CC BY
27Journal of Siberian Federal University. Biology 2 (2016 9) 145-152
УДК 579.6
Biosynthesis and Properties of PHA Containing Monomers 3-Hyd roxy- 4 - Methylvalerate
Olga N. Vinogradovaa,b*and Tatiana G. Volovaa,b
aSiberian Federal University 79 Svobodny, Krasnoyarsk, 660041, Russia bInstitute of Biophysics SB RAS 50/50 Akademgorodok, Krasnoyarsk, 660036, Russia
Received 00.12.2015, received in revised form 00.02.2016, accepted 00.06.2016 The ability of wild-type strain Cupriavidus eutrophus B10646 to synthesize copolymers containing 3-hydroxy-4-methylvalerate (3H4MV) [P(3HB/3HV/3H4MV)] was studied. The possibility of synthesis of terpolymers containing 3HB, 3HV and 3H4MV monomers using glucose, or butyric acid and co-substrate was shown. A family of copolymers with different content of 3H4MV monomer was synthesized. The highest content of 3H4MV was 7.7 mol. %. Increase of 3HV and 3H4MV content in copolymers caused the reduction of crystallinity degree and of molecular weight, and changes of thermal characteristics of copolymers.
Keywords:polyhydroxyalkanoates, poly(3-hydroxybutyrate/3-hydroxy-4-methylvalerate), Cupriavidus eutrophus B10646, substrates-precursors, 4-methylvalerate.
DOI:
© Siberian Federal University. All rights reserved
* Corresponding author E-mail address: olgav88@mail.ru
Биосинтез и свойства ПГА,
содержащих мономеры 3-гидрокси-4-метилвалерата
О.Н. Виноградова^5, Т.Г. Воловааб
аСибирский федеральный университет Россия, 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79 бИнститут биофизики СО РАН Россия, 660036, Красноярск, Академгородок, 50/50
Исследована способность природного штамма Cupriavidus eutrophus B10646 синтезировать сополимеры, содержащие 3-гидрокси-4-метилвалерат (3Г4МВ) [П(3ГБ/3ГВ/3Г4МВ)]. Показана возможность синтеза трехкомпонентных сополимеров, содержащих мономеры 3ГБ, 3ГВ и мономеры 3Г4МВ при использовании глюкозы или масляной кислоты и субстрата-предшественника. Синтезировано семейство сополимеров с различным соотношением мономеров и содержанием 3Г4МВ максимально до 7,7 мол. %. Показано существенное снижение степени кристалличности при увеличении содержания мономеров 3ГВ и 3Г4МВ на фоне изменения термического поведения сополимеров и падения величины молекулярной массы.
Ключевые слова: полигидроксиалканоаты, поли(3-гидроксибутират/3-гидрокси-4-метилвалерат), Cupriavidus eutrophus B10646, субстрат-предшественник, 4-метилвалерат.
Введение
Полигидроксиалканоаты (ПГА) - полиэфиры, синтезируемые микроорганизмами при лимитировании роста элементами конструктивного метаболизма. Наиболее распространенным и изученным представителем ПГА является гомополимер поли(3-гидроксибутират) [П(3ГБ)] (Choi, Lee, 1999; Huisman, Madison, 1999), однако П(3ГБ) обладает высокой степенью кристалличности (70-80 %), что затрудняет изготовление из него изделий. Для улучшения свойств полимеров проводится работа, направленная на изучение возможности синтеза сополимеров П(3ГБ) с другими мономерами. Список известных типов ПГА пополняется, и в настоящее время появляется информация о возможности микробного синтеза полимеров этого класса, содержащих новые, в том числе нео-
бычные, мономеры (Chia et al., 2010; Sudesh et al., 2000). Сравнительно недавно в литературе появились данные по синтезу сополимерных ПГА, содержащих в своем составе мономеры 3-гидрокси-4-метилвалерата (3Г4МВ) (Dai et al., 2007; Tanadchangsaeng et al., 2009; Saika et al., 2011). К настоящему времени в качестве продуцентов этих сополимеров в основном описаны генетически модифицированные штаммы (Chia et al., 2010; Tanadchangsaeng et al., 2009; Saika et al., 2011; Lau et al., 2011) и в меньшей степени природные микроорганизмы (Tanadchangsaeng et al., 2009; Lau et al., 2010, 2011; Lau, Sudesh, 2012), обладающие такой способностью. В серии работ описаны условия синтеза сополимеров, содержащих мономеры 3Г4МВ, на различных субстратах: глюкозе (Tanadchangsaeng et al., 2009; Saika et al., 2011; Lau et al., 2011; Lau, Sudesh,
2012), валерате, пропионате (Lau et al., 2010), соевом масле (Watanabe et al., 2012). При этом малоизученным остается вопрос о физико-химических свойствах сополимеров этого типа.
Целью настоящей работы было исследование условий микробиологического синтеза и физико-химических свойств сополимеров, содержащих мономеры 3Г4МВ.
Материалы и методы
Исследован штамм Cupriavidus eutrophus B10646, обладающий способностью синтезировать сополимерные ПГА, образованные коротко- и среднецепочечными мономерами гидроксипроизводных алкановых кислот различного строения, и имеющий широкий ор-ганотрофный потенциал (Volova et al., 2013, 2014).
Для культивирования бактерий использовали стандартную минеральную среду Шлегеля (Schlegel, 1961) с лимитированным содержанием азота в среде (40 % от потребностей культуры в элементе) (NH4Cl - 0,4 г/л). В качестве основного источника углерода брали глюкозу или масляную кислоту (Panreac, ЕС), последнюю нейтрализовали 33%-ным раствором KOH (pH 7,0±0,2), затем стерилизовали фильтрацией с применением мембранного фильтра Opticap XL300 Millipore Экспресс SHC (США).
Бактерии выращивали в стеклянных конических колбах объемом 2 л наполовину заполненных минеральной средой в термоста-тируемом шейкер-инкубаторе Innova® серии 44 (New Brunswick Scientific, США) при температуре 30 °С и 200 об/мин. Концентрацию глюкозы или масляной кислоты поддерживали в культуре на уровне 20 или 0,5-1,0 г/л соответственно, в связи с раннее определенными границами физиологического действия этих углеродных субстратов (Volova et al.,
2011). Для синтеза трехкомпонентных ПГА [П(3ГБ/3ГВ/3Г4МВ)] в культуральную среду вносили субстрат-предшественник 4-метил-валерат (Sigma, США), используя режим дробного дозирования, при котором однократная доза не превышала 1,5 г/л. Культивирование проводили в течение 96 ч, добавки субстрата-предшественника вносили на 24, 48 и 72-й ч.
Урожай биомассы клеток бактерий оценивали измерением оптической плотности культуры и по весу сухого вещества. Внутриклеточную концентрацию и состав полимера определяли хроматографией метиловых эфиров жирных кислот после предварительного метанолиза образцов на хромато-масс-спектрометрической системе 7890/5975C (Agilent Technologies, США), а также 'H ЯМР-спектроскопией растворов ПГА в дей-терированном хлороформе (CDCl3) на ЯМР-спектрометре AVANCE III 600 (Bruker, Гер -мания).
Концентрацию глюкозы в среде определяли с помощью набора «Глюкоза - ФКД», включающего ферментно-хромогенную смесь и калибратор (раствор глюкозы с известной концентрацией, 10 ммоль), фотометрически на фотоколориметре КФК-2МП (Россия). Концентрацию азота устанавливали фотометрическим методом с реактивом Нес-слера, масляной кислоты и 4-метилвалерата -с помощью газохроматографического анализа (7890/5975C, Agilent Technologies, США) после предварительной экстракции хлороформом из подкисленных образцов культуральной среды (рН 2-3).
Исследования физических свойств образцов ПГА включали измерение молекулярно-массовых характеристик методом гель-проникающей хроматографии (1260 Infinity, Agilent Technologies, США): средневесовой (Мв), среднечисловой (Мч) молекулярной массы и полидисперсности (В), позволяю-
щей оценить соотношение в полимере фрагментов с различной степенью полимери-зуемости; температурных характеристик (дифференциально-сканирующая калориметрия (DSC-1, Mettler Toledo, Швейцария); степени кристалличности (на рентгеноспектро-метре D8 ADVANCE (Bruker, Германия).
Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием стандартного пакета программ Microsoft Excel. Результаты представлены как средние арифметические со стандартным отклонением.
Результаты и обсуждение
В культуре бактерий Cupriavidus eutrophus B10646, выращиваемой на моноуглеродном субстрате (глюкоза 20 г/л) при лимитировании роста по азоту, урожай био-
массы и содержание полимера за 96 ч культивирования составили 7,3 г/л и 86 % соответственно. Синтезированный полимер был представлен гомополимером 3-гидроксибу-тирата (3ГБ). Синтез сополимерных ПГА исследован при внесении в культуру бактерий субстрата-предшественника: 4-метилвалера-та (4МВ). Варьируя режим углеродного питания и количество вносимых добавок дополнительных углеродных субстратов, удалось синтезировать трехкомпонентный полимер с различным соотношением мономеров 3ГБ, 3ГВ и 3Г4МВ (табл. 1).
Из представленных данных следует, что 4-метилвалерат ингибировал рост бактерий и еще в большей степени накопление полимера. При внесении 4-метилвалерата в концентрации 0,5 г/л включение мономеров 3ГВ и 3Г4МВ в сополимере составило 10,0
Таблица 1. Содержание в биомассе и состав полигидроксиалканоатов, синтезируемых бактериями Cupriavidus eutrophus В10646 в различных условиях углеродного питания (среднее±стандартное отклонение, п=3)
Концентрация 4-метилвалерата*, г/л Выход сухой биомассы, г/л Содержание полимера, % от сухой биомассы Выход полимера, г/л Состав полимера, мол. %
3ГБ 3ГВ 3Г4МВ
Глюкоза 20 г/л
0,0 7,31±0,33 86,0±2,1 6,29±0,37 100,0 0,0 0,0
0,5 5,63±0,31 40,4±2,0 2,27±0,16 83,3 10,0 6,7
1,0 4,82±0,24 21,5±1,5 1,04±0,07 85,3 7,0 7,7
1,5 2,01±0,20 10,2±0,9 0,20±0,01 97,7 1,6 0,7
Масляная кислота 0,5 г/л
0,0 4,65±0,21 52,1±2,3 2,42±0,18 100,0 0,0 0,0
0,5 4,24±0,30 36,2±2,1 1,53±0,07 82,3 12,6 5,1
1,0 4,72±0,34 39,1±1,3 1,84±0,10 73,9 21,5 4,6
1,5 1,51±0,21 26,4±1,1 0,40±0,01 82,9 16,1 1,0
Масляная кислота 1,0 г/л
0,0 6,25±0,33 84,0±2,5 5,25±0,28 100,0 0,0 0,0
0,5 5,41±0,30 80,2±2,7 4,34±0,19 90,5 6,3 3,2
1,0 5,64±0,24 78,6±2,4 4,43±0,21 71,1 23,3 5,6
1,5 1,61±0,07 48,3±1,5 0,78±0,03 88,4 7,3 4,3
* каждая добавка 4-метилвалерата была внесена на 24, 48 и 72 час культивирования.
и 6,7 мол. % соответственно, общий выход сополимера - 40 %. При увеличении концентрации 4-метилвалерата до 1,5 г/л оба показателя снижались (до 1,6 и 0,7 мол. % соответственно) на фоне снижения общего выхода полимера (до 10 %). Максимальное включение мономеров 3Г4МВ (7,7 мол. %) получено при добавлении 4МВ в концентрации 1,0 г/л. Общий выход сополимера при этом был низким (20 %).
Полученныеданныесогласуютсясрезуль-татами зарубежных авторов по токсическому влиянию субстратов-предшественников на рост бактерий и синтез ПГА. Так, в одной из первых работ сополимер П(3ГБ/3ГВ/3Г4МВ) был получен в культуре рекомбинантного штамма Ralstonia eutropha PHB-4 при росте на глюкозе с добавками 4-метилвалерата или 4-метил-2-пентеноата (Tanadchangsaeng et al., 2009). При этом содержание мономеров 3 Г4МВ было на уровне 13 мол. %, урожай биомассы и общий выход сополимера - 1,5 г/л и 46 %. В работе Lau (2011) при культивировании дикого штамма Burkholderia sp. USM (JCM15050) и его трансформированного штамма, содержащего плазмиду pBBREE32d13 с геном ПГА-синтазы изA. caviae, на фруктозе с добавлением 4-метилвалерата получены более высокие результаты. Выход биомассы и сополимера составили 4,5 г/л и 24 % и 3,72 г/л и 17 % у дикого и трансформированного штамма соответственно, однако содержание мономеров 3Г4МВ было высоким (21 мол. %) у трансформированного штамма и низким (1 мол. %) у дикого штамма.
Замена глюкозы масляной кислотой сопровождалась увеличением общего выхода сополимера П(3ГБ/3ГВ/3Г4МВ) и включения мономеров 3ГВ, содержание мономеров 3Г4МВ оставалось на том же уровне. Варьирование концентрации 4-метилвалерата не позволило повысить величину включения мо-
номеров 3Г4МВ в сополимер (табл. 1). В связи с токсичностью масляной кислоты в концентрации 1 г/л выход биомассы (6,2 г/л) был несколько ниже, чем на глюкозе (7,3 г/л).
Снижение концентрации масляной кислоты до 0,5 г/л привело к снижению содержания полимера до 52 % и выхода биомассы до 4,6 г/л, что, вероятно, обусловлено недостаточной концентрацией субстрата, однако при этом возросло содержание в сополимере мономеров 3ГВ (до 12,6-21,5 мол. %) при низком уровне мономеров 3Г4МВ (1,05,1 мол. %). Дробное внесение 4-метилва-лерата в культуру бактерий при суммарном количестве внесенного вещества 3 г/л и стабилизации концентрации масляной кислоты на уровне 1,0 г/л позволило получить сополимер с включением мономеров 3ГВ и 3Г4МВ на более высоком уровне - 23,3 и 5,6 мол. % соответственно.
Таким образом, при варьировании типа и концентрации основного углеродного субстрата (глюкоза и масляная кислота) и режимов дозирования субстрата-предшественника (4-метилвалерата) удалось увеличить общий выход трехкомпонентного сополимера до 78 % при содержании мономеров 3 ГВ и 3Г4МВ соответственно 23,3 и 5,6 мол. %.
Синтезирована и исследована линейка сополимерных образцов с различным соотношением мономеров 3ГБ, 3ГВ и 3Г4МВ (табл. 2).
Молекулярно-массовые характеристики являются одним из наиболее важных параметров, характеризующих свойства высокомолекулярных соединений и определяющих технологические свойства полимеров. Значение среднечисловой молекулярной массы (Мч) у сополимеров варьировало от 100 до 166 кДа и было в 2,0-3,5 раза ниже, чем у гомополимера П(3ГБ) (365 кДа); Мв также была ниже, чем у гомополимера (920 кДа),
Таблица 2. Химический состав и свойства гомополимера П(3ГБ) и трехкомпонентных ПГА, образованных мономерами 3ГБ, 3ГВ и 3Г4МВ
Состав ПГА, мол. % Мч, кДа Мв, кДа ПД Сх, % Т 0C Тстекл., ^ Т 0C L крист., ^ Т °С Т °С -Мегр.?
3ГБ 3ГВ 3Г4МВ
100,0 0,0 0,0 365 920 2,52 76 - 99,0 173,1 280,8
88,4 7,3 4,3 130 566 4,36 42 1,6 72,4 153,4; 165,9 295,2
84,2 14,0 1,8 153 590 3,85 44 1,2 68,6 146,4; 158,0 296,2
82,3 12,6 5,1 100 415 4,15 43 1,2 55,9 146,6; 160,8 296,0
71,1 23,3 5,6 166 585 3,53 44 0,9 57,5 142,3; 156,7 296,6
Примечание: Мч-среднечисловаямолекулярнаямасса,Мв-средневесоваямолекулярнаямасса,ПД-полидисперсность, Сх - степень кристалличности, Тстекл - температура стеклования, Ткрист - температура кристаллизации, Тпл -температура плавления, Тдегр - температура термической деградации, «-» - пик отсутствует.
в пределах 415-590 кДа. У всех полученных трехкомпонентных образцов полидисперсность находилась на относительно высоком уровне 3,53-4,36.
Для полученных сополимерных образцов сняты термограммы в широком диапазоне температур, включающих границы стеклования (Тстекл), кристаллизации (Ткрист), плавления (Тпл) и термической деградации (Тдегр) полимера. При исследовании температурных характеристик (табл. 2) у трехкомпонентных образцов зафиксировано наличие двух пиков температуры плавления, различающихся по величине на 12-14 оС. Вторая особенность в термическом поведении трех-компонентных образцов заключается в обнаруженном значительном (140-150 оС) разрыве между Тпл и Тдегр, что выше известных и полученных ранее данных для различных представителей ПГА. При этом температура термической деградации для трехкомпонентных сополимеров и П(3ГБ) была близкой. В отличие от сополимерных ПГА у П(3ГБ) отсутствовал пик Тстекл. Существенных отличий в температуре стеклования и кристаллизации не зафиксировано.
Результаты рентгеноструктурного анализа показали, что степень кристалличности синтезированных сополимерных образцов
также существенно отличалась от таковой у высококристалличного гомополимера (76 %) и была значительно ниже, в пределах 4244 %. Это согласуется с данными работы (Тапа^Иа^Бае^ е! а1., 2010), в которой показано снижение степени кристалличности пленок П(3ГБ/3Г4МВ) с 60 до 13 % при увеличении содержания мономеров 3Г4МВ от 0 до 39 мол. %. Зависимости значения степени кристалличности от мономерного состава сополимера не выявлено.
Заключение
Показана возможность синтеза природным штаммом Cupriavidus eutrophus В10646 трехкомпонентных сополимерных ПГА, содержащих, помимо мономеров 3ГБ и 3ГВ, мономеры 3Г4МВ. Варьирование условий углеродного питания, включая дозирование субстрата-предшественника, позволило синтезировать линейку образцов с различным соотношением мономеров. Исследованы физико-химические свойства образцов сополимеров и показано существенное снижение степени кристалличности при увеличении содержания мономеров 3ГВ и 3Г4МВ на фоне изменения термического поведения сополимеров и падения молекулярной массы.
Работа выполнена за счет средств государственного задания на проведение фундаментальных исследований РАН (проект № гос. регистрации 01201351505).
Список литературы
Ермаков А.И., Арасимович В.В., Ярош Н.П., Перуанский Ю.В., Луковникова Г. А., Иконникова М.И. (1972) Методы биохимического исследования растений. Л., Колос, 306 c. [Ermakov A.I., Arasimovich V.V., Yarosh N.P., Peruviansky Y.V., Lukovnikova G.A., Ikonnikova M.I. (1972) Biochemical methods of research of plants. Leningrad, Kolos, 306 p. (in Russian)]
Chia K.-H., Ooi T.-F., Saika A., Tsuge T., Sudesh K. (2010) Biosynthesis and characterization of novel polyhydroxyalkanoate polymers with high elastic property by Cupriavidus necator PHB-4 transformant. Polymer Degradation and Stability, 95: 2226-2232
Choi J., Lee S.Y. (1999) Factors affecting the economics of polyhydroxyalkanoates production by bacterial fermentation. Applied Microbiology Biotechnology, 51: 13-21
Dai Y., Yuan Z., Jack K., Keller J. (2007) Production of targeted poly(3-hydroxyalkanoates) copolymers by glycogen accumulating organisms using acetate as sole carbon source. Journal of Biotechnology, 129: 489-497
Huisman G.W., Madison L.L. (1999) Metabolic engineering of poly(3-hydroxyalkanoates): from DNA to plastic. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 63: 21-53
Lau N.-S., Sudesh K. (2012) Revelation of the ability of Burkholderia sp. USM (JCM 15050) PHA synthase to polymerize 4-hydroxybutyrate monomer. AMB Express, 2: 41
Lau N.-S., Chee J.-Y., Tsuge T., Sudesh K. (2010) Biosynthesis and mobilization of a novel polyhydroxyalkanoate containing 3-hydroxy-4-methylvalerate monomer produced by Burkholderia sp. USM (JCM15050). Bioresource Technology, 101: 7916-7923
Lau N.-S., Tsuge T., Sudesh K. (2011) Formation of new polyhydroxyalkanoate containing
3-hydroxy-4-methylvalerate monomer in Burkholderia sp. Applied Microbiology Biotechnology, 89: 1599-1609
Saika A., Watanabe Y., Sudesh K., Abe H., Tsuge T. (2011) Enhanced incorporation of 3-hydroxy-
4-methylvalerate unit into biosynthetic polyhydroxyalkanoate using leucine as a precursor. AMB
Express, 1: 6
Schlegel H.G., Kaltwasser H., Gottschalk G. (1961) A submersion method for culture of hydrogen-oxidizing bacteria: growth physiological studies. Archives of Microbiology, 38: 209-222
Sudesh K., Abe H., Doi Y. (2000) Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters. Progress Polymer Science, 25: 1503
Tanadchangsaeng N., Kitagawa A., Yamamoto T., Abe H., Tsuge T. (2009) Identification, biosynthesis, and characterization of polyhydroxyalkanoate copolymer consisting of 3 -hydroxybutyrate and 3-hydroxy-4-methylvalerate. Biomacromolecules, 10: 2866-2874
Tanadchangsaeng N., Tsuge T., Abe H. (2010) Comonomer compositional distribution, physical properties, and enzymatic degradability of bacterial poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxy-4-methylvalerate) copolyesters. Biomacromolecules, 11: 1615-1622
Volova T.G., Kiselev E.G., Shishatskaya E.I., Zhila N.O., Boyandin A.N., Syrvacheva D.A., Vinogradova O.N., Kalacheva G.S., Vasiliev A.D., Peterson I.V. (2013) Cell growth and PHA
accumulation from CO2 and H2 of a hydrogen-oxidizing bacterium, Cupriavidus eutrophus В-10646. Bioresource Technology, 146: 215-222
Volova T.G., Kiselev E.G., Vinogradova O.N., Nikolaeva E.D., Chistyakov A., Sukovatiy A.G., Shishatskaya E.I. (2014) A glucose-utilizing strain, Cupriavidus eutrophus В-10646: growth kinetics, characterization and synthesis of multicomponent PHAs. PloS One, 9: 1-15
Volova T.G., Zhila N.O., Kalacheva G.S., Sokolenko V.A., Sinski E.J. (2011) Synthesis of 3-hydroxybutyrate-CO-4-hydroxybutyrate copolymers by hydrogen-oxidizing bacteria. Applied Biochemistry and Microbiology, 47: 494-499
Watanabe Y., IchinomiyaY., Shimada D., Saika A., Abe H., Taguchi S., Tsuge T. (2012) Development and validation of an HPLC-based screening method to acquire polyhydroxyalkanoate synthase mutants with altered substrate specificity. Journal of Bioscience and Bioengineering, 113: 286-292
