CC BY
0
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
для выявления контрольной РНК и СО"УЮ-19 приведена в таблице.
Результаты и обсуждение. Анализ на СОУЮ-19 обычно состоит из 4 этапов. 1-й этап — взятие материала; 2-й этап — выделение РНК; 3-й этап — обратная транскрипция выделенной РНК; 4-й этап — ПЦР кДНК Причиной ложноотрицательного результата может быть некачественный мазок или вообще пустой тупфер, плохое выделение РНК, инактивация обратной транс-криптазы или Тад-полимеразы в пробе. Для контроля прохождения всего процесса в коммерческих системах к суспензии для выделения РНК добавляется контрольная ДНК, которая проходит вместе с РНК вируса все стадии процесса. В качестве внешнего положительного контроля может быть добавлен какой-нибудь РНК-содержащий вирус (например, бактериофаг М8-2). Если по окончании процесса будет получена амплификация контрольной ДНК/РНК, то в образце гарантированно прошли 2-я, 3-я и 4-я стадия процесса. Однако если не удалось взять материал от больного или имела место попытка фальсификации пробы, мы этого не увидим и получим ложноотрицательный результат. Мы предлагаем систему, контролирующую все 4 стадии процесса. Если мазок былуспешно взят, то в суспензию вместе с вирусом попадут клетки слизистой. РНК, выделенная из них, пройдет стадию обратной транскрипции и амплификацию. В нашу систему для ОТ-ПЦР входят праймеры для выявления РНК вируса и РНК гена АВЬ1 человека. Их дизайн таков, что они могут работать только с кДНК гена АВЫ, но не с его ДНК. Поэтому появление амплификации кДНК гена АВЫ в пробе будет свидетельствовать об успешном прохождении всех стадий — успешном мазке, выделении РНК, обратной транскрипции и ПЦР. При отсутствии амплификации РНК вируса можно гарантировать истинно отрицательный результат (рис.). Эти праймеры можно
применять для внутреннего контроля прохождения ОТ-ПЦР любых РНКовых вирусов, например НСУ и ВИЧ.
Заключение. Разработан метод ПЦР-диагностики вАКв-СоУ-2, позволяющий исключить ошибки, приводящие к ложно-отрицательным результатам на всех стадиях анализа.
Таблица. Последовательности праймеров COVID-19 и внутреннего контроля ОТ-ПЦР
для выявдения РНК
Название праймера Последовательность праймеров (5'-3')
NUC прямой * GCGTTCTTCGGAATGTCG
NUC обратный * TTGGATCTTTGTCATCCAATTTG-3'
ЗондЫиС* RóG-AACGTGGTTGACCTACACAGST-(RTQl)
ABL1 К прямой ** GTCCACACTGCAATGTTTTTGTG
ABL1 К обратный ** GAGTTCCAACGAGCGGCTTCACTC
Зонд ABU К** FAM-CCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCAG-RTQ1
* — Праймеры NUC взяты из статьи «Improved Molecular Diagnosis of COVID-19 by the Novel, Highly Sensitive and Specific COVID-19-RdRp/Hel Real-Time Reverse Transcription-PCR Assay Validated In Vitro and with Clinical Specimens», J Clin Microbiol. 2020 Apr 23;58(5): 00310-20
**- Праймеры ABL1 К, предложенные авторами для внутреннего контроля анализа на COVID-19, амплифи-цирующие только кДНК, но не геномную ДНК
Февралева И. С., Глинщикова О. А., Сидорова Ю. В., Якутик И. А., Судариков А. Б.
К ВОПРОСУ О ПОДБОРЕ ПРАЙМЕРОВ КОНТРОЛЬНОГО ГЕНА ДЛЯ АДЕКВАТНОЙ ОЦЕНКИ ЭКСПРЕССИИ ХИМЕРНЫХ
ТРАНСКРИПТОВ
ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России
Введение. Оценка уровня экспрессии химерных транскрип-тов, являющихся маркерами онкогематологических заболеваний, осуществляется по соотношению между пороговыми циклами амплификации химерного транскрипта и контрольного гена при исследовании методом ПЦР на кДНК. Рутинные методы выделения РНК не гарантируют отсутствие примесей геномной ДНК, которая в дальнейшем участвует в амплификации. Это приводит к завышению экспрессии контрольного гена и, как следствие, к заниженной оценке относительного количествахимерной РНК, атакже к завышенной оценке чувствительности метода. Использование обработки выделенной РНК ДНКазами существенно усложняет и удорожает анализ, а также может приводить к деградации тар-гетных последовательностей. В настоящем сообщении мы описываем простое и эффективное решение данной проблемы.
Цель работы. Разработать метод для количественной оценки экспрессии химерных транскриптов в ОТ-ПЦР по отношению к контрольному гену ABL1, не чувствительный к примеси геномной ДНК.
Материалы и методы. Тотальную РНК из лейкоцитов периферической крови или клеток костного мозга больных выделяли по методу Хомчинского. Для ОТ-ПЦР использовали набор реагентов «Reverta L» (ЦНИИ эпидемиологии) и реактивы фирмы «Синтол».
Результаты и обсуждение. В работе использовали праймеры длягенаАВЫ, фланкирующие фрагмент ДНК длиной в 139708 ну-клеотидов, содержащий 2 интрона (табл.). Такая длина исключает его амплификацию в ПЦР. В то же время кДНК этого фрагмента имеет длину всего ЮОнуклеотидов. Праймеры же, рекомендуемые
ассоциацией Europe Against Cancer (ЕАС) и широко используемые в составе коммерческих диагностических наборов, фланкируют относительно короткий фрагмент ДНК гена ABL1 длиной 687 нуклеотидов и фрагмент кДНК длиной 124 нуклеотида. При этом примесь геномной ДНК коамплифицируется с кДНК транскрипта в ПЦР, что занижает расчетное относительное количество химерного транскрипта. На рисунке показано сравнение результатов оценки уровней экспрессии химерного транскрипта CBFB::MYH11 у больного с ОМЛ, полученных с праймерами
| ГЕМАТОЛОГИЯ И ТРАНСФУЗИОЛОГИЯ | RUSSIAN JOURNAL OF HEMATOLOGY AND TRANSFUSIOLOGY (GEMATOLOGIYA I TRANSFUSIOLOGIYA) | 2022; ТОМ 67; №2 |
ABL-EAC и предложенными нами (ABL-N). Было протестировано 40 проб кДНК, полученных при разном выделении РНК, в том числе 8 архивных со сроком хранения более б мес. Показано, что пороговые циклы амплификации в пробах со свежевыде-ленной РНК по методу Хомчинского с праймерами ABL-EAC и ABL-N совпадают. Однако в архивной кДНК и РНК из замороженных лейкоцитов пороговый цикл амплификации с праймерами ABL-N значительно падает. Снижается и уровень химерных транскриптов. При этом амплификация с праймерами ABL ЕАС гена ABL1 сохраняется. Это свидетельствует о деградации в архивных образцах РНК и кДНК, в то время как уровень геномной ДНК снижается незначительно. Таким образом, есть принципиальные различия при подсчете уровня химерного транскрипта относительно экспрессии гена ABL1, измеренной с использованием праймеров ЕАС и описанных нами.
Заключение. Предложенные праймеры для амплификации контрольного гена ABL1 позволяют, в отличие от рекомендуемых
ЕАС, получать адекватное соотношение пороговых циклов амплификации химерного транскрипта и контрольного гена независимо от наличия примесей геномной ДНК в препаратах РНК, выделенных из клеток.
Таблица. Последовательности праймеров для выявления РНК гена АВ1.1 и длины фланкируемых ими фрагментов в геноме человека и кДНК
Название Последовательность праймеров (5'-3') ДлинаДНК, нукл Длина кДНК, нукл
ABL1 ЕАС прямой* TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT 687 124
ABL1 ЕАС обратный* GATGTAGTTGCTTGGGACCCA
Зонд ABL1 ЕАС* R6G-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-RTQ1
ABL1 N прямой ** GTCCACACTGCAATGTTTTTGTG 139708 100
ABL1 N обратный ** GAGTTCCAACGAGCGGCTTCACTC
Зонд ABL1 N ** FAM-CCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCAG-RTQ1
* ABL ЕАС- праймеры, предложенные ассоциацией ЕАС
** ABL N- праймеры, предложенные авторами, амплифицирующие только кДНК, ноне геномную ДНК
Фёдорова А. В., Клясова Г. А., Хрульнова С. А.
ДЕТЕКЦИЯ ENTEROCOCCUS SPP., ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ГЕМОКУЛЬТУРЫ, ПРИ РАЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ СИСТЕМЫ КРОВИ
и» Минздрава России
ФГБУ «НМИЦ гематологи
Введение. Частота детекции Enterococcuj spp.y больных опухолями системы крови может варьировать в зависимости от варианта гематологического заболевания.
Цель работы. Изучить частоту Enterococcuj spp., выделенных из гемокультуры, при разных опухолях системы крови.
Материалы и методы. Частота детекции Enterococcuj spp. из гемокультуры была изучена в ходе проспектового многоцентрового исследования (2016—2020 гг.) у больных при разных гемобласто-зах. Резистентность к ванкомицину у Enterococcuj spp. определяли методом серийных микроразведений в бульоне (CLSI, 2020 г.). Гены резистентности к ванкомицину (vanA и vanB) определяли методом ПЦР.
Результаты и обсуждение. Всего было исследовано 145 эпизодов инфекций кровотока, вызванных Enterococcuj spp. Среди заболеваний системы крови преобладали острые миелоидные лейкозы (ОМЛ) и составили 42,7% (п=62), далее следовали неходжкинские лимфомы (НХЛ) — 22,1% (п=32), острые лимфобластные лейкозы (ОЛЛ) — 14,5% (п=21). Другие заболевания крови составили 20,7% (п=30). Среди 145 Enterococciu spp. были 118 (81,4%) E.faecium и 27 (18,6%) Е. fa.eca.LL). Изоляты Е. faecium преобладали при всех вариантах гемотологических заболеваний, составляли от 73,3% до 87,1% при ОМЛ (табл.). Резистентыми к ванкомицину были 31,4% (n=37) Е. faecium, из которых 81,1% (п=30) имели генотип устойчивости vanA и 18,9% (п=7) — генотип vanB. Инфекции кровотока, вызванные ванкомицин-резистентными Е. faecium, были детектированы достоверно чаще при ОМЛ (32,3%) в сравнении с ОЛЛ (9,5%, р=0,05). Частота детекции из гемокультуры
генотипа резистентности vanA среди ванкомицин-резистентных Е./аесшт была значимо выше при ОМЛ (27,4%) в сравнении с ОЛЛ (4,8%, р=0,03).
Заключение. При всех заболеваниях системы крови, вызванных Е^егососсил врр., преобладали Е. /аесшт, частота детекции которых была несколько чаще у больных ОМЛ (87,1%). Ванкомицин-резистентные Е. /аесшт достоверно чаще регистрировали у больных ОМЛ (32,3%) в сравнении с больными ОЛЛ (9,5%).
Таблица. Частота детекции ЕЫвгососсив эрр. из гемокультуры у боль-ныхс разными гематологическими заболеваниями
Показатель ОМЛ, п=62 НХЛ, п=32 ОЛЛ, п=21 Другие, п=30
E.faecium (п=118) 54(87,1%) 26 (81,3%) 16 (76,2%) 22 (73,3%)
Ванкомицин-резистентные Е. faecium, (п=37) /1=0.05 7 (23,3%)
20 (32,3%) 8 (25%) 2 (9,5%)
Генотип резистентности к ванкомицину vanA (п=30) 17(27,4%) /|=0.03 7(21,9%) I 1 (4,8%) 5(16,7%)
Федуленко Д. А.1, Жибурт Е. Б.2, Евсеенко О. В.1
РЕЗУЛЬТАТЫ СКРИНИНГА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ГЕМОТРАНСМИССИВНЫХ ВИРУСОВ У ДОНОРОВ КРОВИ
1ГКУЗ «Центр крови Ленинградской области», 2НМХЦ имени Н.И. Пирогова
Введение. Одной из главных задач трансфузиологии является инфекционная безопасность. Серологические методы исследования позволили значительно сократить риск передачи гемотрансмиссив-ных вирусов реципиенту, однако не решили окончательно проблему «серологического окна». Внедрение МАТ-тестирования в рутинную практику обследования доноров снизило остаточный риск передачи возбудителей. Но не ясен вопрос частоты выявления нуклеиновых кислот вирусов гемотрансмиссивных инфекций у доноров, а также частоты выявления образцов крови в «серологическом окне».
Цель работы. Исследовать частоту выявления нуклеиновых кислот вирусов гемотрансмиссивных инфекций в период «серологического окна» в образцах крови доноров.
Материалы и методы. Для исследования были взяты данные обследования доноров Центра крови Ленинградской области
с 2011 по 2021 год. Было обследовано 122 576 доноров. Доноры обследованы в установленном законодательством порядке на выявление ДНК гепатита В, РНК гепатита С и РНК ВИЧ, методом полимеразной цепной реакции в минипулах из б образцов. При получении положительного результата образцы были обследованы повторно дважды в единичных постановках. Обследованные были разделены на первичных и повторных доноров. У всех доноров учитывали возраст. У повторных — количество дней после предыдущей донации и количество донаций в анамнезе.
Результаты и обсуждение. Положительные результаты NAT-тecтиpoвaния при отрицательных серологических тестах (т.е. в «период окна») были получены у 44 доноров. Частота выявления маркеров гемотрансмиссивных инфекций
