Транслокация t(1;11)(p32;q23) с образованием химерного гена MLL-EPS15 при острых лейкозах: обзор литературы и описание 6 новых случаев. Подходы к мониторированию минимальной остаточной болезни Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Транслокация t(1;11)(p32;q23) с образованием химерного гена ?

MLL-EPS15 при острых лейкозах: обзор литературы ?

и описание 6 новых случаев. Подходы к мониторированию "

минимальной остаточной болезни s

Г.А. Цаур1, 2, А.М. Попов1, 2, О.М. Плеханова1, А.М. Кустанович3, О.В. Алейникова3, Т.Л. Гиндина4, А.С. Демина1, 2, А.Е. Друй1, 2, 5, С.Ю. Ковалев6, К.Л. Кондратчик7, А.В. Мисюрин8, Н.В. Мякова8, Т.О. Ригер1, 2, Л.И. Савельев1, 2, 5, О.И. Сокова9, О.В. Стренева1, 2, М.В. Сучкова10, Ю.П. Финашутина8, Е.В. Флейшман9, Е.В. Шориков1, 2, Р.И. Юцкевич3, C. Meyer11, R. Marschalek11, Л.Г. Фечина1, 2

1ГБУЗ CO «Областная детская клиническая больница № 1», Екатеринбург; 2ГБУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий», Екатеринбург; 3ГУ«Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии», Минск, Республика Беларусь; 4Институт детской гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России; 5ГБОУВПО «Уральская государственная медицинская академия», Екатеринбург; 6ФГАОУ ВПО «Уральский федеральный университет им. первого Президента России Б.Н. Ельцина», Екатеринбург; 7Морозовская детская городская клиническая больница, Москва; 8ФГБУ«Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева» Минздрава России, Москва; 9ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва; 10ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России, Москва; 11Diagnostic Center of Acute Leukemia, Institute of Pharmaceutical Biology / ZAFES, Goethe-University of Frankfurt,

Франкфурт-на-Майне, Германия

Контакты: Григорий Анатольевич Цаур tsaur@mail.ru

На основании собственных исследований (6 пациентов) и данных литературы (27 случаев) представлена клинико-лабораторная характеристика острых лейкозов с транслокацией t(1;11)(p32;q23)/MLL-EPS15. Установлено, что наиболее часто транслокация t(1;11)(p32;q23) обнаруживается у детей первого года жизни (медиана возраста составляет 8 мес). При остром лимфоблас-тном лейкозе лица мужского пола болеют реже (соотношение 1:3), при остром миелоидном лейкозе соотношение полов 1:1. Хромосомные аномалии, дополнительные к ^1;11)(р32^23), выявлены в 38 % случаев. Наиболее часто зоной разрывов в ДНК гена EPS15 является интрон 1. Описано 4 типа химерных транскриптов MLL-EPS15. Создана и успешно применена комбинация прай-меров, флуоресцентных зондов и плазмиды для мониторирования химерного транскрипта MLL-EPS15 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Подобраны условия и проведен мониторинг минимальной остаточной болезни (МОБ) по индивидуальным точкам разрыва в геномной ДНКу пациентов с наличием химерного гена MLL-EPS15. Сравнение данных определения МОБ в геномной ДНК и кДНКпоказало высокую качественную сопоставимость результатов (92 %).

Ключевые слова: острый лейкоз, дети первого года жизни, перестройки гена MLL, транслокация ^1;11)(р32^23), химерный ген MLL-EPS15, минимальная остаточная болезнь

Translocation t(1;11)(p32;q23) with MLL-EPS15 fusion gene formation in acute leukemias: a review and 6 new case

reports. Approaches to minimal residual disease monitoring

G.A. Tsaur1,2, A.M. Popov1,2, O.M. Plekhanova1, A.M. Kustanovich3, O.V. Aleynikova3, T.L. Gindina4, A.S. Demina12, A.Ye. Druy12 5, S.Yu. Kovalev6, K.L. Kondratchik7, A.V. Misyurin8, N.V. Myakova8, T.O. Riger1'2, L.I. Savelyev1'25, O.I. Sokova9, O.V. Streneva1'2, M.V. Suchkova10, Yu.P. Finashutina8, Ye.V. Fleyshman9, Ye.V. Shorikov12, R.I. Yutskevich3, C. Meyer11, R. Marschalek11, L.G. Fechina12

'Regional Children's Clinical Hospital №1, Yekaterinburg;

2Research Institute of Medical Cell Technologies, Yekaterinburg;

3Belarusian Research Center for Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Minsk, Republic of Belarus;

4Raisa Gorbacheva Memorial Institute of Children Hematology and Transplantation, St.-Petersburg I.P. Pavlov State Medical University,

Ministry of Health of Russia;

5Ural State Medical Academy, Yekaterinburg;

6The first President of Russia Boris Yeltsin Ural Federal University, Yekaterinburg;

7Morozov Children Municipal Clinical Hospital, Moscow;

8Dmitriy Rogachev Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Ministry of Health of Russia, Moscow;

9N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow;

10Hematology Research Center, Ministry of Health of Russia, Moscow;

''Diagnostic Center of Acute Leukemia, Institute of Pharmaceutical Biology/ZAFES, Goethe-University of Frankfurt, Frankfurt on the Main, Germany

We performed clinical and laboratory characterization of patients with rare translocation t(1;11)(p32;q23) leading to MLL-EPS15 fusion gene formation. Study cohort consisted of 33 primary acute leukemia (ALL) cases including 6 newly diagnosed and 27 patients previously described in literature. Among study group patients t(1;11)(p32;q23) was found most frequently in infant ALL cases (median age 8 months). In acute lymphoblastic leukemia (ALL) male/female ratio was 1:3, in acute myeloid leukemia (AML) it was 1:1. Additional cytogenetic aberrations in 38 % of patients were revealed. The most frequent breakpoint position in EPS15 gene was intron 1. Four different types of MLL-EPS15 fusion gene transcripts were detected. Primers-probe-plasmid combination for MLL-EPS15 fusion gene transcript monitoring by real-time quantitative polymerase chain reaction (RQ-PCR) was developed and successfully applied. In 3 patients RQ-PCR was done on genomic DNA for absolute quantification of MLL-EPS15 fusion gene. High qualitative concordance rate (92 %) was noted between minimal residual disease data obtained in cDNA and genomic DNA for MLL-EPS15 fusion detection.

Key words: acute leukemia, infants, MLLL rearrangements, translocation t(1;11)(p32;q23), MLL-EPS15fusion gene, minimal residual disease

Введение

Перестройки 11q23/MLL встречаются примерно в 10 % всех случаев острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) и в 3 % случаев острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) [1, 2]. На сегодняшний день на молекулярном уровне охарактеризовано 64 различных перестройки хромосомного района 11q23 с участием гена MLL, встречающихся при острых лейкозах (ОЛ) и при мие-лодиспластическом синдроме [3]. Наиболее частыми партнерами MLL являются гены AFF1 (AF4), MLLT3 (AF9), MLLT1 (ENL), MLLT10 (AF10), MLLT4 (AF6), ELL, на долю которых суммарно приходится около 85 % всех случаев MLL-позитивных ОЛ, как у детей, так и у взрослых. Среди оставшихся 15 % случаев наиболее часто обнаруживается транслокация t( 1; 11) (p32;q23) с образованием химерного гена MLL-EPS15, частота выявления которой составляет примерно 3 % от общего числа перестроек гена MLL [3, 4]. Данная транслокация встречается у детей и у взрослых как при de novo, так и при вторичных ОЛ [4—22]. Также описаны 2 случая миелодиспластического синдрома с наличием аберраций хромосомного района 1p32 у лиц, переживших атомную бомбардировку в Японии: в одном случае была выявлена делеция del(1)(p22p32), во втором транслокация t(1;11)(p32;q23) [23].

Ген EPS15 (AF1P, AF-1P, MLLT5), располагающийся в хромосомном регионе 1р32, кодирует один из рецепторов эпидермального фактора роста, отвечающий за эндоцитоз данного белка. Ген имеет протяженность 165 т. н., состоит из 25 экзонов и кодирует белок, состоящий из 896 аминокислот с молекулярным весом 98 656 Да [24]. Транскрипция гена осуществляется в те-ломерном направлении. Описано 10 транскриптных вариантов, образующихся вследствие альтернативного сплайсинга, однако только 4 из них кодируют белок [25].

У человека наиболее высокая экспрессия гена EPS15 выявлена в Т- и В-лимфоцитах, моноцитах и лимфо-бластах [26]. Белок EPS15, как участник сигнального пути рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), регулирует рост и пролиферацию клеток. Структура белка EPS15 приведена на рис. 1.

Химерный ген MLL-EPS15 впервые описан O. Bernard et al. [13]. В основе образования данного химерного гена лежит реципрокная транслокация t(1;11)(p32;q23) (рис. 2).

Известно, что существует 2 альтернативных механизма активации онкогенного потенциала белка MLL [29, 30]. Первый, более универсальный механизм, связан с воздействием на мотив белка-партнера MLL различных внешних факторов, что ведет к последующему неконтролируемому синтезу белка. Данный механизм реализуется в том случае, если белок-партнер локализуется в ядре клетки. Второй механизм, предложенный для MLL-EPS15 и ряда других химерных белков с участием MLL, локализующихся в цитоплазме, — двуспиральная олигомеризация функциональных доменов белка EPS 15, приводящая к лейкозогенной трансформации белка MLL, что, в свою очередь, ведет к увеличенной способности клеток к самообновлению. Было показано, что при ОЛ действие химерного белка опосредуется через гены семейства HOX [31—34], однако по отношению к ОЛЛ данная точка зрения разделяется не всеми авторами [35].

В доступной нам литературе встретилось описание всего 25 случаев de novo ОЛ, а также 2 рецидивов ОЛ с наличием t(1;11)(p32;q23) [4—22]. Структура химерного гена MLL-EPS15 была описана всего в 2 случаях, а структура химерного транскрипта — в 5. Целью данной работы была клинико-лабораторная характеристика пациентов с транслокацией t(1;11)(p32;q23)/

ЕН1 ЕН2 ЕН3 CCD DPF UIM1 UIM2

Г ■ ■ яшшл

L - 1

Рис. 1. Структура EPS15. В структуре данного белка выделяют: 1. Три N-концевых EPS15-гомологичных домена (EH1, EH2, EH3), которые необходимы для присоединения к цитоплазматической мембране путем взаимодействия с белками и прямого связывания с фосфолипидами; 2. Би-спиральный домен (CCD), ответственный за гомо- и гетеродимеризацию; 3. Аспартат-пролин-фенилаланиновые повторы (DPF), которые могут связываться с а-субъединицей адапторного белка AP-2; С-концевой фрагмент представлен 4убиквитин-связывающими мотивами (UIM), которые необходимы для убиквитинилирования EGFR [27, 28]

1 (N) 11 (N)

Der(1) Der(11)

I

I

МИ-ЕРБ15 ЕРБ15-МИ

Рис. 2. Основной механизм образования химерного гена у пациентов с наличием MLL-EPS15 — реципрокная транслокация

MLL-EPS15, а также разработка методики монитори-рования минимальной остаточной болезни (МОБ) у пациентов с этой транслокацией методом полиме-разной цепной реакции (ПЦР). В отличие от других, более часто встречающихся перестроек гена MLL, для которых описаны различные комбинации праймеров и зондов [36, 37], нам не встретилось методики мони-торирования МОБ у пациентов с наличием химерного гена MLL-EPS15 или его транскрипта.

Материалы и методы

За период с февраля 2000 по апрель 2012 г. было обследовано 186 детей в возрасте от 1 до 365 дней с ОЛ, включая 120 пациентов с ОЛЛ, 58 — с ОМЛ, 3 — с острым недифференцированным лейкозом, по 2 — с острым бифенотипическим и острым билинейным лейкозами, еще в 1 случае тип ОЛ не был определен. Транслокация t(1;11)(p32;q23) и/или химерный ген MLL-EPS15 были выявлены нами в 6 случаях. Пациенты, у которых была обнаружена транслокация t(1;11) (p32;q23), получали терапию по протоколам MLL-Baby [38] или ALL IC-BFM 2002 в детских онкогематологических клиниках Российской Федерации и Республики Беларусь. Информированное согласие на проведение диагностических и лечебных процедур было получено во всех случаях.

Для цитогенетического исследования использовали клетки костного мозга, взятые до начала терапии. Применялась техника краткосрочного культивирования клеток в течение 24 ч. Методом окраски хромосомных препаратов был GTG-вариант. В большинстве случаев анализировали не менее 20 метафазных пластинок. Кариотипирование проводили в соответствии с международной номенклатурой хромосом человека, принятой на момент выполнения стандартного цито-генетического исследования [39—41]. В ходе данной

работы все кариотипы были повторно оценены с учетом рекомендаций ISCN 2009 [41]. Дополнительными хромосомными аберрациями считали все клональные аномалии, сочетавшиеся с t(1;11)(p32;q23) [42]. Карио-тип считали комплексным, если каждая клетка лей-козного клона у пациентов с ОМЛ содержала не менее 3 хромосомных изменений, включая перестройки района 11q23 [43, 44].

Флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) проводили с использованием гибридизационной системы TermoBrite (StatSpin, США) на микроскопе DM 4000 (Leica Microsystems Wetzlar GmbH, Германия) при помощи программного обеспечения CW4000 FISH (Leica Microsystems Wetzlar GmbH, Германия). Применяли локус-специфичный зонд LSI MLL Dual Color Rearrangement Probe 11q23 (Abbott Molecular, США), а также цельнохромосомные зонды для полного окрашивания 1-й и 11-й хромосом, меченные FITC и TexasRed соответственно (Metasystems, Германия).

Длинную инвертированную ПЦР (long-distance inverse PCR-LDI-PCR) выполняли по описанной ранее методике [45]. В качестве исходного материала использовали геномную ДНК в количестве 1 мкг, выделенную из лейкоцитов и бластных клеток костного мозга, взятого в момент установления диагноза. ДНК обрабатывали экзонуклеазами рестрикции BamHI и BglII, а затем лигировали. Полученный продукт использовали для проведения нескольких инвертированных ПЦР-реакций. Ампликоны секвенировали с целью определения индивидуальной для каждого пациента точки разрыва в MLL и гене-партнере.

Выделение РНК и обратную транскрипцию проводили по ранее описанной методике [46]. Качество полученной РНК оценивали методом капиллярного электрофореза на биоанализаторе Agilent 2100 (Agilent, США). В дальнейший анализ брали образцы с показателем целостности РНК более 4,2, который, как было доказано ранее, является достаточным для эффективного проведения ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [47].

Обратно-транскриптазную ПЦР (ОТ-ПЦР) проводили с использованием набора HemaVision (DNA-technology A/S, Дания) и TaqF ДНК-полимеразы (ЦНИИ эпидемиологии, Россия) в 2 этапа, согласно инструкции производителя. На первом этапе ставили 8 мультиплексных ПЦР-реакций. При получении положительного результата в одной из пробирок на втором этапе проводили несколько моноплексных реакций. Результат расценивали как позитивный, если на обоих этапах ПЦР обнаруживалось наличие специфического ПЦР-продукта, совпадающего по размеру с ожидаемым. Результат расценивали как отрицательный, если в ходе первого этапа ПЦР не было выявлено продуктов амплификации и во всех пробирках присутствовала полоса внутреннего контроля размером 911 п. н. Детекцию проводили методом горизонтального электрофореза в 2 % агарозном геле. Дополнительно

ОНКОГЕМАТОЛ О Г И Я 1 2013

о

Таблица 1. Клинико-лабораторная характеристика пациентов с ОЛи наличием 1( 1;11)(р32^23)/МЬЬ-ЕР815 (начало)

№ пациента Пол Возраст Лейкоциты (X Ю'/л) Кариотип ВвдОЛ 11811 Химерный ген Химерный транскрипт Исход терапии Источник

1 ж НД** НД 46,ХХ,«1;11)(р32;д23) ВП-ОЛЛ - - - НД Б. ХТОНатз е! а1., 1984 [5]

2 ж 8 мес 425 46,ХХЛ(1;11)(р32;я23)[6] В1-ОЛЛ - - - Пациент жив в ППР со сроком наблюдения 19 мес У. Капеко е! а1., 1986 [6]

3 м 4 мес 104 46,ХУД(1;11)(р32;д23)[17]/46,ХУ[20] ВIV-ОЛЛ - - - Смерть в ремиссии от инфекции через 9 мес от начала терапии

4 ж < 1 года НД 46,ХХ,«1;11)(р32;д23) НД - - - НД М. С^оке е! а1., 1987 [7]

5 ж 2 мес 260 46,ХХ4е1(1)(р32)4е1(11)(д13д23)4ег(4) 1(1;11;4)(1р1ег->-1р32::11д23->-11д13::4р16 ->-4д1ег)[29]/44,ХХ,-14,-21[1] омл - - - НД А. 8е1урез е! а1., 1987 [8]

6 ж 1 год НД 46,ХХ,«1;11)(р32;д23) В1-ОЛЛ - - - НД А. Hagemeijer е!а1., 1987 [9]

7 ж 3,3 года 153 46,ХХД(1;11)(р32;д23)[5]/46,ХХ[18] В1-ОЛЛ - - - Смерть от рецидива через 5 мес от начала терапии 8. КатюпсИ е! а1., 1989 [10]

8 ж 35 лет НД 46,ХХ,«Х;5)(д26;р15),К1; 11)(р32;д23)д(9) (дЮ)4е1(17)(р11)/46,ХХ4(9)(д10),асИ(12) (р13)4е1(17)(р11) олл - - - НД С. 8Ырреу е! а1., 1989 [11]

9 м НД НД 50,ХУ,1(1;11)(р32;д23),+?7,+21,+2таг** олл - - - НД Т. АЬзЫге е! а1., 1992 [12]

10 м 4 года 465 46,ХВД1;11)(р32;д23)[11]/46,ХУ[1] ОМЛ МО - - МП экзон 9 -ЕР815 экзон 2 НД О. Вегпагс! е! а1., 1994 [13]

11 ж 43 года НД 46,ХХ,«1;11)(р32;д23),+с1ег(1Ж1;12) (р12^12),-12[5]/46,ХХ[4] ОМЛ М5а - - МП экзон 9 -ЕР315 экзон 2 НД

12 ж 1 год НД 46,ХХ,«1;11)(р32;д23) олл - - - Событие* через 20 мес от начала терапии, смерть через 24 мес С. Нашвоп е! а1., 1998 [4]

13 ж 5 мес НД 46,ХХ,«1;11)(р32;д23) В1-ОЛЛ - - - Пациент жив в ППР после проведения ТГСК. Срок наблюдения 54 мес

14 ж 8 мес НД 46,ХХ,«1;11)(р32;д23) В1-ОЛЛ - - - Событие через 21 мес от начала терапии, смерть через 32 мес

Й

3 оо

О

§ 2

г

гл О

о о

-Й <4

О

1

■Я ^

« К §

к „

=1-

оё

о

о

I3 Г

а

г и

V о

^ о ГУ1 гч

—

^ сч ^ сч

-Г

¿2 о

к ^

§ №

£

(3 « & £

о О

№ л

й (й

СО ^

ч к

о

ч к

й о «и,

а н к

о

й к

га §

0 я н н

сЗ О

л ёй и ^ а

1 Г

£

Й

§ ьЗ

:

К

к ^

^ ^ к

м ?ч Я

3 | Ё

3 о к

к ^

^ ^ к

м ?ч Я

3 1 £

3 о к

:

к

:

К

:

К

:

К

ч •е и о

ч ч о

ч ч о

ч ч о

ч ч о

ч ч о

:

к

р см

.5 ¡^

я ^ йх

ГЛ -Н

сл "О

й

X ^

£

в

£

-о

Й

£

£

£

л

л

£

S3 53

t-

§

X

я

хл

ъ §

а

£ в = 8 X ^

К ^ ^ g

S I 8

4

о

^ g

Ы 's

4

о

^ g

Ы 's

4

о

а

CO

S b^ ä'

к

О (N ft on Й ft

9 '

ti

о

з a

a .1 °o

Su . „ se

a,ga

§ä ü

л я

t> a t

a ^

4« S

я §

ея »Skit -&S ,a °

Vo -i. 1 ^ to

t 8

, a В-Ц

ij

я fc?

Ü § я ^

£ S

3 a

«

a S

0

го a

1

a a

s g

*

ag* ^S •, >a aw

<4

is К

SS S3 5 « Й a,

ч о

с:

^ з

^ v5

Si §

^ о

« § О r^

^ я § §

§ ^ S

a . & я

iS ^s

всех пациентов с выявленным химерным геном MLL-EPS15 тестировали в гнездной ОТ-ПЦР с праймерами, предложенными N. Palisgaard et al. [36].

Полученные в ходе гнездной ОТ-ПЦР ампликоны очищали при помощи «Wizard SV Gel and PCR Cleanup System» (Promega, Германия). Секвенирующую реакцию ставили с применением праймеров, использовавшихся во втором раунде гнездной ОТ-ПЦР, и набора BigDye Terminator 3.1. (Applied Biosystems, США) согласно инструкции производителя. Секвенирование проводили в 2 направлениях на генетическом анализаторе ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, США).

Для конструирования калибратора, используемого для количественной оценки величины химерного транскрипта MLL-EPS15 в ходе ПЦР-РВ, была использована РНК пациента № 30 (табл. 1). После проведения гнездной ОТ-ПЦР по описанной ранее методике [36] визуализацию ампликонов проводили методом электрофореза в 6 % полиакриламидном геле. Выделение ДНК-фрагмента из геля выполняли путем элюирования TE-буфером с последующим осаждением 70 % этиловым спиртом по общепринятой методике. Перед процедурой лигирования проводили наращивание «тупых» концов с использованием Taq ДНК-полимеразы (ООО «Генотехнология») в присутствии дезоксиаденозинтрифосфата. Полученный ам-пликон лигировали в плазмидный вектор «pGEM-T Easy» (Promega, Германия) с последующей его трансформацией в бактериальную культуру Е. coli. Из отобранных положительных клонов E. coli выделяли плазмидную ДНК методом щелочного лизиса. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически. Для использования в качестве калибратора для ПЦР-РВ сделали 5 разведений (101, 102, 103, 105, 106 копий/5 мкл), аналогичных использованным в международном проекте «Европа против рака» [48].

ПЦР-РВ для количественной оценки химерного транскрипта выполняли в соответствии с ранее описанными протоколами [48, 49]. В качестве калибраторов применяли плазмиды, несущие фрагменты химерного транскрипта MLL-EPS15 и контрольного гена ABL1 (Ipsogen, Франция). Нуклеотидная последовательность использовавшихся праймеров и зондов для определения транскрипта MLL-EPS15 приведена в табл. 2. Для количественной оценки величины МОБ на основании данных, полученных путем ПЦР-РВ, использовалась методика расчета, рекомендованная консорциумом «Европа против рака» [49].

ПЦР-РВ для определения количества химерного гена MLL-EPS15 в геномной ДНК проводили по ранее описанному протоколу [50] с рядом модификаций. ПЦР выполняли в мультиплексном формате: реакционная смесь включала 2 пациент-специфичных прай-мера и зонд, меченный карбоксифлуоресцеином (FAM), комплементарных зоне слияния генов MLL и EPS15, а также 2 праймера и зонд, меченный карбокси-Х-род-амином (ROX), для амплификации контрольного гена

К-ацетилглюкозамин киназы (NAGK), располагающегося на коротком плече хромосомы 2 в регионе 2р12. Ген NAGK использовался для исключения случайной ошибки. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов приведены в табл 2. В ПЦР-смесь вносили 600 нг геномной ДНК. Амплификацию проводили с использованием TaqF-полимеразы (ЦНИИ эпидемиологии, Россия) по следующей программе: 95 °С 15 мин, 45 циклов: 95 °С 15 с — 60 °С 60 с. Для создания калибровочной кривой проводили амплификацию 10-кратных разведений ДНК пациента в смеси ДНК, полученной от 5 пациентов без онкогематологических заболеваний, взятых в общем количестве 600 нг в соотношениях от 1:10 до 1:100 000. Все образцы тестировали в 2 повторах.

Интерпретация результатов ПЦР-РВ проводилась исходя из рекомендаций Европейской рабочей группы

по изучению МОБ при ОЛЛ ESG-MRD-ALL [51] с дополнениями Т. Вигше181ег й а1. [50]. Величина МОБ была рассчитана как среднее значение числа копий 2 повторов каждого образца при следующих условиях.

1. Отсутствие амплификации в отрицательном контроле (смесь ДНК, использованная для создания разведений) или превышение значения порогового цикла в образце пациента более чем на 3,0 от величины порогового цикла отрицательного контроля.

2. Разброс значений порогового цикла контрольного гена NAGK в 2 повторах 1 образца не превышает 1,5.

3. Коэффициент корреляции (Я2) выше 0,95.

4. Угол наклона калибровочной кривой укладывается в диапазон от —2,5 до —4,5. В каждом образце рассчитывался количественный диапазон согласно рекомендациям ESG-MRD-ALL [51].

Таблица 2. Использованные праймеры и зонды

Нуклеотидная последовательность 5'-3' Ген Экзон Локализация

Химерный транскрипт МЬЬ-ЕР815 (кДНК)

Прямой праймер AGGAGAATGCAGGCACTTTGA MLL 10 4135-4155

Обратный праймер AAGCCAACACCCTTCCAGTA EPS15 3 201-182

Зонд ROX-CATCCTCAGCACTCTCTCCAATGGCAATA-BHQ2 MLL 10 4157-4185

Контрольный ген АБЬ (кДНК)

Прямой праймер AGCTCCGGGTCTTAGGCTAT ABL 2 263-282

Обратный праймер TAGTTGCTTGGGACCCAGCC МЬ 3 357-328

Зонд FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-BHQ1 МЬ 3 323-296

Химерный ген МЬЬ-ЕР815у пациента № 30 (ДНК)

Прямой праймер GCAGCAGTTATTTTTGGACTCATTGA MLL

Обратный праймер GATCTTTGTGACAGAGCAAGTCTTTA EPS15

Зонд FAM-TGATTACGCTTACAGTTACATGAACCCACACAT-BHQ1 EPS15

Химерный ген МЬЬ-ЕР815у пациента № 31 (ДНК)

Прямой праймер TCCCTGTTTAAACCAGCTAAAGAAATGT MLL

Обратный праймер TCAAGTGTAATTTAAAACAAACACCATTTCC EPS15

Зонд FAM-TGCTACTCTAATAGCAGATTCCTTCCTAAAATCT-BHQ1 MLL

Химерный ген МЬЬ-ЕР815у пациента № 32 (ДНК)

Прямой праймер AGTGGGCATGTAGAGGTAAG MLL

Обратный праймер GCAGGAGGATTGGTTGAG EPS15

Зонд FAM-TGCACTCTAGCCTGGGCAACAGAGTGAGA-BHQ1 EPS15

Контрольный ген МАОК (ДНК)

Прямой праймер TGGGCAGACACATCGTAGCA NAGK

Обратный праймер CACCTTCACTCCCACCTCAAC NAGK

Зонд ROX-TGTTGCCCGAGATTGACCCGGT-BHQ-2 ток

Примечание. Нуклеотидная последовательность и нумерация экзонов гена MLL дана I. ШЬон et а1. [52], EPS15 — согласно NM_001981.2, ABL - согласно NM 005157.

Результаты терапии оценивались по кривым общей (ОВ) и бессобытийной выживаемости (БСВ), построенным по методу Каплана—Майера [52]. Для сравнения кривых выживаемости использовался непараметрический log-rank критерий. Различия считались достоверными прир < 0,05.

Результаты

Данные о 27 пациентах, представленных в литературе, а также 6 вновь описываемых нами случаев, приведены в табл. 1. Возраст на момент установления диагноза был известен у 31 пациента. Среди них было 19 (62 %) детей первого года жизни, 6 (19 %) детей в возрасте от 1 года до 4 лет и 6 (19 %) взрослых в возрасте от 35 до 76 лет. При этом медиана возраста во всей исследуемой группе составила 8 мес (диапазон 1 день — 76 лет). У лиц женского пола транслокация t(1;11)(p32;q23) выявлялась в 2 раза чаще по сравнению с мужчинами: 22 и 11 человек соответственно. В первую очередь это было связано с преобладанием лиц женского пола среди пациентов с ОЛЛ, где соотношение женщин и мужчин составило 3:1 (15 и 5 человек соответственно). Это же соотношение сохранялось и у детей первого года жизни с ОЛЛ (10 девочек и 3 мальчика). Для пациентов с ОМЛ вне зависимости от возраста соотношение лиц женского и мужского пола было близко к 1:1.

У 20 (63 %) пациентов диагностирован ОЛЛ, у 11 (34 %) - ОМЛ, в 1 (3 %) случае - острый бифе-нотипический лейкоз. У 1 пациента (№ 4 в табл. 1) вариант ОЛ не был указан авторами. У детей первого года жизни ОЛЛ встречался еще чаще. Из 18 пациентов с известным типом ОЛ у 13 (72 %) был ОЛЛ, у 4 (22 %) — ОМЛ и у 1 (6 %) — острый бифенотипи-ческий лейкоз.

Иммунофенотип бластных клеток был известен в 15 случаях ОЛЛ, в том числе полностью в 13 и частично в 2 (№ 1 и 9 в табл. 1). У всех описанных пациентов выявлен B-линейный иммунофенотип бластных клеток, в том числе 14 случаев ОЛЛ из В-линейных предшественников, в 1 случае (№ 3) нельзя исключить зрелый B-ОЛЛ. BI-ОЛЛ выявлен у 10 (77 %) из 13 пациентов первого года жизни с ОЛЛ. FAB-вариант описан у 10 пациентов с ОМЛ. В эту группу вошли 2 пациента с ОМЛ с минимальной дифференцировкой (М0 морфологический вариант по FAB-классифика-ции), 2 — с острым миеломонобластным лейкозом (М4) и 6 — с острым монобластным лейкозом (М5). У детей первого года жизни с ОМЛ в 2 случаях выявлен ОМЛ М5, в 1 — ОМЛ М0.

Данные об инициальном уровне лейкоцитов приведены для 18 пациентов. У них превалировал инициальный гиперлейкоцитоз: уровень лейкоцитов выше 100 х 109/л на момент установления диагноза выявлен в 12 (67 %) случаях. Медиана количества лейкоцитов составила 156 х 109/л (диапазон 2—465). Дети первого года жизни имели большую опухолевую массу: из

13 человек только трое имели уровень лейкоцитов менее 100 х 109/л, а медиана количества лейкоцитов в этой возрастной группе составила 187 х 109/л (диапазон 49-425 х 109/л).

Цитогенетическое исследование показало, что транслокация t(1;11)(p32;q23) как единственная аномалия выявлена в 20 (59 %) из 32 случаев. У 1 пациента (случай № 5) найдена комплексная транслокация с вовлечением хромосомных районов 1p32, 11q23 и 4p16. Дополнительные хромосомные аномалии (ДХА) в опухолевых клетках пациентов с наличием t(1;11)(p32;q23) и информативным цито-генетическим исследованием выявлены у 12 (38 %) из 32 пациентов. В 3 случаях (№ 8, 20, 22 в табл. 1) обнаружены только количественные ДХА, в 6 (№ 16, 19, 24, 25, 27, 29) — только структурные; в 3 случаях — сочетание количественных и структурных (№ 9, 11, 24). Наиболее частой количественной ДХА являлась трисомия 8 (3 случая). Комплексный кариотип обнаружен у 4 (36 %) из 11 пациентов с ОМЛ (№ 11, 21, 22, 25) (рис. 3).

Молекулярно-генетические исследования выполнены 15 пациентам, в том числе исследование методом FISH с локус-специфичным зондом проведено у 11 больных, и во всех случаях была выявлена перестройка гена MLL. В 3 случаях (№ 30, 32, 33) нами проведен дополнительный анализ методом FISH c использованием цельнохромосомных зондов для хромосом 1 и 11, который также подтвердил присутствие t(1;11) (рис. 4).

У пациентов № 14 и 18 перестройки MLL подтверждены методом гибридизации по Саузерну. Структура химерного транскрипта определена у 9 пациентов, химерного гена — у 6. Выявлено по 2 случая локализации точек разрыва в экзоне 10 (№ 26 и 27), интроне 10 (№ 30 и 33) и интроне 11 (№ 31 и 32)

Несбалансированный кариотип (n = 12)

Комплексный кариотип* (n = 4)

Сбалансированный кариотип (n = 12)

< 3 аберраций* (n = 4)

Количественные

(n = 3)

Количественные и структурные

(n = 3)

Структурные

(n = 3)

Рис. 3. Типы ДХА у пациентов с ^1;11)(р32^23). Цифры соответствуют числу пациентов; * — разделение по количеству ДХА на более 3 (комплексный кариотип) и менее 3 проведено только для пациентов с ОМЛ

/der(1) (p32) V V *

« « н »1 и 1

11 der(11) (q23)

5'-MLL

MLL

/

\

З'-MLL

г

я

* /

der(11) (N)

Ш X

/ m

/ 11 (N)

»"— der(1)

Рис. 4. Результаты цитогенетического и молекулярно-генетических методов исследования: а — частичная кариограмма пациента с наличием t(1;11)(p32;q23); б — результаты скрининговой (слева) и подтверждающей (справа) ОТ-ПЦР с использованием набора HemaVision (DNA-technology A/S, Дания) у пациента с наличием химерного транскрипта MLL-EPS15. K— негативный контроль. Также на каждой электрофореграмме присутствует ДНК-маркер размерности ПЦР-продуктов; в — результат исследования методом FISH в интерфазнъа ядрах, характерный для перестройки гена MLL; г — данные FISH c применением цельнохромосомных зондов к 1-й и 11-й хромосомам, показывающие наличие t(1;11)

Рис. 5. а — нуклеотидная последовательность зоны слияния гена М1Х (выделен черным цветом) и хромосомного района 1р32 (выделен красным цветом), полученные при проведении LDI-PCR у пациента № 33. Жирным шрифтом отмечен экзон 10 гена М1Х. Синим цветом выделена тринук-леотидная вставка; б — результат секвенирования химерного транскрипта у этого же пациента выявил слияние экзона 10 гена MLL с экзоном 2 гена ЕР315

в

в ДНК гена МЬЬ. В гене ЕР515 в 3 случаях точка разрыва находилась в пределах интрона 1 (№ 30—32), в 1 случае в регионе 1р32 на расстоянии 1580 нуклео-тидов от экзона 1 гена ЕР815 (№ 33) (рис. 5а). Интересно отметить, что в этом случае точка слияния в химерном транскрипте располагалась во 2-м экзоне гена ЕР815 (рис. 5 б).

Еще в 2 случаях у монозиготных близнецов точка разрыва в гене ЕР815 локализовалась в относительно нетипичном месте — интроне 9 (№ 26 и 27). Выявлены следующие типы химерных транскриптов МЬЬ-ЕР815\ е9е2 — 3 случая, и по 2 случая е9е10, е10е2, е11е2 (рис. 6).

Для проведения количественного мониторинга МОБ нами была создана комбинация флуоресцентных

зондов, праймеров и плазмиды, несущей фрагмент химерного транскрипта MLL-EPS15. На основании 10-кратных разведений плазмиды (рис. 7а) была получена калибровочная кривая (рис. 7б и табл. 3). Специфичность комбинации зондов и праймеров была проверена исследованием 15 пациентов с ОЛ и нормальным кари-отипом и 15 пациентов с ОЛ и другими химерными транскриптами с участием MLL, в том числе 6 — с MLL-ЛЕ4, 5 - с МЫ-МШП, 2 - с MLL-MLLT4, 1 - с MLL-МЬЬТЗ, 1 — с MLL-MLLT10. Ни в одном случае неспецифической амплификации не выявлено. При разведении РНК, выделенной из исходного образца костного мозга пациента № 30, смесью РНК 10 пациентов без онкоге-матологических заболеваний была определена чувствительность системы, созданной для выявления MLL-EPS15 методом ПЦР-РВ. Она составила 1 х 10-5 (рис. 7 в).

Мониторинг МОБ путем качественного и количественного определения химерного транскрипта MLL-EPS15 проводили пациентам № 29—33. Во время проведения первого курса консолидации ремиссии пациенты № 30, 31, 32 (рис. 8а) достигли МОБ-нега-тивности, однако 2 из них позднее рецидивировали (№ 31 и 32) (рис. 86). Пациент № 33 достиг МОБ-нега-тивности во время проведения 3-го курса консолидации ремиссии и находится в полной продолжающейся ремиссии (ППР) со сроком наблюдения 20 мес (рис. 8в). У пациента № 29 мониторинг МОБ стал проводиться через 5,5 мес от начала терапии. Для исключения случайных ошибок одновременно с ПЦР в этом случае проводилось исследование методом FISH. Химерный транскрипт MLL-EPS15 методом ПЦР и перестройки гена MLL методом FISH ни разу не определялись.

MLL

EPS15 NM 001981.2

7 8 9 2 3 4

Количество образцов

3

8

10 [ 11~

7 8 9 10

ту "Т „ 2 3 4

2(2*)

3593 3658

4036 4110 4242 4356

7 8 9 10 11 2 3 4

126 168

258 306

2(2*)

Всего: 9

Рис. 6. Типы химерных транскриптов MLL-EPS15. Белые прямоугольники — экзоны гена MLL, серые — экзоны гена EPS15. Нумерация экзонов гена MLL дана по работе I. ШЬон et а1. [53], нумерация экзонов EPS15 — согласно референсной последовательности NM_001981.2. Праймеры для проведения гнездной ОТ-ПЦР схематически представлены в виде черных прямоугольников. Цифры внутри черных прямоугольников соответствуют местам начала и конца праймера по отношению к нормальной мРНКсоответствующего транскрипта. Цифры под схематическим изображением экзонов соответствуют началу экзона. * — цифры в скобках соответствуют числу пациентов, впервые описанных в данной работе

Лп 11 ™

Цикл ПЦР-РВ

10-кратные разведения плазмиды

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Цикл ПЦР-РВ

Рис. 7. Получение и оценка калибровочной кривой для последующего проведения количественного анализа химерного транскрипта MLL-EPS15 в кДНК пациентов: а — 10-кратные разведения плазмиды, несущей фрагмент транскрипта MLL-EPS15; б — калибровочная кривая, полученная на основании 10-кратных разведений плазмиды, с аналитическими характеристиками; в — чувствительность созданной комбинации праймеров и зонда методом 10-кратных лимитирующих разведений составила 1 х 10-5. Одно из разведений 1 х 10-6 лежит за пределом линейности, во втором — амплификация отсутствует

2

а День 0 День 15 День 36 День 43 Консоли- Консоли- Консоли- Поддерж.

дация I дация II дация III терапия

0,193

0,051 0.«5 ОгОН

День 0 День 15 День 36 День 43 Консолидация I Рецидив

День 0 День 36 День 43 Консоли- Консоли- Консоли- Поддерж.

дация I дация II дация III терапия

«о.ооЧ 14,029

4,ra \

V.2« ^ 0,070

о,ооа 0,00В

0,003 ^ cToos 0,00В 0,008

0,002 0,001

Рис. 8. Результаты мониторинга МОБ в кДНК пациентов № 30 (а), № 32 (б), № 33 (в). На всех графиках синим цветом показана величина МОБ, красным — чувствительность (нижний предел детекции), рассчитанные согласно рекомендациям консорциума «Европа против рака» [49]. В тех точках, где кривые чувствительности и МОБ сходятся, пациент становился МОБ-негативным

а б

Для пациентов № 30, 31 и 33 проведено также определение МОБ путем количественной оценки химерного гена в геномной ДНК. Параметры калибровочных кривых, полученные при использовании индивидуально подобранных комбинаций зондов и прай-меров, приведены в табл. 3. Все значения укладываются в диапазоны, рекомендованные рабочей группой ESG-MRD-ALL [51] с дополнениями T. Burmeister et al. [50] (рис. 9). Пример определения абсолютного количества MLL-EPS15 в геномной ДНК у пациента № 31 приведен на рис. 10.

Сравнение результатов качественного определения МОБ в кДНК и геномной ДНК у пациентов с наличием MLL-EPS15 проведено в 23 образцах. В 21 (92 %) из них были получены идентичные результаты. В 2 случаях МОБ была выявлена только в кДНК, но не в геномной ДНК, что, скорее всего, связано с более высокой чувствительностью методики по определению химерного транскрипта. Несмотря на различные величины МОБ, получаемые при использовании различных подходов для мониторирования MLL-EPS15, нами была выявлена сходная кинетика МОБ при определении в геномной ДНК и кДНК (рис. 11).

Прогностическое значение транслокации t(1;11) (p32;q23) в настоящее время трудно оценить, посколь-

Таблица 3. Аналитические характеристики полученных калибровочных кривых

Коэффициент корреляции (R2) Угол наклона кривой (Slope) Точка пересечения с осью ординат (Y-intercept)

ПЦР-РВ химерного транскрипта

0,999 -3,356 38,790

ПЦР-РВ химерного гена в ДНК

Пациент № 30 0,990 -3,323 25,602

Пациент № 31 0,992 -2,987 21,987

Пациент № 32 0,996 -3,244 21,491

J

hl

¥ т

/Ш

io'v'WW

squared = 0,992 _

Slope = -2,987 ZY-intercept = 21,987

t-

Цикл ПЦР-РВ

Цикл ПЦР-РВ

10-кратные разведения ДНК пациента до лечения

Рис. 9. Получение и оценка калибровочной кривой для последующего проведения количественного анализа химерного гена MLL-EPS15 в геномной ДНК пациента № 31: а — 10-кратные разведения ДНК пациента, взятой до лечения в смеси ДНК от 5-го пациента без онкогематологических заболеваний; б — калибровочная кривая, полученная на основании 10-кратных разведений с аналитическими характеристиками; в — амплификация контрольного гена NAGK во всех образцах, использовавшихся для получения калибровочной кривой

б

в

День 0 День 8 День 15 День 36 День 43 Консоли- Консоли- Рецидив

дация I дация II

Рис. 10. Определение МОБ в геномной ДНК. Динамика количества химерного гена МЫ-ЕР315 в геномной ДНК у пациента № 31. Красной горизонтальной линией обозначен предел чувствительности, рассчитанный исходя из рекомендаций ESG-MRD-ALL [51]. Два образца, значения которых лежат ниже уровня чувствительности, являются негативными

iC I

12

негативно позитивно кДНК

б

(И.М0

День 15 День 36 День 43 Консолидация I Рецидив

¡,02401 t.WIO' »«p,21t>

\ T.M'W

\ 2,570 V 1.00Ч0-1

V.Mi ^0,015 \

Предел чувствительности Щ/ 7,0П»*

Рис. 11. Сравнение результатов определения МОБ в кДНК и геномной ДНК: а — сходимость в 23 образцах пациентов составила 92 %; б — кинетика МОБ, определенной в кДНК (синий цвет) и ДНК (красный цвет) у пациента № 32. Синей и красной горизонтальными линиями указаны пределы чувствительности в кДНК и ДНК соответственно

ку эта аномалия является весьма редкой. Из доступной литературы мы выбрали данные о выживаемости пациентов, начиная с середины 1980-х годов. За это время терапевтические подходы претерпели значительные изменения, и, соответственно, улучшилась эффективность лечения как ОЛЛ, так и ОМЛ. В анализ ОВ было включено 12 пациентов с ОЛЛ и 6 больных с ОМЛ. Внутри этой группы ОВ составила 0,37 ± 0,12 с медианой наблюдения 38 мес (диапазон 5—140 мес), а БСВ — 0,33 ± 0,11. ОВ и БСВ в исследуемой группе

не зависели от типа ОЛ и возраста пациентов (рис. На и 126). Однако при более детальном разделении на группы было показано, что ОВ и БСВ в группе мальчиков с ОЛЛ младше 1 года были достоверно ниже, чем у девочек с ОЛЛ этой же возрастной группы (0 и 0,64 ± 0,21, p = 0,033; 0 и 0,46 ± 0,18, p = 0,049 соответственно) (рис. 12в и 12г).

Обсуждение

Транслокация t(1;11)(p32;q23) — относительно редкая генетическая перестройка, возможно, именно с этим связано небольшое количество работ, посвященных этой хромосомной аномалии. Так, на крупнейшем онлайн-ресурсе — Базе данных хромосомных аберраций и химерных генов F. Mitelman приводятся данные всего о 32 пациентах с транслокацией t(1;11) (p32;q23) [54]. Такие же цифры представлены в обзорной статье J.-L. Huret [55]. К сожалению, в этих источниках не разделены сведения о пациентах с первичными (n = 20) и вторичными ОЛ (n = 12), что затрудняет детальную оценку случаев ОЛ de novo. Участники Европейской рабочей группы по изучению перестроек 11q23 собрали информацию о 7 пациентах с транслокацией t(1;11)(p32;q23), включая 1 пациента со вторичным ОМЛ [4]. Мы в своей работе не касались случаев вторичных ОЛ из-за совершенно особой биологии опухолевого процесса у данной категории пациентов.

Мы подтвердили ранее опубликованные данные о более высокой частоте t(1;11)(p32;q23) у лиц женского пола [4, 55]. Также необходимо отметить, что для пациентов с наличием t(1;11)(p32;q23) характерны общие черты всех MLL-позитивных ОЛ: преимущественное выявление у детей первого года жизни, доминирование CD10-негативного иммунофенотипа при ОЛЛ и М5 морфологического варианта при ОМЛ, частый инициальный гиперлейкоцитоз [56—58].

Согласно ранее опубликованным данным транслокация t(1;11)(p32;q23) наблюдается примерно с одинаковой частотой как при ОЛЛ, так и при ОМЛ [3, 4, 55]. Интересно, что нами ранее не выявлено ни одного случая ОМЛ с данной хромосомной аномалией. Отчасти это можно объяснить тем, что мы ограничили свой выбор изучением только детей первого года жизни, хотя и в этой возрастной группе встречается ОМЛ с t(1;11). Возможно, что отсутствие случаев с относительно редкой транслокацией t(1;11) объясняется малочисленностью (58 человек) нашей группы больных с ОМЛ, среди которой перестройки 11q23/MLL выявлены в половине случаев [59]. В то же время частота обнаружения t(1;11)(p32;q23) среди всех перестроек 11q23/MLL у детей первого года жизни с ОЛЛ по нашим наблюдениям достигает 6 % [60], что значительно выше, чем по литературным данным. Возможно, этот вопрос требует отдельного исследования на большем числе пациентов.

Прогностическое значение t(1;11)(p32;q23)/MLL-EPS15 трудно оценить, как в силу небольшого числа на-

а

День 0

СО

и

LO

0,91 0,8 I

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2

0,1 . 0,0

20 40 60 80 100 120 Время наблюдения, мес

140

В

О

Вся группа; n = 20; в ППР - 8; БСВ 0,33 ± 0,11

ОЛЛ; n = 14; в ППР - 5; БСВ 0,29 ± 0,13

ОМЛ; n = 6; в ППР - 3; БСВ 0,41 ± 0,22

ОЛЛ младше 1 года; n = 12; в ППР - 5; БСВ 0,35 ± 0,15

^гл 0,9

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2

0,1 0,00

20 40 60 80 100 120 Время наблюдения, мес

140

Вся группа; п = 18; живы - 8; ОВ 0,37 ± 0,12

ОЛЛ; п = 12; живы - 5; ОВ 0,33 ± 0,15

ОМЛ; п = 6; живы - 3; ОВ 0,40 ± 0,21

ОЛЛ младше 1 года; п = 10; живы - 5; ОВ 0,42 ± 0,17

20 30 40 50 60 Время наблюдения, мес

20 40 60 80 100 120 Время наблюдения, мес

140

ОЛЛ < 1 года мальчики; n = 3; в ППР - 0; БСВ 0 ОЛЛ < 1 года девочки; n = 9; в ППР - 5; ОВ 0,46 ± 0,1 i

ОЛЛ < 1 года мальчики; n = 3; живы - 0; ОВ 0 ОЛЛ < 1 года девочки; n = 7; живы - 5; ОВ 0,64 ± 0,21

Рис. 12. Оценка прогностического значения ^1;11)(р32^23) /MLL-EPS15: а — показатели БСВ в общей группе пациентов, а также пациентов с ОЛЛ, ОМЛ и ОЛЛ в возрасте младше 1 года; б — показатели ОВ в вышеупомянутых группах; в и г — БСВ и ОВ соответственно у пациентов первого года жизни с ОЛЛ в зависимости от пола. ППР — полная продолжающаяся ремиссия

б

а

в

г

блюдений, так и гетерогенности терапевтических подходов, использовавшихся у данной группы пациентов. Мы, так же как и J.-L. Huret [55], при ОЛЛ выявили достоверно более низкие показатели БСВ и ОВ у пациентов мужского пола в возрасте младше 1 года по сравнению с девочками данной возрастной группы, но следует принимать во внимание, что в исследуемой группе было всего 12 пациентов (9 девочек и 3 мальчика). Более того, из-за отсутствия данных о том, живы ли 2 из 9 девочек, они были исключены из расчета вероятности ОВ.

Целенаправленное исследование структуры химерного гена MLL-EPS15 было выполнено лишь однажды:

C. Meyer et al. приводят собственные данные о 13 пациентах, включая 12 случаев ОЛ у детей [3]. Однако в этой работе отсутствуют клинико-лабораторные характеристики пациентов с MLL-EPS15 при ОЛ. Точка разрыва в гене EPS15 у обследованных нами пациентов локализовалась либо в интроне 1, на долю которого приходится около 30 % всех случаев формирования химерного гена MLL-EPS15 [3], либо в не-кодирующей последовательности ДНК в хромосомном районе 1p32 в непосредственной близости от 5'-конца гена MLL. В гене MLL точки разрыва у обследованных нами пациентов располагаются в 10-м

и 11-м интронах, что хорошо согласуется с ранее опубликованными данными [3, 50, 61].

Несмотря на относительно небольшую частоту встречаемости транслокации t(1;11)(p32;q23), важно проводить ее молекулярный мониторинг, который, как было показано ранее, позволяет прогнозировать исходы терапии [62]. Технически определение МОБ может быть проведено как методом FISH, так и ПЦР. Первый метод более универсален, но обладает низкой чувствительностью: в среднем он способен выявлять

1 бластную клетку среди 500—1000 нормальных. Довольно часто для оценки МОБ используется количественное определение индивидуальных клональных перестроек генов Т-клеточных рецепторов (TCR) и тяжелых цепей иммуноглобулинов (IgH) методом количественной ПЦР-РВ со специфичными для каждого пациента праймерами и зондом. Однако ранее было показано, что по сравнению со старшими детьми у детей первого года этот метод имеет ограниченное применение вследствие того, что в данной группе пациентов перестройки IgH/TCR встречаются реже и часто являются олигоклональными [63, 64]. Применение проточной цитометрии, еще одного метода, широко используемого для мониторинга МОБ у детей и взрослых, также может быть затруднено в данной возрастной группе вследствие совершенно особого иммуно-фенотипа опухолевых клеток [65—67] и нестабильной экспрессии антигенов под действием химиопрепара-тов [68, 69]. Альтернативой может служить мониторинг МОБ путем определения химерного гена в геномной ДНК методом ПЦР-РВ. Для этого необходимо предварительно определить индивидуальную для каждого пациента точку слияния гена MLL и гена-партнера и, исходя из сиквенса зоны слияния

2 генов, подобрать комбинацию праймеров и зонда [51, 70]. Проведенное сопоставление показало хорошее совпадение результатов с данными МОБ, получаемыми при использовании IgH/TCR [70]. Наконец, в качестве мишени для оценки МОБ можно использовать химерный транскрипт в мРНК/кДНК, определяемый методом ПЦР-РВ [48, 71]. Нами в качестве основного метода для мониторирования МОБ была

выбрана ПЦР с определением химерного гена МЬЬ-ЕРБ15 в геномной ДНК и химерного транскрипта в РНК/кДНК. Наш выбор связан с тем, что и химерные гены, и химерные транскрипты представляют собой стабильные мишени для определения МОБ [37, 48, 72], патогенетически связанные с развитием ОЛ, так как они выявляются только в опухолевых клетках.

Подобранные условия ПЦР позволили нам успешно провести мониторинг МОБ во всех доступных образцах пациентов, что дало возможность оценить ответ опухоли на химиотерапию. На основании данных, получаемых при мониторинге МОБ, уже сегодня проводится стратификация пациентов с ОЛЛ, получающих терапию по большинству современных протоколов.

Заключение

Транслокация 1(1;11)(р32;д23) при ОЛ наиболее часто выявляется у детей первого года жизни. Медиана возраста составляет 8 мес. Соотношение девочек и мальчиков 2:1. В 38 % случаев у пациентов с транслокацией 1(1;11)(р32;д23) обнаружены ДХА. Наиболее часто зоной разрывов в гене ЕРБ15 является интрон 1, в гене МЬЬ — интроны 10 и 11. Описано 4 типа химерных транскрип-тов МЬЬ-ЕРБ15. Создана и успешно применена комбинация праймеров, флуоресцентных зондов и плазмиды для мониторирования химерного транскрипта МЬЬ-ЕРБ15 методом ПЦР-РВ. Подобраны условия и проведен мониторинг МОБ по индивидуальным точкам разрыва в геномной ДНК у пациентов с наличием химерного гена МЬЬ-ЕРБ15. Сравнение результатов определения МОБ в геномной ДНК и кДНК показало высокую качественную сопоставимость (92 %).

Благодарность. Авторы выражают искреннюю благодарность врачам-гематологам, детским онкологам из Областной детской клинической больницы № 1 (Екатеринбург), Республиканского научно-практического центра детской онкологии, гематологии и иммунологии (Минск), Российской детской клинической больницы (Москва), Морозовской детской городской клинической больницы (Москва), предоставившим данные о пациентах, описанных в этой статье.

ЛИТЕРАТУРА

1. Armstrong S., Look A. Molecular genetics of acute lymphoblastic leukemia. J Clin Oncol 2005;23:6306-15.

2. Schoch C., Schnittger S., Klaus M. et al. AML with 11q23/MLL abnormalities as defined by the WHO classification: incidence, partner chromosomes, FAB subtype, age distribution, and prognostic impact in an unselected series of 1897 cytogenetically analyzed AML cases. Blood 2003;102:2395-402.

3. Meyer C., Kowarz E., Hofmann J. et al. New insights to the MLL recombinome of acute leukemias. Leukemia 2009;23:1490-9.

4. Harrison C., Cuneo A., Clark R. et al. Ten novel 11q23 chromosomal partner sites. Leukemia 1998;12:811-22.

5. Williams D., Look A., Melvin S. et al. New chromosomal translocations correlate with specific lmmunophenotypes of childhood acute lymphoblastic leukemia. Cell 1984;36:101-9.

6. Kaneko Y., Maseki N., Takasaki N. et al. Clinical and hematologic characteristics in acute leukemia with 11q23 translocations. Blood 1986;67:484-91.

7. Gregoire M., Peeters M., Bene M. et al. Karyotype, immunophenotype, and clinical outcome: correlations in childhood acute lymphoblastic leukemia. Haematol Blood Transfus 1987;30:504-8.

8. Selypes A., Laszlo A. A new translocation t(1;4;11) in congenital acute nonlymphocytic

leukemia (acute myeloblastic leukemia). Hum Genet 1987;76:106-8.

9. Hagemeijer A., van Dongen J., Slater R. et al. Characterization of the blast cells in acute leukemia with translocation (4;11): report of eight additional cases and of one case with a variant translocation. Leukemia 1987;1:24-31.

10. Raimondi S., Peiper S., Kitchingman G. et al. Childhood acute lymphoblastic leukemia with chromosomal breakpoints at 11q23. Blood 1989;73:1627-34.

11. Shippey C., Lawlor E., Secker-Walker L. Isochromosome 9q in acute lymphoblastic leukemia: a new non-random finding. Leukemia 1989;3:195-9.

12. Abshire T., Buchanan G., Jackson J.

et al. Morphologic, immunologic and cytogenetic studies in children with acute lym-phoblastic leukemia at diagnosis and relapse: a Pediatric Oncology Group study. Leukemia 1992;6:357-62.

13. Bernard O., Mauchauffe M., Mecucci C. et al. A novel gene, AF-1p, fused to HRX in t(1;11)(p32;q23), is not related to AF-4, AF-9 nor ENL. Oncogene 1994;9: 1039-45.

14. Felix C., Hosler M., Slater D. et al. MLL genomic breakpoint distribution within the breakpoint cluster region in de novo leukemia in children. J Pediatr Hematol Oncol 1998;20:299-308.

15. Bergh von A., Emanuel B., Zelderen-Bhola van S. et al. A DNA probe combination for improved detection of MLL/11q23 breakpoints by double-color interphase-FISH in acute leukemias. Genes Chromosomes and Cancer 2000;28:14-22.

16. Chessells J., Harrison C., Kempski H. et al. Clinical features, cytogenetics and outcome in acute lymphoblastic and myeloid leukaemia of infancy: report from the MRC Childhood Leukaemia working party. Leukemia 2002;16:776-84.

17. Park K., Lee D., Lee H. et al. Granulocytic Sarcoma in MLL-Positive Infant Acute Myelogenous Leukemia: Fluorescence in Situ Hybridization Study of Childhood Acute Myelogenous Leukemia for Detecting MLL Rearrangement. Am J Pathol 2001;159(6):2011-6.

18. Kim H., Cho H., Kim E. et al. A study on 289 consecutive Korean patients with acute leukaemias revealed fluorescence in situ hybridization detects the MLL translocation without cytogenetic evidence both initially and during follow-up. Br J Haematol 2002;119(4):930-9.

19. Douet-Guilbert N., Morel F., Le Bris M. et al. Rearrangement of the MLL gene in acute myeloblastic leukemia: report of two rare translocations. Cancer Genet Cytogenet 2005;157:169-74.

20. Sagawa M., Shimizu T., Shimizu T. et al. Establishment of a new human acute monocytic leukemia cell line TZ-1 with t(1;11)(p32;q23) and fusion gene MLL-EPS15. Leukemia 2006;20:1566-71.

21. Kotecha R., Ford J., Beesley A. et al. Molecular characterization of identical, novel MLL-EPS15 translocation and individual genomic copy number alterations in monozygotic infant twins with acute lymphoblastic leukemia. Haematologica 2012;97:1447-50.

22. Kotecha R., Murch A. Kees U., Cole C. Pre-natal, clonal origin of t(1;11)(p32;q23) acute lymphoblastic leukemia in monozygotic twins. Leuk Res 2012;36:46-50.

23. Nakamura H., Hata T., Tagawa M. et al. Chromosome 1 abnormalities at band 1p32 in two atomic bomb survivors with myelodys-plastic syndrome. Rinsho Ketsueki 2000;41:152-8.

24. http://www.genecards.org/cgi-bin/ carddisp.pl?gene=EPS15.

25. http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/ Gene/Summary?g=ENSG00000085832; r=1:51819935-51985000.

26. Su A., Wiltshire T., Batalov S. et al. A gene atlas of the mouse and human protein-encoding transcriptomes. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101:6062-7.

27. Salcini A., Chen H., Iannolo G. et al. Epidermal growth factor pathway substrate 15, Eps15. Int J Biochem Cell Biol 1999;31:805-9.

28. Parachoniak C., Park M. Distinct recruitment of Eps15 via its coiled-coil domain is required for efficient down-regulation of the MET receptor tyrosine kinase.

J Biol Chem 2009;284(13):8382-94.

29. Hess J. MLL: a histone methyltransferase disrupted in leukemia. Trends in Molecular Medicine 2004;10(10):500-7.

30. Slany R. The molecular biology of mixed lineage leukemia. Haematol 2009;94:984-93.

31. Armstrong S., Staunton J., Silverman L. et al. MLL translocations specify a distinct gene expression profile that distinguishes a unique leukemia. Nat Genet 2002;30:41-7.

32. Ferrando A., Armstrong S., Neuberg D. et al. Gene expression signatures in MLL-rearranged T-lineage and B-precursor acute leukemias: dominance of HOX dysregulation. Blood 2003;102:262-8.

33. Yeoh E., Ross M., Shurtleff S. et al. Classification, subtype discovery, and prediction of out-come in pediatric acute lymphoblastic leukemia by gene expression profiling. Cancer Cell 2002;1:133-43.

34. Ayton P., Cleary M. Transformation of myeloid progenitors by MLL oncoproteins is dependent on Hoxa7and Hoxa9. Genes and Development 2003;17:2298-307.

35. Trentin L., Giordan M., Dingermann Th. et al. Two independent gene signatures in pediatric t(4;11) acute lympho-blastic leukemia patients. Euro J Haematol 2009;83:406-19.

36. Pallisgaard N., Hokland P., Riishoj D. et al. Multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction for simultaneous screening of 29 translocations and chromosomal aberrations in acute leukemia. Blood 1998;92:574-88.

37. Dongen van J., Macintyre E., Gabert J. et al. Standardized RT-PCR analysis

of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia 1999;13:1901-18.

38. Fechina L., Shorikov E., Tsaur G. et al. Contribution of all-trans retinoic acid to improved early relapse-free outcome

in infant acute lymphoblastic leukemia comparing to the chemotherapy alone. Blood 2007;110(11):832А; abstr. 2828.

39. ISCN 1995: An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (1995). Ed. Mitelman F. Basel: S. Karger, 1995.

40. ISCN 2005: An International System For Human Cytogenetic Nomenclature (2005). Eds.: Shaffer L., Tommerup N. Basel: S. Karger, 2005.

41. ISCN 2009: An International System For Human Cytogenetic Nomenclature (2009). Eds.: Schaffer L., Slovak M., Campbell L. Basel: S. Karger, 2009.

42. Coenen E., Raimondi S., Harbott J. et al. Prognostic significance of additional cytogenetic aberrations in 733 de novo pediatric 11q23/MLL -rearranged AML patients: results of an international study. Blood 2011;117:7102-11.

43. WHO Classification of Tumours

of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Eds.: Swerdlow S., Campo E., Harris N. et al. Lyon, France: IARC, 2008.

44. Betts D., Ammann R., Hirt A. et al. The prognostic significance of cytogenetic aberrations in childhood acute myeloid leukaemia. A study of the Swiss Paediatric Oncology Group (SPOG). Eur J Haematol 2007;78(6):468-76.

45. Meyer C., Schneider B., Reichel M.

et al. Diagnostic tool for the identification of MLL rearrangements including unknown partner genes. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102(2):449-54.

46. Цаур Г.А., Наседкина Т.В., Попов А.М. и др. Время достижения молекулярной ремиссии как фактор прогноза у детей первого года жизни острым лимфобластным лейкозом. Онкогематол 2010;2:46-54.

47. Цаур Г.А., Друй А.Е., Попов А.М. и др. Возможность использования микроструйных биочипов для оценки качества и количества РНК у пациентов с онкологическими и онкогематологи-ческими заболеваниями. Вестн Урал мед акад науки 2011;4:107-11.

48. Gabert J., Beillard E., Velden van der V. et al. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer Program. Leukemia 2003;17:2318-57.

49. Beillard E., Pallisgaard N., "Vfelden van der V. et al. Evaluation of candidate control genes for diagnosis and residual disease detection in leukemic patients using 'real-time'

quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RQ-PCR) — a Europe Against Cancer Program. Leukemia 2003;17:2474-86.

50. Burmeister T., Marschalek R., Schneider B. et al. Monitoring minimal residual disease by quantification of genomic chromosomal breakpoint sequences in acute leukemias with MLL aberrations. Leukemia 2006;20:451-7.

51. Velden van der V., Cazzaniga G., Schrauder A. et al. Analysis of minimal residual disease by Ig/TCR gene rearrangements: guidelines for interpretation of real-time quantitative PCR data. Leukemia 2007;21:604-11.

52. Kaplan E., Meier P. Non-parametric estimation from incomplete observations. J Am Stat Assoc 1958;53:457-81.

53. Nilson I., Loechner K., Siegler G. et al. Exon/intron structure of ALL1 (MLL) gene involved in translocations to chromosomal region 11q23 and acute leukemias. Br J Haematol 1996;94(4):966-72.

54. Mitelman database of chromosome aberrations and gene fusions in cancer (2012). Mitelman F., Johansson B. Mertens F. (eds.). http://cgap.nci.nih.gov/ Chromosomes/Mitelman.

55. Huret J.-L. t(1;11)(p32;q23). Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol (September 2010). http:// AtlasGeneticsOncology.org/Anomalies/ t0111p32q23ID1046.html.

56. Chowdhury T., Brady H. Insights from clinical studies into the role of the MLL gene in infant and childhood leukemia. Blood Cells Mol Dis 2008;40:192-9.

57. Forestier E., Schmiegelow K. The incidence peaks of the childhood acute leuke-mias reflect specific cytogenetic aberrations. J Pediatr Hematol Oncol 2006;28:486-95.

58. Zweidler-McKay P., Hilden J. The ABCs of Infant Leukemia. Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care 2008;38(3):78-94.

59. Цаур ГА., Флейшман Е.В., Гиндина Т.Л. и др. Характеристика перестроек 11q23/MLL при остром миелоидном лейкозе у детей первого года жизни. Клин онкогематол 2012;5(4):365—71.

60. Цаур Г.А., Попов А.М., Алейникова О.В. и др. Характеристика перестроек 11q23 (MLL) у детей первого года жизни с острым лимфобластным лейкозом. Онкогематол 2011;3:57-64.

61. Meyer C., Schneider B., Jakob S. et al. The MLL recombinome of acute leukemias. Leukemia 2006;20:777-84.

62. Цаур Г.А., Попов А.М., Наседкина Т.В. и др. Прогностическое значение минимальной остаточной болезни, определенной путем выявления химерных транскриптов у детей первого года жизни, больных острым лимфобластным лейкозом, получающих терапию по протоколу MLL-BABY. Гематол и трансфузиол 2012;57(4):12-22.

63. Jansen M., Corral L., Velden van der V. et al. Immunobiological diversity in infant acute lymphoblastic leukemia is related

to the occurrence and type of MLL gene rearrangement. Leukemia 2007;21:633-41.

64. Peham M., Panzer S., Fasching K. et al. Low frequency of clonotypic Ig and T-cell receptor gene rearrangements in t(4;11) infant acute lymphoblastic leukaemia and its implication for the detection of minimal residual disease. Br J Haematol 2002;117:315-21.

65. De Zen L., Bicciato S., te Kronnie G., Basso G. Computational analysis of flow-cytometry antigen expression profiles in childhood acute lymphoblastic leukemia: an MLL/AF4 identification. Leukemia 2003;17:1557-65.

66. Schwartz S., Rieder H., Schlaeger B.

et al. Expression of the human homologue of rat NG2 in adult acute lymphoblastic leukemia: close association with MLL rearrangement and a CD10(-)/CD24(-)/CD65s(+)/ CD15(+) B-cell phenotype. Leukemia 2003;17:1589-95.

67. Attarbaschi A., Mann G., König M. et al. Mixed lineage leukemia-rearranged childhood pro-B and CD10-negative pre-B acute lymphoblastic leukemia constitute a distinct clinical entity. Clin Cancer Res 2006;12:2988-94.

68. Попов А.М., Вержбицкая Т.Ю., Цаур Г.А. и др. Особенности мониторинга минимальной остаточной болезни при B-линейных острых лимфобластных лейкозах методом проточной цитометрии у детей первого года жизни. Дет онкол 2008;2:32-5.

69. Попов А.М., Вержбицкая Т.Ю., Цаур Г.А. и др. Возможности применения NG2 для мониторинга минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии у детей первого года жизни

с острым лимфобластным лейкозом, ассоциированным с реарранжировками гена MLL. Гематол и трансфузиол 2009;6:19-22.

70. Velden van der V., Corral L. Valsecchi M. et al. Prognostic significance of minimal residual disease in infants with acute lym-phoblastic leukemia treated within the Inter-fant-99 protocol. Leukemia 2009;23:1073-9.

71. Jansen M., Vlden van der V., Dongen van J. Efficient and easy detection of MLL-AF4, MLL-AF9 and MLL-ENL fusion gene transcripts by multiplex real-time quantitative RT-PCR in TaqMan and LightCycler. Leukemia 2005;19(11):2016-18.

72. Szczepanski T. Why and how to quantify minimal residual disease in acute lymphoblastic leukaemia. Leukemia 2007;21:622-6.