а синтаза отвечает за качественные характеристики полимера (молекулярный вес, мономерный состав) и конечный выход ПГА (Lawrence et al., 2005; Fukui et al., 2013; Sznajder et al., 2015).
Однако процесс формирования полимера достаточно сложен и определяется не только
ферментами синтетической ветви цикла ПГА, но и другими аспектами полимерного метаболизма. Не менее важной представляется роль ферментов деполимеризующей ветви цикла ПГА, которые могут регулировать как молекулярный вес ПГА, так и его конечный выход. Однако процесс внутриклеточной деградации ПГБ менее изучен. Деградация ПГА происходит через гидролиз и тиолиз. Последняя реакция является результатом действия ПГА-синтазы, но в обратном направлении. Впервые возможность участия ПГА-синтазы не только в синтезе, но и в деградации полимера показана в работе Uchino and Saito (2006). Но физиологическая значимость этой реакции пока не ясна.
Гидролиз и тиолиз полимера происходят под действием ПГА-деполимераз. Впервые деполимеразный ген в Ralstonia eutropha Н16 был клонирован в 2001 г. (Saeguse et al., 2001), а в 2003 г. были охарактеризованы еще 3 депо-лимеразы (York et al., 2003). В настоящее время известно 7 типов деполимераз, две из них (phaZl and phaZ6) активно экспрессируются в фазу аккумуляции ПГА (Lawrence et al., 2005; Shimizu et al., 2013; Sznajder et al., 2015). В процессе гидролиза полимера образуются мономеры и олигомеры. Последние разрушаются до мономеров под действием гидролаз. В Ralstonia eutropha обнаружены две гидролазы, участвующие в разрушении олигоме-ров (Kobayashi et al., 2005).
Существует достаточно много фактов, свидетельствующих о том, что синтез и деградация полимера в клетке происходят одновременно. Впервые предположение о циклической природе метаболизма ПГА в Alkaligenus eutrophus было высказано Дои с соавторами (Doi et al., 1990), которые показали, что перенос культуры, выращенной на пентановой кислоте, а следовательно, синтезирующей ПГА с высоким содержанием 3-гироксивале-
рата (3-ГВ) - до 49 мол % в ПГА, на среду с бутиратом происходит заметное снижение фракции 3-ГВ в полимере (до 19 %) без изменения его содержания в клетке. Аналогичные результаты для бактерий R. eutropha NCIMB 11599 были получены Шенгом с соавторами (Shang et al., 2005). В работе (Taidi et al., 1995) в опытах с A. eutrophus NSMB40529 и меченой глюкозой выявлено, что накопление метки в полимере продолжалось даже после прекращения его аккумуляции. Кроме того, показано, что в процессе синтеза полимера происходила постепенная замена полимера с высокой молекулярной массой полимером с более низкой молекулярной массой. Однако в работе Хэйвуда с соавторами (Haywood et al., 1989) доказательств существования одновременного синтеза и деградации ПГБ у бактерий A. eutrophus, культивируемых в хемостате, находящихся в устойчивом состоянии лимитиро -вания азотом, не получено. Нами установлено, что в период накопления полимера в клетках активность деполимеризующих полимер ферментов (ПГБ-деполимеразы и гидроксибути-ратдегидрогеназы) была низкой и проявлялась только при стимулировании эндогенной деградации ПГБ (культивирование бактерий при лимите или отсутствии экзогенного источ -ника углерода и энергии) (Volova et al., 2004). Противоречивость данных разных авторов была несколько разрешена недавней работой Учино с соавторами (Uchino et al., 2007), которые показали, что в нативных гранулах полимера, во-первых, локализуются все ферменты синтеза полимера (^-кетотиолаза, редуктаза и синтаза) и деполимераза PhaZa1, обладающая тиолазной активностью, продуктом реакции которой является 3-НВ-СоА. Следовательно, деградация полимера является энергонезависимым процессом и может происходить одновременно с его синтезом. Во-вторых, баланс между синтезом и деградацией полимера
регулируется внутриклеточными концентрациями ключевых метаболитов - KoA, ацетил-КоА, 3HB-KoA, НАД+/НАД, т.е. на субстратном уровне. В более ранней работе (Handrick et al., 2000) авторы предсказали возможность регулирования активностей синтазы и де-полимеразы в зависимости от концентраций специфических субстратов - 3HB-K0A - для синтазы и ПГБ - для деполимеразы. Авторы предположили, что эти ферменты могут отвечать за сбалансированные изменения потока углерода, исходящие из углеводного субстрата через ацетил-КоА. Если клетка при росте не испытывает дефицита в углероде, уровень ацетил-КоА выше его потребления, активность синтазы будет высока, а активность де-полимеразной ветви будет снижена, что стимулирует синтез ПГБ. Снижение поступления углеродного субстрата приведет к снижению концентрации ацетил-КоА, и, следовательно, будет повышаться активность деполимераз, поэтому необходимо изучать механизм регуляции активностей этих двух ветвей одновременно в условиях синтеза и деградации ПГБ.
Понимание механизмов взаимодействия двух ветвей метаболизма ПГА важно для направленного изменения свойств и структур синтезируемых клетками полимеров. Одним из подходов к изучению этих взаимодействий является выяснение внутриклеточного распределения меченого субстрата в процессе роста бактерий в условиях синтеза и деградации полимера.
Публикации, посвященные анализу метаболических путей цикла ПГБ с применением меченого субстрата, немногочисленны. В работе (Haywood et al., 1989) было исследовано включение 14C в Alcaligenes eutrophus NCIB 11599. Авторы показали, что динамика включения радиоуглерода в полимер аналогична динамике биомассы. Учино с соавтора-
ми (Uchino et al., 2007) использовали меченый ацетил-КоА для доказательств способности нативных ПГБ гранул катализировать все реакции, приводящие к синтезу полимера. С помощью меченого 14С-ПГБ авторы показали тиолазную активность ПГБ-синтазы (Uchino and Saito, 2006). В работе Shimizu et al. (2013) был использован NaH13CO3 для выяснения роли цикла Кальвина в синтезе ПГБ. При исследовании закономерностей образования сополимеров 3-HB/3-HV метилотрофными бактериями в присутствии меченых по углероду ко-субстратов (пропионата и валерата) показано, что количество радиоуглерода в сополимере от общего количества радиоактивности, найденной в биомассе, может составлять от 16 до 69 % (Korotkova et al., 1999). Других данных по изучению метаболизма ПГА микроорганизмов с мечеными субстратами в доступной нам литературе не найдено.
Целью настоящей работы было исследование распределения радиоуглерода среди макромолекул у бактерий Cupriavidus eutrophus B-10646 при аккумуляции и эндогенной деградации полигидроксибутирата.
Материалы и методы
Исследован штамм Cupriavidus eutrophus B-10646 (ранее Alcaligenus, Ralstonia, Wautersia, Cupriavidus) (Vaneechoutte et al., 2004), депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Волова, Шишацкая, 2012). Штамм имеет широкий органотрофный потенциал и может использовать большой спектр органических субстратов. C. eutrophus B-10646 толерантен к ряду органических субстратов, таких как валериат, гексаноат, бутиролактон в концентрациях от 3 до 5 г/л в культураль-ной среде, которые используются для синтеза коротко- и среднецепочечных ПГА (Волова, Шишацкая, 2012; Volova et al., 2014).
Условия культивирования
Культивирование бактерий C. eutrophus B-10646 проводили в колбах объемом 1 л на минеральной среде Шлегеля следующего состава (г/л): Na2HPO4 ■ H2O - 9.1; KH2PO4 - 1.5; MgSÜ4 ■ H2O - 0.2; Fe3C6H5O7 ■ 7H2O - 0.25; NH4Cl - 1.0 (Schlegel et al., 1961). Микроэлементы вводили по прописи Хоагланда из расчета 3 мл стандартного раствора на 1 л среды. Стандартный раствор микроэлементов содержит (г/л): H3BO3 - 1.5; CoCl2 ■ 6H2O - 0.03; CuSO4 ■ 5H2O - 0.008; MnCl2 ■ 4H2O - 0.008; ZnSO4 ■ 7H2O - 0.176; NaMoO4 ■ 2H2O - 0.05; NiCl2 - 0.008.
Бактерии выращивали в режиме синтеза и деградации полимера (Волова и др., 1992; Kalacheva and Volova, 2007). На первом этапе бактерии культивировали с лимитированным содержанием азота в среде (50 % от потребностей культуры в элементе) в режиме максимальной аккумуляции полимера. На втором этапе добавляли в культуру хлорид аммония (1 г/л) для инициирования процесса деградации полимера; третий этап аналогичен первому (после исчерпания NH4Cl снова были созданы условия для накопления полимера). Проведено три эксперимента. В первом эксперименте в качестве углеродного субстрата использовали фруктозу, поддерживая ее концентрацию в среде на уровне 10-13 г/л и снижая до 5 г/л в фазу деградации полимера. В остальных экспериментах в качестве углеродного субстрата использовали ацетат натрия (5 г/л). рН среды поддерживали на уровне 7.0 - 7.2 добавлением в среду титрующего агента (100 мл СН3СООН/л дистиллированной воды); pH среды измеряли рН-метром (рН-Meter 766, Calimatic, Germany).
В первом и втором экспериментах в культуру бактерий вносили меченый углеродный субстрат (1,2-14С-ацетат) на стадии синтеза полимера (24-й час культивирова-
ния), а в третьем эксперименте - на стадии внутриклеточной деградации (115-й час культивирования) - 0.02 и 0.04 мкКи/мл соответственно. Пробы культуры для анализов отбирали через 0.5, 1 и 2 ч после добавления метки; далее отбор проб производили через 10-28 ч в течение экспериментов. При наступлении третьей фазы эксперимента культивирование продолжали 38-75 ч. Анализировали динамику радиоактивности культуральной среды, биомассы, липидов, полимера и «активной» биомассы (биомасса без липидов и полимера).
Аналитические методы
Биомассу культуры определяли по весу сухого вещества и измерением оптической плотности. Содержание аммонийного азота в культуральной среде определяли с реактивом Несслера. Концентрацию глюкозы - в среде резорциновым методом.
Содержание полимера в биомассе измеряли хроматографией метиловых эфиров жирных кислот после метанолиза проб сухой биомассы на хромато-масс-спектрометре (7890/5975C, Agilent Technologies, U.S.) (Brandl et al., 1988), используя в качестве внутреннего стандарта бензойную кислоту, и весовым методом после экстракции хлороформом и осаждения гексаном.
Молекулярный вес ПГБ исследовали гель-проникающей хроматографией (модель 1260 Infinity, Agilent Technologies, США) с рефрактометрическим детектором, используя колонку Agilent PLgel Mixed-C. В качестве элюента был применен хлороформ. Калибровка проводилась по полисте-риновым стандартам (Fluka, Швейцария, Германия). Были определены средневесовая молекулярная масса - Mw, среднечисловая молекулярная масса - Mn и полидисперсность (D = Mw/Mn).
Липиды и полимер из биомассы выделяли смесью хлороформа и метанола (2:1, по объему). Полимер отделяли от липидов осаждением двойным объемом гексана (^лачева, Волова, 2007). Полученный экстракт липидов переносили в предварительно взвешенную колбу, растворитель отгоняли на роторном испарителе, доводили в эксикаторе до постоянного веса и взвешивали.
Определенный объем культуральной среды, биомассу, полимер, липиды и «активную» биомассу, предварительно взвешенные, помещали в пластиковые виалы ("Perkin Elmer/ Packard", США) с 10 мл сцинтилляционного раствора (10 г 2.5 - дифенилоксазола, 0.25 г 1,3-ди-2,5-фенилоксазолил бензола, 100 г нафталина в 1 л диоксана). Радиоактивность проб измеряли на сцинтилляционном счетчике Tri-Carb 2100 TR («Packard Instrument Company», США).
Результаты и обсуждение
Рост культуры на фруктозе
Длительность эксперимента на фруктозе составила 256 ч. Периодичность отбора проб была следующей: первый отбор проб произвели при плотности биомассы около 1 г/л, затем через 24 ч, когда плотность биомассы составила около 2.5 г/л, был добавлен меченый ацетат и в течение часа были отобраны две пробы. Затем периодичность отбора проб составила 24-28 ч.
Содержание основных субстратов в среде показано на рис. 1а. В течение роста концентрация фруктозы поддерживалась на уровне 10-13 г/л, но в период эндогенной деградации полимера содержание этого субстрата было снижено приблизительно в 2 раза (до 5-6 г/л), а затем возвращено к исходным значениям. Содержание азота в среде к началу активного синтеза полимера снижалось с 1 г/л до аналитического нуля. На втором этапе культивиро-
вания после однократного внесения хлористого аммония концентрация азота поднималась до исходного уровня, а затем в течение 72 ч снова падала до нуля (рис. 1а).
Кривые роста и динамика накопления ПГБ у бактерии C. eutrophus B-10646, выращиваемой на фруктозе в режиме, позволившем организовать смену направленности синтеза основных (азотсодержащие компоненты) и запасных (полигидроксибутират) клеточных макромолекул, представлены на рис. 1б. В течение первого периода (41-136 ч) были созданы условия для аккумуляции полимера в клетках (дефицит азота в среде). Во втором периоде роста (136-208 ч) на полной питательной среде происходила эндогенная деградация полимера; на третьем этапе после исчерпания азота из культуральной среды (208-256 ч) происходил ресинтез полимера, а затем его деградация, связанная с прекращением роста культуры и ее гибелью.
Концентрация биомассы несущественно возрастала в течение 100 ч культивирования и не превышала 4 г/л. После внесения в среду азота на 136-й час эксперимента биомасса увеличилась более чем в 2 раза (с 4 до 9 г/л). По мере исчерпания в среде азота рост клеток прекратился и концентрация биомассы несколько снизилась - до 7.3 г/л и оставалась на этом уровне до конца эксперимента (рис. 1б). В начале роста азотсодержащие вещества клетки составляли более 60 % от сухого веса биомассы, а содержание полимера не превышало 22 % (рис. 1б). По мере исчерпания в среде азота происходили существенные изменения в составе биомассы. Уровень полимера в биомассе возрастал до 80-88 % (или с 0.2 до 3.9 г/л), при этом содержание общего азота снижалось до 1.2-2 % или 8-12 % белка. На втором этапе опыта, после добавления в среду хлорида аммония, были созданы условия для перераспределения углерода, запасенного в
Рис. 1. Содержание в культуральной среде фруктозы (г/л), азота (г/л) и 1,2-14С-ацетата (МБк/мин/мл) (а) и показатели культуры бактерий (б) (1 - биомасса, г/л; 2 - ПГБ, %; 3 - «активная» биомасса, г/л; 4 - ПГА, г/л; 5 - липиды, г/л) при выращивании Cupriavidus еШгоркт В-10646 при смене режимов биосинтеза (I), внутриклеточной деградации (II) и ресинтеза ПГБ (III). Стрелками показано добавление в культуру 1,2-14С-ацетата и хлорида аммония
полимере, в другие синтетические пути. При этом содержание полимера в биомассе снизилось до 40 % и увеличивалось содержание азотистых компонентов клетки (до 4.5 % общего азота или 25 % белка). После исчерпания в среде азота снова наблюдался ресинтез полимера и снижение в клетках общего азота. Следует отметить, что изменяющиеся ростовые условия существенно влияли на соотношение полимера и общего азота в клетках, при этом
содержание липидов оставалось практически постоянным на протяжении всего опыта и составляло 5-7 % от сухого вещества.
На фоне этих изменений было измерено распределение активности в культураль-ной среде, биомассе и отдельных фракциях клетки. В течение первых 2 часов культивирования после внесения 1,2-14С-ацетата количество меченого углерода в культуральной среде резко упало с 1776 до 10-12 Бк/мин/мл
2 8000-X
| 6000 ■ X LO
4000 -2000 ■ 0 "
^ 14000-
=n S
g 1000060002000-
I 6000
X X
g 40002000 0
250
s
ш 150
50 0
ll
■ ■
■ I.
24.5 26 50 74 96 1 22 146 1 70 194 218 242
I
I
. И .та.
Дд
Время, ч
й. 'р».И а.й
24.5 26 50 74 96 122 146 170 194 '218 242
В
Время, ч
8 И В I
24.5 26 50 74 96 122 146 170 194 210 242
' 1 Время, ч
I '
I
Я
I
й й
ш
л
24.5 26
50
74
96 122 146 170 194 218 24?
Время, Ч
Рис. 2. Динамика удельной активности радиоуглерода в биомассе Cupriavidus eutrophus B-10646 (а), «активной» биомассе (б), ПГБ (в) и липидах (г) при смене режимов биосинтеза (I), деградации (II), ресинтеза ПГБ (III)
(рис. 1). Метка практически сразу же начала включаться в биомассу (рис. 2а) и в первую очередь во фракцию липидов (рис. 2г). Затем отмечалось появление метки в «активной» биомассе (рис. 2б) и только после 40 часов роста культуры меченый углерод активно начал включаться в полимер и уровень включения 14С возрастал вплоть до перехода культуры на 2-й этап роста на полной питательной среде (рис. 2в), сопровождающий деградацией полимера и активизацией синтеза азотсодержа-
щих соединений. Включение радиоуглерода в полимер уменьшилось (рис. 2в) на фоне существенного увеличения метки в «активной» биомассе (рис. 2б).
На третьем этапе (начиная с 208 ч) после исчерпания азота в культуре снова были созданы условия для накопления в клетках полимера. Культивирование бактерий на среде без азота сопровождалось сначала увеличением пула полимера от 40 до 72 %, однако в дальнейшем синтез полимера прекратился,
Рис. 3. Распределение радиоуглерода среди липидов, полимера и «активной» биомассы бактерий Cupriavidus еШгоркт В-10646 при выращивании на фруктозе при смене режимов «синтез (I) -деградация (II) - ресинтез (III) ПГБ»
его содержание в клетках снизилось до 50 % и оставалось на этом уровне до конца эксперимента. Практически не менялась концентрация и «активной» биомассы. Увеличение 14С в полимере и соответствующее снижение метки в «активной» биомассе отмечалось только на 208-м часу роста культуры, далее содержание метки в этих фракциях снижалось и мало изменялось до конца опыта (рис. 2).
На рис. 3 показано относительное распределение радиоуглерода среди фракций макромолекул - липидов, полимера и «активной» биомассы - при смене режимов «синтез-деградация-ресинтез» полигидроксибутирата (рис. 3). В первой точке отбора проб метка в первую очередь включалась в липиды и «активную» биомассу. И только через 0.5 ч после
добавления метки наблюдалось небольшое включение 14С в полимер. По мере возрастания пула полимера в клетках концентрирование радиоуглерода в этой фракции увеличивалось (более 85 %) на фоне снижения радиоактивности в «активной» биомассе (до 11.5 %). На втором этапе эксперимента, в период деградации полимера, наблюдалось снижение доли радиоактивности во фракции полимера (до 3 %) и увеличением доли 14С в «активной» биомассе (до 96 %) (рис 3). При переходе клеток в третий период роста культуры, после исчерпания азота в среде, ресин-тез полимера сопровождался увеличением доли меченого углерода во фракции полимера и снижением доли метки в «активной» биомассе. Такое распределение было кратковре-
Таблица 1. Среднечисловая молекулярная масса (Мп), средневесовая молекулярная масса (Mw) и полидисперсность (В) полимера, полученного при выращивании Cupriavidus вutrophus В-10646 при смене режимов «синтез(1)-деградация(П)-ресинтез(Ш)» полигидроксибутирата при выращивании на фруктозе
Час (этап) Mn, Da Mw, Da В
98 (I этап) 308759 ± 5860 664503 ± 19945 2.15 ± 0.005
116 (I этап) 251053±664 814376 ± 15926 3.25 ± 0.070
160 (II этап) 203773 ± 8163 667977 ± 21833 3.28 ± 0.025
170 (II этап) 110475 ± 74 356012 ±2009 3.23 ± 0.015
208 (III этап) 241102 ± 692 610957±1890 2.54 ± 0.015
242 (III этап) 109156±692 309765 ±1890 2.84 ± 0.015
256 (III этап) 156922 ± 4474 422885 ± 15566 2.69 ± 0.025
менным, и в последние часы роста культуры относительное содержание меченого углерода в полимере снижалось, а в активной биомассе увеличивалось, что может свидетельствовать о деградации полимера в конце эксперимента.
Таким образом, при эндогенной деградации полимера основной поток углеродсо-держащих продуктов, образующихся при его деградации, перенаправлялся на синтез азотсодержащих соединений и, наоборот, при исчерпании азота наступала фаза ресинтеза полимера. В период эндогенной деградации полимера его содержание в клетках снижалось (от 88 до 40 %), при этом молекулярная масса в течение короткого периода времени (6-12 ч) могла резко снизиться в 2-3 раза (от 814 до 300 кДа) (табл. 1). Эти результаты важны для технологии получения ПГБ как в части общих выходов ПГБ, так и его характеристик.
Рост культуры на ацетате
Рост бактерий С. eutrophus В-10646 на ацетате отличался от роста этих бактерий на фруктозе. Во-первых, бактерии росли менее интенсивно и максимальное накопление биомассы составляло 4.5-4.7 г/л сухого вещества
(рис. 4, 5). Во-вторых, в двух сериях экспериментов на ацетате азот в среде до конца не использовался и в фазу синтеза полимера составлял 0.2 г/л (рис. 4, 5).
Во втором эксперименте 1,2-14С-ацетат был добавлен на 23-й час роста культуры, в период начала синтеза ПГБ, как и на фруктозе, а в 3-м эксперименте - на 115-й час, в фазу деградации ПГБ. Все показатели роста культуры в этих двух опытах практически не различались (рис. 4 и 5).
Максимальных значений биомасса (до 4.5-4.7 г/л) достигала в фазу деградации ПГБ, а затем незначительно падала до 3.9 г/л в фазу ресинтеза полимера и оставалась на этом уровне до конца опытов. Концентрация ПГБ увеличивалась в клетках с 22.4 % до 71-73 % на первом этапе роста (фаза накопления полимера), снижалась до 49.0 % в период деградации полимера (2-й этап) и опять возрастала до 70 % на последнем этапе роста бактерий, но к концу эксперимента снижалась до 46-55 % (рис. 4, 5).
Во втором эксперименте в течение первого часа культивирования после добавления 1,2-14С-ацетата в начале роста (23-й час) количество меченого углерода в культуральной среде снизилось незначительно, и только к
- i 00 -
- 80 - 60 40 - 20 - 0
0 20 40 50 00 100 120 140 160 130 200 220 240 260
Время, ч
^ I0C0-
1 300" £ Lfi
S00' 4002000
I
.IT-. Пд
0 23; 24 25 41 60 05 1 15 1 30 163;-1 85 211 235 260
I-; s 1200-
'î 1000-
"2
LH 800-
600-
400
200-
0-
% 100-
80-
60-
40
20-
0-
В
Время, ч
23 24 '25 Ш 63 35 11 5 13S 163 '185 21Г 235 2G0
0 23 24 25 41 63 05 115 133 163 185 211 235 280
Время, ч
Рис. 4. Показатели культуры Cupriavidus eutrophus B-10646 при выращивании на ацетате (А) (1 - биомасса, г/л; 2 - ПГБ, %; 3 - «активная» биомасса, г/л; 4 - ПГА, г/л; 5 - азот в среде, г/л); Б - динамика удельной активности радиоуглерода в биомассе (П), «активной» биомассе (|Д) и ПГБ (НХ В - в культуральной среде (Щ); Г - распределение радиоуглерода среди «активной» биомассы (Н) и ПГБ (Ц) при смене режимов биосинтеза (I), деградации (II) и ресинтеза (III) полимера
41-му часу роста бактерий упало в 6.0 раз, с 1200 до 200 Бк/мин/мл, продолжая снижаться до 100 Бк/мин/мл в конце эксперимента (рис. 4в).
Динамика изменения радиоактивности полимера и «активной» биомассы представлена на рис. 4б. В отличие от эксперимента на фруктозе уже через час после добавления
Рис. 5. Показатели культуры Cupriavidus eutrophus B-10646 при выращивании на ацетате, 1,2-14С-ацетат добавлен в период деградации полимера (А) (1 - биомасса, г/л; 2 - ПГБ, %; 3 - «активная» биомасса, г/л; 4 -ПГА, г/л; 5 - азот в среде, г/л); Б - динамика удельной активности радиоуглерода в «активной» биомассе и ПГБ; В - в культуральной среде; Г - распределение радиоуглерода среди «активной» биомассы и ПГБ при смене режимов биосинтеза (I), деградации (II), ресинтеза (III) ПГБ
меченого ацетата 14С был зафиксирован как в «активной биомассе», так и в полимере (рис. 4б). Причем доля радиоуглерода оставалась всегда выше в полимере, чем в «ак-
тивной» биомассе на протяжении всего эксперимента (рис. 4б). Отмечалось снижение радиоактивности в полимере на втором этапе опыта в период деградации с 92 до 72 % и со-
ответствующее увеличение в «активной» биомассе с 8 до 28 % (рис. 4г). На третьем этапе эксперимента все показатели включения 14С в полимер и «активную» биомассу вернулись на уровень этапа синетеза полимера, т.е. потоки углерода из системы синтеза основных соединений снова перераспределились на образование полимера.
Вероятность одновременного синтеза и деградации полимера, неоднократно высказываемая рядом исследователей (Doi et а1., 1990; Taidi et а1., 1995; Shang et а1., 2005), была проверена в эксперименте, заключающемся в добавлении 1,2-14С-ацетата в культуру бактерий в период эндогенной деградации полимера (рис. 5). Установлено, что уже через час после добавления меченого ацетата 14С был зафиксирован как в «активной биомассе», так и в полимере. К концу первого часа культивирования после добавления 1,2-14С-ацетата количество меченого углерода в культураль-ной среде составило около 20 000 Бк/мин/мл и сохранялось на этом уровне в течение 22 ч роста культуры, а затем снизилось практически в 2 раза до 10 000 Бк/мин/мл и не менялось в течение последующих 23 ч. На 211-й час культивирования произошло снижение радиоактивности в культуральной среды до 200 Бк/ мин/мл, которая оставалась на этом уровне до конца 3-го этапа эксперимента.
В период внутриклеточной деградации полимера должен реализоваться синтез азотсодержащих соединений, поэтому вполне логично включение 14С в «активную биомассу». Однако на данном этапе, когда происходила деградация полимера, зафиксировано включение радиоуглерода в ПГБ, что свидетельствует об одновременной деградации и синтезе полимера. Показано, что через 1-2 ч после добавления метки основная доля радиоактивности сосредоточена в полимере (до 70 %) (рис. 5г). В течение последующей деградации
полимера (до 162 ч) отмечено снижение относительной радиоактивности ПГБ и увеличение доли в «активной» биомассе (соответственно с 70 до 24 и с 30 до 76 %). На третьем этапе (начиная с 185 ч) после снижения азота в культуральной среде снова были созданы условия для накопления в клетках полимера. В результате ресинтеза полимера на этом этапе произошло перераспределение 14C: доля радиоуглерода во фракции азотсодержащих веществ снизилась до 5 %, а в пуле полимера, напротив, увеличивалась до 95 %. Таким образом, потоки углерода из системы синтеза основных соединений перераспределились на образование полимера.
Известно, что бактериальные клетки, использующие ацетат в качестве основного ростового субстрата, синтезируют все клеточные макромолекулы и поддерживают энергетический статус через цикл трикарбо-новых кислот (ЦТК). Это показано в серии работ, в которых описана динамика синтеза ПГА на ацетате различными микробными культурами. При анализе метаболических путей углерода у бактерий A. eutrophus H16 (ATCC 17699) при росте на ацетате было показано, что в условиях лимита по азоту около 50 % субстрата направляется на синтез полимера, около 40 % теряется с CO2 и только около 15 % идет на синтез других компонентов клетки (Shi et al., 1997). Подобные результаты получены при росте метилотрофных бактерий Methylobacterium extorquens на 214С-ацетате в азот-дефицитных условиях: 54 % радиоуглерода обнаружено в CO2, 35 % - в полимере, 11 % - в биомассе (Korotkova et al., 1999). Поэтому не удивительно, что в наших экспериментах на ацетате доля включения метки в полимер значительно превышала уровень включения 14С в «активную» биомассу. А в период накопления полимера в C. eutrophus B-10646 основная часть 14C (более 80 % ра-
диоуглерода) идет на синтез полимера, около 20 % - на синтез азотсодержащих веществ. В период деградации полимера, как показано, происходил одновременно и его синтез, что согласуется с циклической природой метаболизма полимера в бактериях (Doi et а1., 1990; Taidi et а1., 1995; Shang et а1., 2005).
Заключение
Показано, что при эндогенной деградации полимера основной поток углеродсо-держащих продуктов, образующихся при его деградации, перенаправляется на синтез азотсодержащих соединений и, наобо-
рот, при исчерпании азота наступает фаза ресинтеза полимера. В период эндогенной деградации полимера его содержание в клетках может резко снизиться (от 70-80 до 40-50 % и менее), при этом молекулярная масса в течение короткого периода времени (6-12 ч) резко падает в 2-3 раза (от 800400 до 150 кДа и менее). Синтез полимера у бактерии С. eutrophus В-10646 происходит не только в условиях, оптимальных для его накопления (дефицит азота), но и во время внутриклеточной деградации полимера, что подтверждает предположение циклической природы метаболизма ПГБ.
Работа выполнена за счет средств государственного задания на проведение фундаментальных исследований РАН (проект № гос. регистрации 01201351505).
Список литературы
1. Волова Т.Г., Калачева Г.С., Константинова В.М., Пузырь А.П. (1992) Влияние условий роста на накопление полиоксибутирата водородными бактериями. Прикладная биохимия и микробиология 28: 221-232 [Volova T.G., Kalacheva G.S., Konstantinova V.M., Puzyr A.P. (1992) Effect of growth conditions on polyhydroxybutyrate accumulation by hydrogen bacteria. Prikl. Biokhim. Mikrobiol. 28: 221-232 (in Russian)].
2. Волова Т.Г., Шишацкая Е.И. Штамм бактерий ВКПМ B-10646 - продуцент полиги-дроксиалканоатов и способ их получения. Патент РФ No. 2439143. Зарегистрирован 10.01.2012.
3. Brandl H., Gross R.A., Lenz R.W., Fuller C.W. (1988) Pseudomonas oleovorans as a source of poly(P-hydroxyalkanoates) for potential application as biodegradable polyesters. Appl. Environ. Microbiol. 54: 1977-1982.
4. Doi Y., Segawa A., Kawaguchi Y., Kunioka M. (1990) Cyclic nature of poly(3-hydroxyalkanoate) metabolism in Alcaligenes eutrophus. FEMS Microbiology Letters 67: 165-170.
5. Fukui T., Chou K., Harada K., Orita I., Nakayama Y., Bamba T., Nakamura S., Fukusaki E. (2013) Metabolite profiles of polyhydroxyalkanoate-producing Ralstonia eutropha H16. Metabolomics 10 (2): 190-202.
6. Handrick R., Reinhardt S., Jendrossek D. (2000) Mobizization of poly(3-hydroxybutyrate) in Ralstonia eutropha. J. Bacteriol. 182 (20): 5916-5918.
7. Haywood G.W., Anderson A.J., Dawes E.A. (1989) The importance of PHB-synthase substrate specificity in polyhydroxyalkanoates synthesis by Alcaligenes eutrophus. FEMS Microbiol. Lett. 57: 1-6.
8. Kalacheva G.S., Volova T.G. (2007) Fatty acid composition of Wautersia eutropha lipids under conditions of active polyhydroxyalkanoates synthesis. Microbiology 76 (5): 535-540.
9. Kobayashi T., Uchino K., Abe T., Saito T. (2005) Novel inutacellula 3-hydroxybutyrate-oligomer hydrolase in Wautersia eutropha H16. J. Bacteriol. 187: 5125-5135.
10. Korotkova N.A., Doronina N.V., Trotsenko Yu.A. (1999) Biosynthesis of the copolymer of 3-hydroxybutyrate and 3-hydroxyvalerate in Methylobacterium extorquens: metabolism of propanol, propionate, pentanol, and valerate. Microbiology 68(3): 296-303.
11. Lawrence A.G., Schoenheit J., He A., Tian J., Liu P., Stubbe J., Sinskey A.J. (2005) Transcriptional analysis of Ralstonia eutropha genes related to poly-(R)-3-hydroxybutyrate homeostasis during batch fermentation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68: 663-672.
12. Lee S.Y. (1996) Bacterial polyhydroxyalkanoates. Biotechnol. Bioengineer. 49: 1-14.
13. Saeguse H., Shiraki M., Kanai C., Saito T. (2001) Cloning intracellular poly[D-(-)-3-hydoxybutyrate]- oligomer hydrolase in Ralstonia eutropha H16. J. Bacteriol. 183: 94-100.
14. Schlegel H.G., Kaltwasser H., Gottshalk G. (1961) Ein submersverfahren zur kultur wasserstoffoxydierenden bakterien: wachstumphysiologische untersuchung. Arch. Mikrobiol. 38: 209-222.
15. Shang L., Yim S.C., Park H.G., Chang H.N. (2004) Sequential feeding of glucose and valerate in a fed-batch culture of Ralstonia eutropha for production of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) with high 3-hydroxyvalerate fraction. Biotechnol. Prog. 20: 140-144.
16. Shi H., Shiraishi M., Shimizu K. (1997) Metabolic flux analysis for biosynthesis of poly(P-hydroxybutyric acid) in Alcaligenes eutrophus from various carbon sources. Journal of Fermentation and Bioengineering 84: 579-587.
17. Shimizu R., Choi K., Orita I., Suzuki Y., Nakamura S., Fukui T. (2013) Detection of phase-dependent transcriptomic change and Ribosko-mediated CO2 fixation into poly(3-hydroxybutyrate) under heterotrophic condition in Ralstonia eutropha H16 based on RNA-seq and gene deletion analyses. BMC Microbiology 13 (169): 1-14.
18. Sznajder A., Pfeiffer D., Jendrossek D. (2015) Comparative proteome analysis four novel polyhydroxybutyrate (PHB) granule-associated proteins in Ralstonia eutropha H16. Appl. Environ. Micribiol. 85: 1847-1858.
19. Taidi B., Mansfield D.A., Anderson A.J. (1995) Turnover of poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) and its influence on the molecular mass of the polymer accumulated by Alcaligenes eutrophus during batch culture. FEMS Microbiology Letters 129: 201-206.
20. Vaneechoutte M., Kampfer P., De Baere T., Falsen E., Verschraegen G. (2004) Wautersia gen. nov., a novel genus accommodating the phylogenetic lineage including Ralstonia eutropha and related species, and proposal of Ralstonia [Pseudomonas] syzygii (Roberts et al. 1990) comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 317-327.
21. Volova T.G., Kalacheva G.S, Gorbunova O.V., Zhila N.O. (2004) Dynamics of activity of the key enzymes of polyhydroxyalkanoate metabolism in Ralstonia eutropha B5786. Appl. Biochem. Microbiol. 40 (2): 170-177.
22. Volova T.G., Kiselev E.G., Shishatskaya E.I., Zhila N.O., Boyandin A.N., Syrvacheva D.A., Vinogradova O.N., Kalacheva G.S., Vasiliev A.D., Peterson I.V. (2013) Cell growth and accumulation of polyhydroxyalkanoates from CO2 and H2 of a hydrogen-oxidizing bacterium, Cupriavidus eutrophus B-10646. Biores.Technol. 146: 215-222.
23. Volova T., Kiselev E., Vinogradova O., Nikolaeva E., Chistyakov A., Sukovatiy A., Shishatskaya E.I. (2014) A glucose-utilizing strain, Cupriavidus euthrophus B-10646: growth kinetics, characterization and synthesis of multicomponent PHAs. PLOS ONE 9: 1-15.
24. Uchino K., Saito T. (2006) Thiolysis of poly(3-hydroxybutyrate) with polyhydroxyalkanoate synthase from Ralstonia eutrophа. J. Biochem. 139: 615-621.
25. Uchino K., Saito T., Gebauer B., Jendrossek D. (2007) Isolated poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) granules are complex bacterial organelles catalyzing formation of PHB from acetyl coenzyme A (CoA) and degradation of PHB to acetyl-CoA. J. Bacteriol. 189 (22): 8250-8256.
