CC BY
26
Характеристика перестроек 11q23 (MLL) у детей первого года жизни с острым ;" лейкозом
Г.А. Цаур1,2, А.М. Попов1,2, О.В. Алейникова3, Э.Г. Бойченко4, Т.Ю. Вержбицкая1,2, Е.В. Волочник3,
А.С. Иванова1,2, О.В. Каленник5, С.Ю. Ковалев6, К.Л. Кондратчик7, А.М. Кустанович3, Е.С Лапотентова3, Д.В. Литвинов8, И.С. Мартынкевич9, Н.В. Мякова8, Т.В. Наседкина5, В.А. Овсепян10, Ю.В. Ольшанская8,
О.М. Плеханова1, А.В. Попа11, Т.О. Ригер1,2, Л.И. Савельев1,2,11, О.В. Стренева1,2, М.В. Стригалева1,
И.В. Шмунк12, Е.В. Шориков1,2, Л.Г. Фечина1,2 1ГУЗ Областная детская клиническая больница № 1, Екатеринбург;
2ГУЗ СО Институт медицинских клеточных технологий, Екатеринбург;
3ГУРеспубликанский научно-практический центр детской онкологии и гематологии, Минск;
4ГУЗДетская городская больница № 1, Санкт-Петербург;
5Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва;
6ФГАОУВПО Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина, Екатеринбург; 7Морозовская детская городская клиническая больница, Москва;
8ФГБУФедеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева
Минздравсоцразвития России, Москва;
9 ФГУ Российский НИИ гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства, Санкт-Петербург; 10 ФГУ Кировский НИИ гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства;
11 ГОУ ВПО Уральская государственная медицинская академия, Екатеринбург;
12ОГУП Челябинская областная станция переливания крови
Контакты: Григорий Анатольевич Цаур tsaur@mail.ru
Целью данной работы являлась характеристика перестроек 1^23 (МП,) у детей первого года жизни с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), включая частоту их выявления, взаимосвязь с различными иммунологическими вариантами СИЛ, а также определение структуры химерных транскриптов у пациентов исследуемой группы. Для этого нами обследовано 117пациентов с О1Л без синдрома Дауна в возрасте от 1 до 365дней. Перестройки 1^23 (МП были выявлены у 74 (63,2%) пациентов. В этой группе преобладала транслокация Ц4;11)^21;q23)/MLL-AF4 — 63,5% случаев, реже встречались ЦП;19)^23;р13)/МИ,-МП1Т1 — 18,9% случаев, ^10;11)(р12; q23)/MLL-MLLT10 и ^1;11)(р32; q23)/MLL-EPS15 — по 6,8 % случаев; (9;11)(р22; q23)/MLL-МППТ3 — в 2,7 %. У пациентов младше 6 мес перестройки 1^23 (МП П) были выявлены достоверно чаще, чем у пациентов в возрасте 6—12 мес — 84,0 % и 47,8 % случаев соответственно (р < 0,001). В1-вариант ОЛЛ статистически значимо чаще, а ВП-ОЛЛзначительно реже встречались у пациентов с наличием аномалий 1^23 (МП) по сравнению с теми, у кого эти транслокации не были выявлены (р < 0,001 в обоих случаях). У 26 пациентов с различными перестройками гена МП П было проведено определение структуры химерного транскрипта. В зависимости от локализации точки слияния в гене МП П и генах-партнерах выявлено 7вариантов химерного транскрипта МПП-АГ4, 3 варианта МПП-МППТ1, 2 варианта MLL-EPS15. В 14 (53,8 %) случаях точка слияния располагалась в 11-м экзоне гена МПП.
Ключевые слова: острый лимфобластный лейкоз, дети первого года жизни, транслокации района 1^23, перестройки гена МПП
Detection of 11q23 (MLL) rearrangements in infant acute lymphoblastic leukemia
G.A. Tsaur1,2, A.M. Popov1’2, O.V.Aleynikova3, E.G. Boychenko4, T.Yu. Verzhbitskaya1’2, E.V Volochnik3, A.S. Ivanova1’2, O.V. Kalennik5, S.Yu. Kovalev6, K.L. Kondtratchik7, A.M. Kustanovich3, E.S. Lapotentova3, D.V. Litvinov8, I.S. Martynkevich9, N.V. Myakova8, T.V. Nasedkina5, V.A. Ovsepyan10, Yu.V. Olshanskaya8, O.M. Plehanova1, A.V. Popa11, T.O. Riger1,2,
L.I. Savelyev12,11, O.V. Streneva1,2, M.V. Strigaleva1, I.V. Shmunk12, E.V. Shorikov12, L.G. Fechina12
1Regional Children’s Hospital № 1, Yekaterinburg;
2Research Institute of Medical Cell Technologies, Yekaterinburg;
3Belarusian Research Center for Pediatric Oncology and Hematology, Minsk;
4Children’s Municipal Hospital № 1, St.-Petersburg;
5Engelgardt Institute of Molecular Biology Russian Academy of Science, Moscow;
6B. Eltsyn Ural Federal University, Yekaterinburg;
7Morozov Pediatric Municipal Clinical Hospital, Moscow;
8Federal Research Institute of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Moscow;
9Russian Research Institute of Hematology and Transfusiology, St.-Petersburg;
10Kirov Research Institute of Hematology and Transfusiology;
11Ural State Medical Academy, Yekaterinburg;
12Chelyabinsk Regional Blood Transfusion Station
117 cases of infant acute lymphoblastic leukemia without Down syndrome (aged from 1 to 365 days) were included in the current iudy. Rearrangements of 11q23 (MLL) were revealed in 74 (63.2%) patients. Among this group the most common rearrangement was t(4;11)
3 ’201 1
18320131013131
3 ’201 1
(q21;q23)/MLL-AF4 detected in 63.5 %> cases, less frequently wasfound t(11;19)(q23;p13)/MLL-MLLT1 (in 18.9 %> cases), t(10;11) (p12;q23)/MLL-MLLT10 and t(1;11)(p32;q23)/MLL-EPS15 (each one in 6.8 %), t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3 in 2.7 %. Children under 6 months of age had significantly higher incidence of 11q23 (ML L) rearrangements in comparison with infants olde r than 6 months (84.0 % vs. 47.8 %, p < 0.001). Patients with translocations 11q23 (MLL) more frequently had BI-ALL and less frequently BII-ALL than children without these rearrangements (p < 0.001 for both). Fusion gene transcript w as sequenced in 26 MLL-rearranged cases. Depending on breakpoint position within ML L and partner genes we detected 7 different types of ML L-AF4 fusion gene transcript, 3 types of MLL-MLLT1, 2 types of MLL-EPS15. The most common fusion site within MLL gene was exon 11, detected in 14 (53.8 %) patients.
O Key words: acute lymphoblastic leukemia, infants, translocation 11q23, MLL rearrangements
^ Введение
Ген MLL (myeloid/lymphoid or mixed lineage leukemia), располагающийся на длинном плече 11-й
О хромосомы в регионе 11q23, состоит из 37 экзонов [1]
ЗС и кодирует гистоновую метилтрансферазу. Перестрой-
Z ки с вовлечением района 11q23 и участием гена MLL
в встречаются примерно в 10 % всех случаев острого
лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) и в 3 % случаев острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) [2, 3]. Наиболее частыми генами-партнерами MLL являются AF4, MLLT1 (ENL), MLLT3 (AF9), MLLT4 (AF6), MLLT10 (AF10). Суммарно они встречаются более чем в 80 % всех случаев MLL-позитивных острых лейкозов у детей и взрослых [4].
Среди всех возрастных категорий наиболее часто перестройки гена MLL выявляются у детей первого года жизни с ОЛЛ [5, 6], где частота их выявления может достигать 79 % [7, 8]. Несмотря на относительную редкость ОЛЛ у детей данной возрастной группы, он представляет большой интерес для исследователей как из-за неблагоприятного прогноза [9—13], так и из-за особенностей биологии опухоли и наличия широкого спектра перестроек гена MLL [6, 14], которые могут возникать in utero [10, 15].
По механизму образования все перестройки 11q23 (MLL) можно разделить на инверсии, делеции, внутренние тандемные повторы, вставки, транслокации с вовлечением 3 и более хромосом, а также комбинации различных вариантов, например транслокация с одновременной делецией части гена MLL [4]. Наиболее часто встречаются реципрокные транслокации, на долю которых приходится более 80 % всех случаев перестроек 11q23 (MLL) как при ОЛЛ, так и при ОМЛ [16]. На сегодняшний день на молекулярном уровне охарактеризовано 64 транслокации [4]. Столь большое число перестроек затрудняет проведение молеку ляр-но-генетической диагностики и верификацию гена-партнера[12].
Необходимо отметить, что особую ценность приобретает выявление перестроек гена MLL в свете того, что они представляют собой удобную мишень для мо-ниторирования минимальной остаточной болезни (МОБ) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Ранее, в рамках протокола MLL-Baby [17], нам удалось показать прогностическую значимость выяв-
ления МОБ данным способом [18], а также раннего достижения молекулярной ремиссии у пациентов с наличием различных перестроек гена MLL [19].
Целью данной работы являлась характеристика перестроек гена MLL (11q23) у детей первого года жизни с ОЛЛ.
Материалы и методы
Проанализированы данные 117 пациентов с ОЛЛ без синдрома Да уна в возрасте от 1 до 365 дней (медиана — 211 дней). Их подробная характеристика представлена в табл. 1. Диагноз ОЛЛ у станавливался на основании стандартных цитоморфологических показателей [20], дополненных данными иммуно-фенотипирования согласно критериям группы EGIL (European Group for the Immunological Characterization of Leukemias) [21]. Все пациенты получали терапию по одному из следующих химиотерапевтических протоколов: MLL-Baby, ALL-MB-2002, ALL-MB-2008, ALL-BFM 90, ALL-MB 91, CO ALL в детских онко-гематологических клиниках Российской Федерации
Таблица 1. Инициальные данные 117детей первого года жизни с ОЛЛ
n %
Возраст
Младше 6 мес 50 42,7
Старше 6 мес 67 57,3
Пол
Мужской 43 36,8
Женский 74 62,2
Иммунофенотип
Нет данных 3 -
BI-ОЛЛ 59 51,8*
BII-ОЛЛ 35 30,7*
BIII-ОЛЛ 17 14,9*
Т-ОЛЛ 3 2,6*
* Процент рассчитан от 114 пациентов, которым было проведено иммунофенотипирование.
Таблица 2. Число пациентов, обследованных разными методами и их комбинациями
Метод Число пациентов
Цитогенетика как единственный метод 14
ОТ-ПЦР как единственный метод 38
FISH как единственный метод 1
Цитогенетика + ОТ-ПЦР 35
Цитогенетика + FISH 24
ОТ-ПЦР + FISH 29
Цитогенетика + ОТ-ПЦР + FISH 23
и Республики Беларусь. Информированное согласие на проведение диагностических и лечебных процедур было получено во всех случаях.
Для цитогенетического анализа использовали клетки костного мозга и периферической крови, которые брали до начала терапии и куль тивировали 1 ч («прямые препараты») и/или 24—48 ч. Препараты окрашивали G-методом с предварительной обработкой трипсином. В большинстве случаев анализировали не менее 20 метафазных пластинок. Кариотипиро-вание проводили в соответствии с международной номенклатурой хромосом человека [22]. В 30 случаях дополнительно проводили исследование методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с локус-специфичным зондом LSI MLL Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe (Abbott, США) согласно инструкции производителя.
Всем пациентам проводилось определение следующих химерных транскриптов: MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLL-MLLT3, MLL-MLLT4, MLL-MLLT10, MLL-ELL. У 11 пациентов с отсутствием вышеуказанных химерных транскриптов дополнительно определяли экспрессию MLL-SEPT9, MLL-MLLT11, MLL-EPS15 Выявление химерных транскриптов проводили методом гнездной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) или ОТ-ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе (набор реагентов «ЛК-Био чип», Биочип-ИМБ, Россия) по ранее описанным протоколам [19, 23—25]. В дальнейшем оба метода представлены как метод ОТ-ПЦР.
Число пациентов, обследованных разными методами и их комбинациями, приведено в табл. 2. Стандартное цитогенетическое исследование проведено 73 пациентам, ОТ-ПЦР — 102, FISH — 30. Все 3 метода одновременно применены у 23 пациентов. Использование того или иного метода выявления перестроек 11q23 (MLL) было обусловлено диагностическими возможностями каждой из лабораторий, проводивших обследование пациентов.
Для выявления типа химерных транскриптов проводили секвенирование полученных ПЦР-продуктов в прямом и обратном направлении на генетическом анализаторе «ABI Prism 3130» (Applied Biosystems, США) с использованием «BigDy e Terminator 3.1» (Applied Biosystems, США) согласно инструкции производителя.
При сравнении групп пациентов по качественным признакам применяли критерий х2 с поправкой Йетса. Различия считали достоверными прир < 0,05. Анализ результатов проводили с помощью программ для статистической обработки данных Statistica 6.0.
Результаты
В исследованной группе перестройки гена MLL (11q23) выявлены у 74 из 117 (64,2 %) пациентов.
Частота выявления перестроек 11q23 ( MLL) при использовании различных методов диагностики представлена в табл. 3. Сравнение частоты выявления перестроек 11q23 (MLL), проведенных разными методами, показало, что при использовании FISH перестройки гена MLL выявлялись несколько чаще (73,3 %), но полученные результаты статистически не отличались от результатов цитогенетического (60,3 %) и молекулярно-генетического (61,8 %) методов исследования (р = 0,303 и p = 0,326 соответственно).
Результаты цитогенетических и молекулярногенетических исследований представлены в табл. 4.
Таблица 3. Сравнение цитогенетического и молекулярногенетических методов для выявления перестроек 11q23 (MLL)
Метод Обследовано (n = 117) Выявлено (n = 74)
Цитогенетическое исследование 73 44 (60,3 %)
ОТ-ПЦР 102 63 (61,8 %)
FISH 30 22 (73,3 %)
Таблица 4. Выявленные перестройки 11q23 (MLL)
n %
Всего обследовано 117
Всего выявлено перестроек гена MLL 74 63,2
t(4;11)(q21;q23) / MLL-AF4 47 40,2
t(11;19)(q23;p13) / MLL-MLLT1 14 12,0
t(9;11)(p22;q23) / MLL-MLLT3 2 1,7
t(10;11)(p12;q23) / MLL-MLLT10 5 4,3
t(1;11)(p32;q23) / MLL-EPS15 5 4,3
Неизвестный ген-партнер 1 0,9
3 ’201 1
3 ’201 1
Рис. 1. Относительная частота выявления перестроек 11q23 (ML L) у пациентов с ОЛЛ
Рис. 2. Встречаемость перестроек 11q23 (MLL) в различных возрастных группах
Самой частой была транслокация t(4;11)(q21;q23)/ MLL-AF4, на 2-м месте - t(11;19)(q23;p13)/ MLL-MLLT1, другие перестройки гена MLL наблюдались значительно реже. В 1 (0,9 %) случае методом FISH на интерфазных ядрах была выявлена перестройка гена MLL, однако идентифицировать ген-партнер не уда-
лось. Относительная частота выявления перестроек 1Ц23 (МЫ) представлена на рис. 1. На долю ^4;11) (q21;q23)/MLL-AF4 и t(11;19)(q23;p13)/MLL-MLLT1 приходилось 63,5 % и 18,9 % от числа выявленных перестроек МЫ/1^23 соответственно.
Для исследования взаимосвязи между перестройками 1Ц23 (МЫ) и возрастом пациентов все случаи ОЛЛ у детей первого года жизни были разделены на 6 возрастных групп (рис. 2). Частота выявления ^4;11) (q21;q23)/MLL-AF4 постепенно снижалась с увеличением возраста пациентов (от 57,1 % в возрастной группе 0—2 мес до 25,0 % у детей в возрасте 10—12 мес), однако обнаруженные различия не достигли статистической значимости (р = 0,088). Транслокация ^11;19) (ц23;р13)/MLL-MLLT1 наиболее часто фиксировалась у детей в возрасте 2—4 мес — в 7 (28,0%) из 25 случаев. Четверо из 5 пациентов с ^10;11)(р12^23)/ MLL-MLLT10 были старше 6 мес. Случаи с наличием ^1;11) (p32;q23)/MLL-EPS15 практически равномерно представлены во всех возрастных группах. Т ранслокация t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3 не выявлялась у пациентов младше 8 мес.
При разделении пациентов на 2 группы — старше и младше 6 мес — выявлено, что у детей в возрасте младше 6 мес перестройки 1Ц23 (МЫ) были обнаружены достоверно чаще (84,0 % случаев) по сравнению с пациентами в возрасте 6—12 мес (47,8 % случаев) (р < 0,001). Статистически значимые различия сохранялись для t(4■;11)(q21■;q23)/MLL-AF4 (54,0 % и 29,8 % соответственно) (р = 0,014) и ^11;19)^23;р13)/М!Х-MLLT1 (22,0 % и 4,5 % соответственно) (р = 0,009).
Результаты иммунофенотипирования опухолевых клеток представлены в табл. 5. У 39 (83,0 %) из 47 пациентов с наличием ^4;11)^21^23)/MLL-AF4 был обнаружен ВІ-ОЛЛ. Значительно реже у пациентов с данной хромосомной аберрацией выявлялись ВІІ-и ВШ-варианты (10,6 % и 6,4 % соответственно). Все пациенты с наличием ^1;11)(р32^23)/ MLL-EPS15,
Таблица 5. Число пациентов с различными иммунологическими вариантами ОЛЛ и наличием перестроек 11д23 (MLL)
BI-ОЛЛ BII-ОЛЛ BIII-ОЛЛ Т-ОЛЛ Нет данных Всего
t(4;11)(q21;q23) / MLL-AF4 39 5 3 0 0 47
t(11;19)(q23;p13) / MLL-MLLT1 5 3 5 0 1 14
t(9;11)(p22;q23) / MLL-MLLT3 0 2 0 0 0 2
t(10;11)(p12;q23) / MLL-MLLT10 2 0 3 0 0 5
t(1;11)(p32;q23) / MLL-EPS15 5 0 0 0 0 5
Неизвестный ген-партнер MLL 1 0 0 0 0 1
Нет перестроек 11q23 (MLL) 7 25 6 3 2 43
Всего 59 35 17 3 3 117
Рис. 3. Локализация точек слияния в гене ML L и генах-партнерах у 26 пациентов. Белые прямоугольники — экзоны гена ML L, серые — экзоны генов-партнеров. Для всех генов-партнеров приведены номерареференсных последовательностей (NM) нормальных транскриптов.
* Нумерация экзонов гена МЬЬ дана по работе ЖЬоп et а1., 1996[1]. Праймеры для проведения гнездной СТ-ПЦР схематически представлены в виде черных прямоугольников. Цифры внутри черных прямоугольников соответствуют местам начала и конца праймера по отношению к нормалыой мРНК соответствующего транскрипта. Цифры под схематическим изображением экзонов соответствуют месту началу экзона
1(10;11)(р12;д23)/МЬЬ-МЬЬТ10, а также с неопределенным геном-партнером МЬЬ имели В1-ОЛЛ или ВШ-ОЛЛ, в то время как оба пациента с 1(9;11) (р22;<\23)/МЬЬ-МЬЬТ3 — ВП-ОЛЛ. При наличии 1(11;19)(с(23;р13)/МЬЬ-МЬЬТ1 по 5 (38,5 %) из 13 пациентов имели В1-ОЛЛ и ВШ-ОЛЛ, а 3 (23,1 %) —
ВП-ОЛЛ. У пациентов с отсутствием перестроек МЬЬ/1Ц23 в большинстве случаев (60,1 %) зафиксирован ВП-ОЛЛ.
Таким образом, у пациентов с наличием перестроек 1Ц23 (МЬЬ) В1-ОЛЛ встречался достоверно чаще, чем другие иммунологические варианты (р < 0,001). В то же время ВП-ОЛЛ у этих пациентов
выявлялся значительно реже, чем В1 и ВШ (р < 0,001). Связи наличия ВШ-ОЛЛ с выявлением перестроек 1Ц23 (МЬЬ) выявлено не было (р = 0,989). У пациентов с Т-ОЛЛ (п = 3) перестроек гена МЬЬ (1Ц23) нами не найдено.
Исследование методом секвенирования для выявления структуры химерного транскрипта было выполнено у 26 больных. Из этого числа 15 пациентов имели МЬЬ-ЛЬ4, 7 — МЬЬ-МЬЬТ1, 3 — МЬЬ-ЕР815,
1 — МЬЬ-МЬЬТ3. Среди всех транскриптных вариантов МЬЬ-ЛЬ4 наиболее часто был обнаружен вариант со слиянием 9-го экзона гена МЬЬ и 4-го экзона гена ЛF4 (е9е4) — в 4 случаях из 15. Реже выявлялись
3 ’201 1
3 ’201 1
Рис. 4. Распределение точек слияния в гене MLL. Представлены результаты определения точек слияния в регионе с 9-го по 12-й экзоны гена MLL у 26пациентов с ОЛЛ, включая 15случаев MLL-AF4, 7случаев MLL-MLLT1, 3 случая MLL-EPS15, 1 случай MLL-MLLT1
химерные транскрипты e11e4 — 3 случая, е10е4, e11e5, e11e6 — по 2 случая каждого соответственно (рис. 3). Среди транскриптных вариантов MLL-MLLT1 преобладал e11e2 — 4 случая из 7. У всех 7 пациентов точка слияния в гене MLLT1 находилась во 2-м экзоне. Среди 3 пациентов с наличием химерного транскрипта с MLL-EPS15 у 2 был выявлен вариант e11e2, у 1 — е10е2. Единственный пациент с MLL-MLLT3, у которого была определена структура хи мерного транскрипта, имел точку слияния в 11-м и 6-м экзонах соответственно. Суммарно наиболее частой точкой слияния в гене MLL являлся 11-й экзон, на долю которого приходится более половины всех исследованных нами случаев — 14 из 25 (рис. 4).
Обсуждение
В настоящей работе проведено исследование частоты встречаемости различных перестроек 11q23 (MLL) у детей первого года жизни с диагнозом ОЛЛ. Эти перестройки нами были выявлены у 74 (63,2 %) из 117 пациентов. Оказалось, что частота обнаружения вышеуказанных перестроек ниже, чем в международном исследовании Interfant-99, где перестройки MLL были зарегистрированы в 79,3 % случаев (расчет сделан от числа информативных исследований) [7], а также в 2 последовательных исследованиях MLL96 и MLL98, где частота выявления перестроек гена MLL составила 78,4 % [8]. В то же время наши результаты соответствуют данным, полученным в разное время в Бразилии —
58,1 % [26], Германии — 65,9 %, [27], Великобритании — 66,0 % [28], США — 68,7 % [13]. Однозначно объяснить причину полученных различий не представляется возможным. При этом следует отметить, что большинство пациентов, включенных в исследование Interfant-99, наряду с цитогенетическим и молекулярно-генетическим исследованиями были обследованы методом FISH [7], а всем пациентам, получавшим терапию по протоколам
MLL96 и MLL98, проводилось исследование методом гибридизации по Саузерну [8]. Оба метода позволяют выявить любые перестройки MLL, в том числе критические. В то же время проведенное в рамках данной работы сравнение частоты выявления перестроек 11q23 (MLL) не выявило статистически значимых различий использования 3 диагностических методов. Однако это может быть связано с недостаточной мощностью исследования, в частности, небольшим количеством пациентов, которым проводилась FISH.
Сравнение относительной частоты выявления различных перестроек 11q23 (MLL) показало, что наиболее часто в исследованной нами группе встречались t(4;11)(q21;q23)/MLL-AF4 и t(11;19)(q23;p13)/MLL-MLLT1, что полностью совпадает с ранее опубликованными данными [4, 7, 8, 13, 26—28]. Данные литературы по частоте встречаемости транслокации t(9;11) (p22;q23)/MLL-MLLT3 противоречивы: ряд исследователей ставят ее на 3-е место по частоте обнаружения у детей первого года жизни с ОЛЛ (11,2—15,6 %) [7, 8, 13], в то же время в работе C.-H. Pui et al. при анализе данных 11 кооперативных групп по лечению ОЛЛ у детей младше 12 месяцев данная транслокация была выявлена только в 3,7 % случаев от общего числа перестроек 11q23 (MLL) [12]. В нашем исследовании t(9;11) (p22;q23)/MLL-MLLT3 встретилась только у 2 (2,7 %) пациентов.
Несколько чаще, чем это описывалось ранее (6,7 % по сравнению с 2,3—3,0 %) [4, 12] нам встретилась реципрокная транслокация t(1;11)(p32;q23), ведущая к образованию химерного гена MLL-EPS15. Ген EPS15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate 15), также известный как AF1P, AF-1P, MLLT5, впервые описан Bernard et al. в 1994 г. [29]. Данный ген, расположенный на коротком плече 1-й хромосомы в регионе 1р32, кодирует один из рецепторов эпидермального фактора роста. В отличие от белков AF4, MLL T1, MLLT3 и MLLT10, которые располагаются в ядре клетки, EPS15 локализуется в цитоплазме, что обу славливает несколько иной механизм взаимодействия с белком MLL [30]. При этом происходит образование дву спиральных олигомеров EPS15, которые только в таком виде способны приводить к лейкемической трансформации белка MLL. Следует отметить, что t(1;11)(p32;q23)/MLL-EPS15 примерно с одинаковой частотой (2—3 %) описывается у детей как при ОЛЛ, так и при ОМЛ [4, 31].
По нашим данным, частота выявления перестроек 11q23 (MLL) достоверно отличалась у детей младше и старше 6 мес ( р < 0,001); при этом пик приходится на возрастную группу 4—6 мес, где эта величина достигла 91,9 %. Сходные результаты получены и другими исследовательскими группами [32, 33]. Описанное в отдельных работах преобладание частоты выявления перестроек гена MLL у детей в первые 3 месяца жизни по сравнению с более старшими детьми первого года жизни [26] не нашло подтверждения в нашей работе.
Проведенный нами анализ иммунофенотипа опухолевых клеток показал преобладание у детей первого года жизни В1-варианта ОЛЛ, который был выявлен у 51,8 % пациентов, что хорошо согласу ется с ранее опубликованными данными, в которых В1-ОЛЛ выявлялся с частотой 47,3—64,6 % [26, 27, 34]. Мы вместе с другими авторами отмечаем доминирование этого иммунологического варианта у пациентов с наличием перестроек 1Ц23 (МЫ) и, наоборот, более частое выявление ВП-ОЛЛ среди больных, у которых эти перестройки не были обнаружены [26, 27, 32, 34].
Большая вариабельность точек разрыва в гене МЫ и генах-партнерах значительно у сложняет выявление отдельных перестроек и использование их в качестве мишеней для мониторинга МОБ. В связи с этим чрезвычайно важно определять структуру химерных транскрип-тов для последующего качественного и количест венного анализа МОБ методом ПЦР в реальном времени. Известно, что, в отличие от взрослых пациентов с ОЛЛ, у детей первого года жизни наиболее частой зоной разрыва в гене МЫ является интрон 11, на долю которого приходится до половины всех случаев перестроек гена МЫ [4, 35]. На уровне матричной РНК (мРНК) это приводит к образованию химерных транскриптов с точкой слияния в экзоне 11. В нашей работе это встретилось у 14 (53,8 %) из 26 обследованных пациентов. Кроме того, для MLL-AF4, МЦ.-МП'П. МТ,Т,-ЕРЯ15 нами выявлено более 1 варианта химерных транскриптов. Наибольшей гетерогенностью обладал MLL-AF4, для которого выявлено 7 транскриптных вариантов; для MLL-MLLT1 было найдено 3 варианта, для МЫ-ЕР815 — 2. При этом, если в МЫТ1 и ЕР815 точка слияния в гене-партнере была постоянной (экзон 2 во всех случаях), то в AF4 было выявлено 3 точки слияния — экзон 4 (11 случаев), экзон 5 (3 случая) и экзон 6 (2 случая).
Исследование инициальных характеристик у пациентов первого года жизни с ОЛЛ важно по ряду причин. Показано, что такие параметры, как возраст, инициальный лейкоцитоз, наличие и тип перестроек 1Ц23 (МЫ), иммунофенотип и ответ на терапию оказывают важное влияние на исход данного заболевания [7, 12, 36—39].
Известно, что бессобытийная выживаемость детей младше 12 месяцев, больных ОЛЛ, значительно у ступает таковой детей старше 12 месяцев [12, 40, 41]. Имеются существенные различия и среди пациентов первого года жизни. Показано увеличение длительности бессобытийной выживаемости в соответствии с увели-
чением возраста пациентов [5, 7], а минимальная продолжительность бессобытийной выживаемости зафиксирована у пациентов с лейкозом, манифестировавшим в течение первого месяца жизни [42].
Практически все исследовательские группы сходятся в том, что наличие любых перестроек 1Ц23 (MLL) значительно ухудшает прогноз заболевания [7—9, 12, 13]. В то же время существу ет мнение о неравнозначной прогностической роли различных аномалий 1Ц23 (MLL) при ОЛЛ у детей первого года жизни. Традиционно считается, что наиболее неблагоприятной является транслокация ^4;11)/MLL-AF4, в то время как прогноз для пациентов с ^11;19)/ МТ,Т,-МТ,Т,Т1 и t(9;11)/MLL-MLLT3 — несколько лучше [12, 36, 43]. С другой стороны, в рамках проспективного исследования Шег!аП;-99 пациенты с любой из вышеперечисленных транслокаций имели сходные показатели бессобытийной выживаемости [5]. Все это подчеркивает необходимость дальнейшего накопления данных о связи конкретных перестроек с исходами ОЛЛ у детей первого года жизни.
Выводы
1. Перестройки района 1Ц23 с вовлечением гена MLL выявлены нами у 63,2 % пациентов с ОЛЛ. Среди пациентов исследованной группы преобладали ^4;11) (q21;q23)/MLL-AF4 — 63,5 % случаев и ^11;19) (q23;p13)/MLL-MLLT1 — 18,9 % случаев.
2. Наиболее часто перестройки 1Ц23 (МЫ,) обнаружены в возрастной группе 4—6 месяцев, где частота выявления достигла 91,9 %, а наиболее редко— у пациентов в возрасте 10—12 месяцев (32,1 %).
3. У пациентов в возрасте младше 6 месяцев перестройки 1Ц23 (МЫ) были выявлены в 84,0 % случаев, а в возрасте 6—12 месяцев — в 47,8 % случаев.
4. В1-вариант ОЛЛ достоверно чаще, а ВП-ОЛЛ значительно реже встречались у пациентов с наличием перестроек 1Ц23 (М„).
5. При исследовании структуры химерных транс-криптов выявлено, что наиболее часто точка слияния располагается в 11-м экзоне гена MLL.
Авторы выражают глубокую признательность Е.В. Флейшман и О.И. Соковой за ценные советы и критические замечания, полученные в процессе работы над статьей, а также благодарят врачей-гематологов и детских онкологов, предоставивших данные о пациентах первого года жизни с острыми лейкозами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Nilson I., Loechner K., Siegler G. et al. Exon/intron structure of ALL1 (MLL) gene involved in translocations to chromosomal region 11q23 and acute leukemias.
Br J Haematol 1996;94(4):966—72.
2. Armstrong S., Look A. Molecular genetics of acute lymphoblastic leukemia.
J Clin Oncol 2005;23:6306-15.
3. Schoch C., Schnittger S., Klaus M. et al. AML with 11q23/MLL abnormalities as defined by the WHO classification: incidence, partner chromosomes, FAB subtype, age distribution, and prognostic impact in an unselected series of 1897 cytogenetically analyzed AML cases.
Blood 2003;102:2395-402.
4. Meyer C., Kowarz E., Hofmann J. et al. New insights to the MLL recombinome of acute leukemias. Leukemia 2009;23:1490-9.
5. Reaman G., Zeltzer P., Bleyer W. et al. Acute lymphoblastic leukemia in infants less than one year of age: a cumulative experience of the Children’s Cancer Study Group.
J Clin Oncol 1985;3:1513-21.
3 ’201 1
3 ’201 1
6. Biondi A., Cimino G., Pieters R., Pui C.-H. Biological and therapeutic aspects of infant leukemia. Blood 2000;96:24-33.
7. Pieters R., Schrappe M., De Lorenzo P. et al. A treatment protocol for infants younger than 1 year with acute lymphoblastic leukaemia (Interfant-99): an observational study and a multicentre randomised trial. Lancet 2007;370(9583):240-50.
8. Tomizawa D., Koh K., Sato T. et al. Outcome of risk-based therapy for infant acute lymphoblastic leukemia with or without an MLL gene rearrangement, with emphasis on late effects: a final report of two consecutive studies, MLL96 and MLL98, of the Japan Infant Leukemia Study Group. Leukemia 2007;11:2258-63.
9. Chen C-S., Sorensen P., Domer P. at el. Molecular rearrangements on chromosome 11q23 predominate in infant acute lymphoblastic leukemia and are associated with specific biologic variables and poor outcome. Blood 1993;81:2386-93.
10. Greaves M. Infant leukemia: biology, aetiology and treatment. Leukemia 1996;10:372-7.
11. Isoyama K., Eguchi M., Hibi S. et al. Risk-directed treatment of infant acute lymphoblastic leukaemia based on early assessment of MLL gene status: results of the Japan Infant Leukaemia Study (MLL96).
Br J Haematol 2002;118:999-1010.
12. Pui C.-H., Chessells J., Camitta B. et al. Clinical heterogeneity in childhood acute lymphoblastic leukemia with 11q23 rearrangements. Leukemia 2003;17:700-6.
13. Hilden J., Dinndorf P., Meerbaum S. et al. Analysis of prognostic factors of acute lymphoblastic leukemia in infants: report on CCG 1953 from the Children’s Oncology Group. Blood 2006;108:441-51.
14. Cimino G., Rapanotti M., Sprovieri T., Elia L. ALL1 gene alterations in acute leukemia: biological and clinical aspects. Haematologica 1998;83:350-7.
15. Gale K., Ford A., Repp R. et al. Backtracking leukemia to birth: identification of clonotypic gene fusion sequences in neonatal blood spots. Proc Natl Acad Sci USA 1997;94:13950-4.
16. Slany R. The molecular biology of mixed lineage leukemia. Haematologica 2009;94:984-93.
17. Fechina L., Shorikov E., Tsaur G. et al. Contribution of all-trans retinoic acid to improved early relapse-free outcome in infant acute lymphoblastic leukemia comparing to the chemotherapy alone. Blood 2007;110(11):832A.
Abstr. 2828.
18. Tsaur G., Popov A., Nasedkina T. et al. Minimal residual disease monitoring by quantification of fusion gene transcript in infant with MLL-rearranged acute lymphoblastic leukemia by MLL-Baby
protocol. Blood 2010;116(21):1126.
Abstr. 2731.
19. Цаур Г.А., Наседкина Т.В., Попов А.М. и др. Время достижения молекулярной ремиссии как фактор прогноза у детей первого года жизни с острым лимфобластным лейкозом. Онкогематология 2010;2:46-54.
20. Bennett J., Catovsky D., Daniel M. et al. Proposals for the classification of the acute leukaemias. French-American-British (FAB) co-operative group. Br J Haematol 1976;33:451-8.
21. Bene M., Castoldi G., Knapp W. et al. Proposals for the immunological classification of acute leukemias. European Group for the Immunological Characterization of Leukemias (EGIL). Leukemia 1995;9(10):1783-6.
22. ISCN (2005): An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (2005). Editors: Shaffer L.G., Tommerup N. Karger, Basel, Switzerland, 2005.
23. Borkhardt A., Repp R., Haupt E. et al. Molecular analysis of MLL/AF4 recombination in infant acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 1994;8:549-53.
24. Pallisgaard N., Hokland P., Riishoj D. et al. Multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction for simultaneous screening of 29 translocations and chromosomal aberrations in acute leukemia. Blood 1998;92:574-88.
25. Dongen van J., Macintyre E., Gabert J. et al. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia 1999;13:1901-18.
26. Emerenciano M., Arias D., Coser V. et al. Molecular cytogenetic findings of acute leukemia included in the Brazilian collaborative study group of infant acute leukemia. Pediatr Blood Cancer 2006;47:549-54.
27. Borkhardt A., Wuchter C., Viehmann S. et al. Infant acute lymphoblastic leukemia — combined cytogenetic, immunophenotypical and molecular analysis of 77 cases. Leukemia 2002;16:1685-90.
28. Chessells J., Harrison C., Kempski H. et al. Clinical features, cytogenetics and outcome in acute lymphoblastic and myeloid leukaemia of infancy: report from the MRC Childhood Leukaemia working party. Leukemia 2002;16:776-84.
29. Bernard O., Mauchauffe M., Mecucci C. et al. A novel gene, AF-lp, fused to HRX
in t(1;11)(p32;q23) is not related to AF-4, AF-9 nor ENL. Oncogene 1994;9:1039-45.
30. DiMartino J., Cleary M. MLL rearrangements in haematological malignancies: lessons from clinical and biological studies. Br J Haematol 1999;106:614-26.
31. Harrison C., Cuneo A., Clark R. et al. Ten novel 11q23 chromosomal partner sites. Leukemia 1998;12:811-22.
32. Jansen M., Corral L., van der Velden V. et al. Immunobiological diversity in infant acute lymphoblastic leukemia is related to the occurrence and type of MLL gene rearrangement. Leukemia 2007;21:633-41.
33. Lightfoot T. Aetiology of Childhood Leukemia. Bioelectromagnetics 2005;
Suppl 7:5-11.
34. Mathew S., Behm F., Dalton J., Raimondi S. Comparison of cytogenetics, Southern blotting and fluorescence in situ hybridization as methods for detecting MLL gene rearrangements in children with acute leukemia and with 11q23 abnormalities. Leukemia 1999;13:1713-20.
35. Burmeister T., Meyer C., Schwartz S. et al. The MLL recombinome of adult CD10-negative B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia: results from the GMALL study group. Blood 2009; 113:4011-5.
36. Pui C.-H., Gaynon P., Boyett J. et al. Outcome of treatment in childhood acute lymphoblastic leukaemia with rearrangements of the 11q23 chromosomal region. Lancet 2002;359:1909-15.
37. Silverman L., McLean T., Gelber R. et al. Intensified therapy for infants with acute lymphoblastic leukemia results from the Dana-Farber Cancer Institute Consortium. Cancer 1997;80:2285-95.
38. Dordelmann M., Reiter A., Borkhardt A. et al. Prednisone response is the strongest predictor of treatment outcome in infant acute lymphoblastic leukemia. Blood 1999;94:1209-17.
39. Velden van der V., Corall L., Valsecchi M. et al. Prognostic significance of minimal residual disease in infants with acute lymphoblastic leukemia treated within
the Interfant-99 protocol. Leukemia 2009;23:1073-9.
40. Pui C.-H., Frankel L., Carroll A. et al. Clinical characteristics and treatment outcome of childhood acute lymphoblastic leukemia with the t(4;11)(q21;q23):
A collaborative study of 40 cases.
Blood 1991;77:440-7.
41. Mann G., Cazzaniga G., van der Velden V. et al. Acute lymphoblastic leukemia with t(4;11) in children one year and older: the ‘big sister’ of the infant disease? Leukemia 2007;21:642-6.
42. Linden van der M., Valsecchi M.,
De Lorenzo P. et al Outcome of congenital acute lymphoblastic leukemia treated on the Interfant-99 protocol. Blood 2009; 114:3764-8.
43. Pui C.-H., Ribeiro R., Campana D. et al. Prognostic factors in the acute lymphoid and myeloid leukemias of infants. Leukemia 1996;10:952-6.
