CC BY
312
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 1
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 616.155.392-036.11-053.3:575.083
ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ ХИМЕРНЫХ ГЕНОВ С УЧАСТИЕМ ГЕНА MLL ПРИ ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗАХ У ДЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ
Г.А. Цаур1,2, C. Meyer3, А.М. Попов1,2, О.М. Плеханова1, А.М. Кустанович4, Е.В. Волочник4, Т.О. Ригер1, 2, А.С. Демина1, 2, А.Е Друй1, 2 5, Е.В. Флейшман6, О.И. Сокова6, Ю.В. Ольшанская7, О.В. Стренева12, Е.В. Шориков12, Л.И. Савельев1, 2, 5, R. Marschalek3, С.И. Куцев8, 9, С.В. Цвиренко15,
Л.Г. Фечина1, 2
1ГБУЗ СО Областная детская клиническая больница №1, Екатеринбург, Россия; 2ГБУЗ ТО Институт медицинских клеточных технологий, Екатеринбург, Россия; diagnostic Center of Acute Leukemia, Institute of Pharmaceutical Biology/ ZAFES, Goethe-University of Frankfurt, Франкфурт-на-Майне, Германия; 4ГУ Республиканский научнопрактический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, Минск, Беларусь; 5ГБОУ ВПО Уральский государственный медицинский университет, Екатеринбург, Россия 6ФГБУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва, Россия; 7ФГБУ Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева Минздрава России, Москва, Россия; 8ФГБУ Медикогенетический научный центр РАМН, Москва, Россия; 9ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова Минздрава России, Москва
Резюме. Целью данной работы являлось описание механизмов образования химерных генов с вовлечением гена MLL у детей первого года жизни, больных острыми лейкозами, у которых методом длинной инвертированной полимеразной цепной реакции (ДИ-ПЦР) в ДНК выявлена перестройка гена MLL. В исследование были включены 72 больных в возрасте от 1 дня до 11 мес, в том числе 52 больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), 19 больных острым миелоидным лейкозом (ОМЛ), 1 больной острым недифференцированным лейкозом. При ОЛЛ наиболее частым (53,8%) химерным геном являлся MLL-AF4, реже выявлялись MLL-MLLT1 (23,1%), MLL-MLLT3 (13,5%), MLL-EPS15 (7,7%), MLL-AFF3 (1,9%). При ОМЛ самым часто выявляемым (36,8%) химерным геном был MLL-MLLT3, реже (26,3%) были найдены mLl-MLLT10, MLL-MLLT11 и MLL-MYO1F (по 10,5%), MLL-AF4, а также MLL-SEPT6 и MLL-SEPT9 (по 5,3%). Наиболее частой зоной разрыва в ДНК гена MLL при ОЛЛ являлся 11-й интрон, на долю которого приходилось 48,1% случаев, а при ОМЛ — это 9-й интрон (42,1%). Больные ОЛЛ, у которых точка разрыва располагалась в 11-м интроне, были младше всех остальных (p = 0,025). Не обнаружено связи между локализацией точек разрыва и полом больного, уровнем инициального лейкоцитоза и типом гена-партнера. Зоны разрыва в генах-партнерах MLL чаще всего затрагивали один или два интрона, за исключением генов AF4 и MLLT10, в которых зоны разрывов более протяженные. Самым частым механизмом образования химерных генов с участием MLL являлась реципрокная транслокация (73,6%), значительно реже — транс-сплайсинг (15,3%) или инсерции (11,1%). С помощью ДИ-ПЦР были найдены такие редкие гены-партнеры MLL, как AFF3, MYO1F, SEPT6, SEPT9, а также нетипичные локализации точек разрыва при наличии MLL-AF4: 7-й интрон гена MLL и 10-й интрон гена AF4, не выявляемые стандартной ПЦР с обратной транскрипцией. Таким образом, нами детально охарактеризована структура химерных генов с участием MLL в большой группе детей первого года жизни, больных острыми лейкозами.
Ключевые слова: острый лейкоз; дети первого года жизни; перестройки гена MLL; полимеразная цепная реакция.
DETECTION OF MLL GENOMIC BREAKPOINTS IN INFANT ACUTE LEUKEMIA
G.A. Tsaur’,2, C. Meyer3, A.M. Popov’,2, O.M.Plekhanova’, A.M.Kustanovich4, EVVolochnik4, T.O.Riger12, A.S.Demina’2, A.E.Druy’2,5, E.W.Fleischman6, O.I. Sokova6, Yu.V. Olshanskaya7, OV. Streneva1,2, EV. Shorikov1,2, L.I. Saveliev1 2 5, R.Marschalek3, S.I.Kutsev8,9, S.V Tsvirenko’5, L.G. Fechina1 2
’Regional Pediatric Clinical Hospital N1, Ekaterinburg, Russia; 2Institute of Medical Cell Technologies, Ekaterinburg, Russia; 3Diagnostic Center of Acute Leukemia, Institute of Pharmaceutical Biology/ZAFES, Goethe-University of Frankfurt, Frankfurt-on-Main, Germany; 4Republican Center for Pediatric Oncology, Hematology and Immunology, Minsk, Belarus; 5Ural State Medical University, Ekaterinburg, Russia; 6N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Moscow, Russia; 7D. Rogachev Federal Institute of Pediatric Hematology, Oncology, and Immunology, Moscow, Russia 8Research Centre for Medical Genetics RAMS, Moscow, Russia; 9N.I. Pirogov Russian National Medical Research University, Moscow, Russia
Summary. The mechanisms of chimeric gene formation with MLL gene involvement in infants aged under 1 year, suffering from acute leukemia, are described. Rearrangement of MLL gene in DNA was detected in the patients by long inverted polymerase chain reaction (LI-PCR). The study was carried out in 72 patients aged 1 day to 11 months, 52 of these with acute lymphoblastic leukemia (ALL), 19 with acute myeloid leukemia (AML), and 1 with acute undifferentiated leukemia. The most incident (53.8%) chimeric gene in ALL was MLL-AF4; other ones were more rare: MLL-MLLT1 (23.1%), MLL-MLLT3 (13.5%), MLL-EPS15 (7.7%), and MLL-AFF3 (1.9%). In AML the most incident (36.8%) chimeric gene was MLL-MLLT3; other chimeric genes were MLL-MLLT10 (26.3%), MLL-MLLT11 and MLL-MYO1F (10.5% each), MLL-AF4, MLL-SEPT6, and MLL-SEPT9 (5.3% each). The most frequent aberration zone in MLL gene DNA was intron 11 (48.1% cases) in ALL and intron 9 (42.1%) in AML. Patients with ALL with the rupture site in intron 11 were the youngest (p = 0.025). No relationship between the location of rupture sites and patient's gender, initial leukemia level, and partner gene type was detected. The aberration zones in MLL partner genes most often involved one or two introns, except AF4 and MLLT10 genes, in which the aberration zones were longer. The most incident mechanism of chimeric gene formation with MLL participation was reciprocal translocation (73.6%), trans-splicing or insertions were significantly more rare (15.3 and 11.1%, respectively). Rare MLL partner genes were found by LI-PCR: AFF3, MYO1F, SEPT6, SEPT9, as well as atypical locations of ruptures in the presence of MLL-AF4: MLL gene intron 7 and AF4 gene intron 10, not detected by the standard reverse transcription PCR. Hence, we characterized in detail the structure of chimeric genes with MLL participation in a large group of infants aged under 1 year, suffering from acute leukemia.
Key words: acute lymphoblastic leukemia; infants; MLL rearrangements; PCR.
29
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 1
Ген MLL (mixed lineage leukemia) расположен на длинном плече хромосомы 11 в хромосомном районе 11q23. В норме этот ген является коактиватором транскрипции и участвует в эмбриональном развитии и гемопоэзе. Ген MLL играет важную роль в процессах лейкозогенеза путем образования химерных генов [1, 2], наиболее частыми из которых являются MLL-AF4, MLL-MLLT1 (ранее известный как MLL-ENL), MLL-MLLT3 (MLL-AF9), MLL-MLLT10 (MLL-AF10), MLL-ELL, MLL-MLLT4 (MLL-AF6). Суммарно на их долю приходится 85% всех перестроек гена MLL [3—5].
При образовании химерных генов с участием MLL чаще всего разрыв в ДНК происходит в так называемом основном регионе разрыва гена MLL протяженностью 7699 пар нуклеотидов, расположенном между 7-м и 13-м экзоном [6—8]. Причем подавляющее большинство (94%) точек разрыва локализуется между 9-м и 12-м экзоном [5]. Здесь и далее нумерация экзонов и интронов дана по работе I. Nilson и соавт. [9].
Определение точки разрыва в ДНК гена MLL находит свое применение как для исследования биологии острых лейкозов (ОЛ), ассоциированных с перестройками гена MLL [3—5, 10, 11], так и для создания индивидуальных для каждого больного условий мониторирования минимальной остаточной болезни (МОБ) [12—15]. На основании выявления структуры химерного гена и мониторинга МОБ можно оценивать динамику различных лейкозных клонов и сравнивать их количество при развитии MLL-позитивного ОЛ de novo, а также при рецидиве и вторичном остром миелоид-ном лейкозе (ОМЛ) [16]. Также было показано, что больные MLL-позитивным ОЛ, у которых точка разрыва находилась в 11-м интроне гена MLL, имели статистически значимую более низкую вероятность бессобытийной выживаемости [17]. Все вышеперечисленное делает изучение точек разрыва в ДНК гена MLL интересным объектом для исследований.
Существует несколько методов определения точки разрыва в ДНК гена MLL: клонирование фрагмента химерного гена целиком с последующей обработкой рестриктазами и секвенированием [6], так называемая panhadle полимеразная цепная реакция (ПЦР) [7] и длинная инвертированная ПЦР (ДИ-ПЦР) [8]. Мы в данной работе использовали последний метод из-за его высокой точности, хорошей воспроизводимости и относительной быстроты. Кроме того, ДИ-ПЦР имеет ряд неоспоримых преимуществ перед другими молекулярно-генетическими методами диагностики перестроек гена MLL. Во-первых, это выявление практически любой перестройки гена MLL независимо от механизма ее образования. Во-вторых, ДИ-ПЦР дает точное картирование зоны слияния двух генов. В-третьих, позволяет однозначно охарактеризовать гены-партнеры MLL, участвующие в образовании прямого и реципрокного химерного генов [3, 4, 8, 13]. Необходимо подчеркнуть, что из описанных на сегодняшний день 79 генов-партнеров MLL 34 были охарактеризованы при использовании ДИ-ПЦР MLL [4].
Для корреспонденции:
Цаур Григорий Анатольевич, кандидат мед. наук, заведующий лабораторией молекулярной биологии отдела детской онкологии и гематологии ГБУЗ СО Областная детская клиническая больница № 1, врач клинической лабораторной диагностики лаборатории терапии онкогематологических заболеваний ГБУЗ СО Институт медицинских клеточных технологий.
Адрес: 620149, Екатеринбург, ул. С. Дерябиной, д. 32.
Телефон: +7(343) 216-25-17.
Факс: +7 (343) 2162517 E-mail: tsaur@mail.ru
Цель данной работы — описание механизмов образования химерных генов с вовлечением гена MLL у детей первого года жизни, больных ОЛ, у которых методом ДИ-ПЦР в ДНК была выявлена перестройка гена MLL.
Материалы и методы
В исследуемую группу были включены 72 больных ОЛ в возрасте младше 365 дней с наличием перестроек 11q23/MLL, обследованных в период с декабря 2006 г. по январь 2013 г., которым было проведено исследование методом ДИ-ПЦР. В исследуемой группе было 52 больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), 19 — ОМЛ и 1 — острым недифференцированным лейкозом (ОНдЛ), включая 28 (38,9%) мальчиков и 44 (61,1%) девочки. Медиана возраста составила 4,9 (диапазон 0,1—11,9) мес.
Диагноз ОЛЛ устанавливали на основании стандартных морфологических показателей [18] и данных иммуно-фенотипирования согласно критериям группы EGIL [19, 20], ОМЛ — на основании морфологических критериев Франко—Американо—Британской (FAB) классификации [18], а ОНдЛ — по данным иммунофенотипирования.
Больные получали терапию по одному из следующих химиотерапевтических протоколов: MLL-Baby, ALLIC-BFM-2002, AML-BFM-98, AML-BFM-2004, ОМЛ-ММ-2000, НИИ ДОГ ОМЛ-2007 в детских онкогематологических клиниках Российской Федерации и Республики Беларусь. Информированное согласие на проведение диагностических и лечебных процедур было получено во всех случаях.
Инициальное выявление перестроек 11q23/MLL проводили с помощью стандартного цитогенетического исследования, а также методами гнездной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и флюоресцентной гибридизации in situ (FISH).
Цитогенетическое исследование клеток костного мозга и периферической крови, взятых до начала терапии, проведено у 70 больных. Применяли технику приготовления «прямых препаратов» или краткосрочное культивирование клеток (24, 48 ч). Дифференциальную окраску хромосом на G-полосы проводили красителем Гимзы после предварительной обработки препаратов трипсином. В большинстве случаев анализировали не менее 20 метафазных пластинок. Анализ хромосом выполняли в соответствии с международной номенклатурой хромосом человека, принятой на момент выполнения стандартного цитогенетического исследования [21—23]. В ходе данной работы все кариотипы были повторно оценены с учетом рекомендаций ISCN 2009 [23]. В силу отсутствия метафаз, пригодных для анализа, цитогенетическое исследование было неинформативно в 11 случаях. Различные транслокации с вовлечением хромосомного района 11q23 были выявлены у 54, нормальный кариотип — у 5 больных.
У 68 больных была проведена ОТ-ПЦР для выявления следующих типов химерных транскриптов с участием гена MLL: MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLL-MLLT3, MLL-MLLT4, MLL-MLLT6, MLL-MLLT10, MLL-MLLT11, MLL-EPS15, MLL-ELL по ранее описанным методикам [24— 27]. Для исключения ложноотрицательных результатов качество выделенной РНК исследовали на биоанализаторе Agilent 2100 («Agilent», США) согласно инструкции производителя. В дальнейшую работу брали образцы, в которых показатель целостности РНК превышал 4,2 [28].
У 54 больных было проведено исследование методом FISH с использованием локус-специфичного флюоресцентного зонда LSI MLL Dual Color Break Apart
30
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 1
а
MLL-AFF3 MLL-EPS15 л=1; 1,9% /7=4; 7,7% \ |
MLL-MLLT3 п=7; 13,5%
MLL-MLLT1 /7=12; 23,1%
MLL-AFF3 л=1; 1,4%
MLL-MY01F /7=2; 2,8% MLL-MLLT11 /7=2; 2,8%
MLL-EPS15 /7=4; 5,6%
MLL-MLLT10 /7=6; 8,3%
MLL-MLLT3 /7=14; 19,4%
MLL-AF4 л=28; 53,8%
MLL-SEPT6 /7=1; 1,4% MLL-SEPT9 /7=1; 1,4%
MLL-AF4 /7=29; 40,3%
MLL-MLLT1 л=12; 16,7%
MLL-SEPT9 /7=1; 5,3%
MLL-SEPT6 п=1; 5,3% \
MLL-MY01F л=2; 10,5%
MLL-MLLT11 /7=2; 10,5%
MLL-MLLT10 /7=5; 26,3%
MLL-AF4 /т=1; 5,3
MLL-MLLT3 п=7; 36,8%
Рис. 1. Относительная частота выявления перестроек гена MLL. а — во всей группе больных (и = 72); б — у больных ОЛЛ (и = 52); в — у больных ОМЛ (и = 19).
Rearrangement Probe («Abbott Molecular», США) согласно протоколу производителя.
ДИ-ПЦР (long-distance inverse PCR, LDI-PCR) была выполнена всем 72 больным по ранее описанной методике [8]. В качестве исходного материала использовали геномную ДНК в количестве 1 мкг, выделенную из лейкоцитов и бласт-ных клеток костного мозга, взятого в момент установления диагноза. ДНК обрабатывали экзонуклеазой рестрикции BamHI, а затем лигировали в присутствии Т4 ДНК-лигазы при температуре 16°С в течение ночи для образования циркулярной молекулы ДНК. Затем 1/10 объема (около 100 нг) лигированной ДНК вносили в 4 различные пробирки для проведения ДИ-ПЦР, содержащие праймеры, комлементар-ные участкам основной зоны разрыва в ДНК гена MLL. Полученные ампликоны фракционировали в 0,8% агарозном геле. При получении в ходе электрофореза специфических полос, отличных от дикого типа MLL, их экстрагировали из геля и секвенировали по Сэнгеру с целью определения индивидуальной для каждого больного точки разрыва в MLL и гене-партнере. При отсутствии специфических продуктов электрофореза проводили второй этап ДИ-ПЦР, при котором использовали комбинации праймеров, комлементарные ре-ципрокной аллели гена MLL.
Для статистической обработки данных использовали программное обеспечение Statistica 8.0, R-statistics. При сравнении групп больных по качественным признакам применяли точный критерий Фишера. При сравнении двух групп больных по количественным признакам использовали критерий Манна—Уитни, при сравнении нескольких групп — критерий Крускала—Уоллиса. Результаты терапии оценивали по кумулятивной вероятности развития рецидива. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.
Результаты
Спектр перестроек гена MLL, выявленный у обследованной группы больных, представлен рис. 1, а. При ОЛЛ наиболее часто выявляли химерный ген MLL-AF4 — у 28 (53,8%) из 52 больных, реже выявляли MLL-MLLT1 — у 12 (23,1%), MLL-MLLT3 — у 7 (13,5%) (рис. 1, б). При ОМЛ у детей первого года жизни самым часто выявляемым химерным геном был MLL-MLLT3, который обнару-
жен у 7 (36,8%) из 19 больных, несколько реже был найден MLL-MLLT10 — у 5 (26,3%), остальные гены выявлялись заметно реже (рис. 1, в).
При ОЛЛ у детей первого года жизни наиболее часто точка разрыва в ДНК гена MLL локализовалась в 11-м ин-троне — у 25 (48,1%) из 52 больных. При этом наибольшей вариабельностью обладал химерный ген MLL-AF4: у 11 (39,3%) из 28 детей точка разрыва в ДНК гена MLL была расположена в 11-м интроне, у 6 (21,4%) — в 9-м интроне, у 4 (14,3%) — в 10-м интроне, у 4 (14,3%) — в 11-м экзо-не. Также в исследуемой группе больных были выявлены такие относительно редкие локализации, как 7-й и 12-й ин-троны. Наиболее стабильно точки разрыва локализовались при образовании химерного гена MLL-MLLT1: у 8 (66,7%) из 12 больных местом слияния выступал 11-й интрон гена MLL. При ОМЛ у детей исследуемой группы самым частым местом, в котором происходили разрывы в ДНК гена MLL, являлся 9-й интрон — у 8 (42,1%) из 19. При этом наиболее стабильную локализацию имели точки разрыва при образовании химерного гена MLL-MLLT10: у 4 (80%) из 5 больных в 9-м интроне, а наиболее гетерогенную — при наличии химерного гена MLL-MLLT3. В последнем случае примерно равное количество приходилось на 9-й и 11-й интроны. Мы
Рис. 2. Схема реципрокной транслокации с образованием прямого и реципрокного химерных генов на примере t(1;11)(p32;q23)/ MLL-EPS15.
31
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 1
Рис. 3. Структура химерных гена и транскрипта MLL-EPS15 у больного, у которого механизмом образования химерного гена являлся
транс-сплайсинг.
а — нуклеотидная последовательность зоны слияния гена MLL (выделен черным цветом) и хромосомного района 1p32 (выделен серым цветом), полученные при проведении ДИ-ПЦР. Подчеркнут 10-й экзон генаMLL. Двумя • выделена тринуклеотидная вставка; б — результат секвенирования химерного транскрипта выявил слияние 10-го экзона гена MLL c экзоном 2 гена EPS15.
не выявили взаимосвязи между локализацией точки разрыва в гене MLL и типом гена-партнера (табл. 1).
При ОЛЛ больные, у которых точка разрыва располагалась в 11-м интроне гена MLL, были статистически зна-
чимо младше всех остальных (р = 0,025), а также тех, у кого точка разрыва находилась в 9-м интроне (р = 0,017). Для ОМЛ подобной ассоциации возраста и локализации точек разрыва не выявлено (табл. 2).
Рис. 4. Структура химерных гена и транскрипта MLL-MYO1F у больного, у которого механизмом образования химерного гена являлся
транс-сплайсинг.
а — нуклеотидная последовательность зоны слияния генаMLL (выделен черным цветом) и хромосомного района 19p13.3 (выделен серым), полученная при проведении ДИ-ПЦР. Серым курсивом выделена 5’-нетранслируемая область (5’-UTR) генаMYO1F, подчеркиванием отмечен 1-й экзон гена MYO1F. Двумя • выделена тринуклеотидная вставка; б — структура зоны слияния химерного транскрипта MLL-MYO1F; в — схема химерного транскрипта MLL-MYO1F. Белые прямоугольники — экзоны гена MLL, серые — экзоны гена MYO1F. Нумерация экзонов гена MLL дана по работе I. Nilson и соавт. [15], нумерация экзонов EPS15 — согласно референсной последовательности NM_012335.3. Праймеры для проведения гнездной ОТ-ПЦР схематически представлены в виде черных прямоугольников. Цифры внутри черных прямоугольников соответствуют местам начала и конца праймера по отношению к нормальной мРНК соответствующего транскрипта. Цифры под схематическим изображением экзонов соответствуют началу экзона; г — при проведении горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле выявлен ПЦР-продукт ожидаемого размера 422 пн. На электрофореграмме фрагмент химерного транскрипта MLL-MYO1F обозначен +, негативный контроль — К, маркерная ДНК с шагом 100 пн — М; д — ПЦР в режиме реального времени также подтвердила наличие химерного транскрипта.
32
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 1
Распределение точек разрыва в ДНК гена MLL Таблица 1
Ген-партнер Ген MLL
7-й интрон 8-й интрон 9-й интрон 10-й экзон 10-й интрон 11-й экзон 11-й интрон 12-й экзон 12-й интрон
ОЛЛ (п = 52):
AF4 (п = 28) i 6 i 4 4 11 1
MLLT1 (п = 12) 4 8
MLLT3 (п = 7) i i 4 1
EPS15 (п = 4) 2 2
AFF3 (п = 1) i
Всего... i — 6 2 12 4 25 1 1
ОМЛ (п = 19):
AF4 (п = 1) 1
MLLT3 (п = 7) 2 i 3 1
MLLT10 (п = 5) i 4
MLLT11 (п = 2) 2
MYO1F (п = 2) 2
SEPT6 (п = 1) i
SEPT9 (п = 1) i
Всего. — 2 8 — 4 — 4 1 —
ОНдЛ (п = 1):
MLLT10 (п = 1) 1 1
Итого ... i 2 14 2 16 4 30 2 1
Не найдено связи между локализацией точек разрыва и полом больного, а также уровнем инициального лейкоцитоза (р > 0,05) (табл. 3).
Наиболее частым механизмом образования химерных генов являлась реципрокная транслокация, при которой две хромосомы обмениваются участками, что приводит к образованию прямого химерного гена и его реципрокного варианта (рис. 2). Такой механизм был выявлен у 53 (73,6%) больных. У 6 (11,1%) больных были найдены инсерции фрагмента хромосомного района 11q23 в другую хромосому или наоборот. Третий механизм — образование химерного гена путем транс-сплайсинга — выявлен у 11 (15,3%) больных. Данный механизм был обнаружен в большинстве случаев (9 из 12) образования химерного гена MLL-MLLT1, а также у больных с наличием MLL-MYO1F и MLL-EPS15 (табл. 4). При этом точки разрыва располагались на расстоянии 700—254 000 пар нуклеотидов (пн) от 1-го экзона гена-партнера MLL. Ниже мы приводим два примера механизма образования химерного гена путем транс-сплайсинга.
Пример 1. При исследовании методом ДИ-ПЦР выявлено слияние 10-го интрона гена MLL с некодирующей ДНК хромосомного района 19p13.3 на расстоянии 693 пн от 1-го экзона гена MYO1F. Однако на уровне кДНК это
привело к образованию химерного транскрипта MLL-MYO1F e10e2, выявленного как в ходе ОТ-ПЦР, так и при проведении ПЦР в режиме реального времени и верифицированного методом секвенирования (рис. 3).
Пример 2. У больного с наличием химерного транскрипта MLL-EPS15 выявлено слияние 10-го интрона гена MLL с ДНК, расположенной в хромосомном районе 1p32 на расстоянии 1676 нуклеотидов от 1-го экзона гена EPS15. В этом случае химерный транскрипт был образован при соединении 10-го экзона гена MLL со 2-м экзоном гена EPS15 (рис. 4).
С учетом механизмов образования как прямого, так и реципрокного генов мы выделили 5 случаев комплексных транслокаций с участием трех хромосом (№ 2—6 в табл. 5) и 1 случай сочетания инсерции c интерстициальной делецией хромосомы 11 (№ 1 в табл. 5). Как видно, в части случаев комплексный механизм с вовлечением трех хромосом можно предполагать, исходя из данных стандартного цитогенетического исследования (№ 2—5), но в то же время в ряде случаев (№ 1, 6) перестройка 11q23 являлась криптической. Реципрокные гены, которые участвовали в образовании комплексных транслокаций: DNAH6, DCPA1, MCL1, а также некодирующие последо-
Таблица 2
Связь возраста с локализацией точек разрыва в ДНК гена MLL у больных ОЛЛ и ОМЛ
Локализация точек разрыва в ДНК гена MLL ОЛЛ ОМЛ
медиана диапазон р* медиана диапазон р**
Все больные 3,6 0,03—11,9 8,0 0,8—11,9
11-й интрон 3,0 0,03—11,6 — 10,8 6,1—11,0 0,109
Все остальные, кроме 11-го интрона (ОЛЛ) 5,6 0,7—11,9 0,025 — — —
9-й интрон 6,6 3,1—11,9 0,017 5,8 0,8—11,2 —
10-й интрон 4,2 0,7—9,2 0,324 6,8 2,2—11,9 0,570
Все остальные, кроме 9-го интрона (ОМЛ) — — — 9,3 2,2—11,9 0,114
Примечание. * —р рассчитано по отношению к больным ОЛЛ, у которых точка разрыва в ДНК генаMLL располагалась в 11-м интроне; ** — р рассчитано по отношению к больным ОМЛ, у которых точка разрыва в ДНК генаMLL располагалась в 9-м интроне. Жирным шрифтом выделены статистически значимые различия.
33
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 1
Таблица 3 Связь пола и инициального лейкоцитоза с локализацией точек разрыва в ДНК гена MLL у больных ОЛЛ и ОМЛ
Инициальный по- Ген MLL
казатель 7-й интрон 8-й интрон 9-й интрон 10-й экзон 10-й интрон 11-й экзон 11-й интрон 12-й экзон 12-й интрон p
ОЛЛ (п = 52): девочки мальчики медиана (диапазон) инициального уровня лейкоцитов, •109/л i — 5 i i34 (22—225) i i 8 4 171 (64—1179) 3 1 190 (89—328) 17 8 108 (5—2058) 1 1 0,916 0,334
ОМЛ (п = 19):
девочки — — 5 — — — 3 1 — 0,101
мальчики — 2 3 — 4 — 1 — —
медиана (диапазон)
инициального уровня лейкоцитов, • 109/л 23 (4—200) 80 (68—297) 37 (8,3—215) 0,187
Примечание. * —p рассчитано для различий между 9, 10 и 11-м интронами.
вательности ДНК, расположенные в хромосомных районах 2q21.2 и 2p21.
Мы также оценили расположение точек разрыва в ге-нах-партнерах MLL. За исключением описанных выше случаев транс-сплайсинга, выявлено по 3 случая локализации точек разрыва в генах MLLT1 и EPS15 в пределах
I- го интрона. У обоих обследованных больных с наличием химерного гена MLL-MLLT1 в гене MLLT11 точка разрыва также располагалась в 1-м интроне. В гене MLLT3 у 12 больных (по 6 ОЛЛ и ОМЛ) точки разрыва были расположены в 5-м интроне и у 2 (по 1 ОЛЛ и ОМЛ) — в 4-м интроне. В гене AF4 основная зона разрывов включала в себя 3-й (19 больных), 4-й (6 больных, включая 1 больного ОМЛ) и 5-й интроны (2 больных). Кроме того, выявлено по 1 случаю локализации точки разрыва в 6-м и 10-м ин-тронах. В гене MLLT10 мы обнаружили три зоны разрывов: 3-й интрон (1 случай), 8-й интрон (3 случая, включая 1 больного ОНдЛ) и 9-й интрон (1 случай).
Прогностическая оценка локализации точки разрыва в
II- м интроне проведена у 34 больных ОЛЛ, получавших терапию по протоколу MLL-Baby. Кумулятивная вероятность развития рецидива у больных с точкой разрыва в 11-м интро-не гена MLL (п = 20) оказалось выше (0,85 ± 0,01), чем в тех случаях, в которых точка разрыва лежала между 8-м и 11-м экзоном включительно (п = 14) (0,57 ± 0,02), однако различия не достигли статистической значимости (p = 0,261). Медиана наблюдения составила 30 (диапазон 1—42) мес.
Таблица 4
Механизмы образования химерных генов в исследованной группе пациентов
Химерный ген (количество случаев) Реципрокная транслокация Инсерция Транс- сплайсинг
MLL-AF4 (п = 29) 29 — —
MLLT1 (п = 12) 3 — 9
MLLT3 (п = 14) 14 — —
MLLT10 (п = 6) — 5 —
EPS15 (п = 4) 3 — 1
MLLT11 (п = 2) 2 — —
MYO1F (п = 2) 1 — 1
AFF3 (п = 1) — 1 —
SEPT6 (п = 1) — 1 —
SEPT9 (п = 1) 1 — —
Итого ... 53 8 ii
Обсуждение
Проанализированы данные по локализации точек разрыва в ДНК гена MLL и генов-партнеров при образовании химерных генов, а также связь с биологическим характеристиками ОЛ у детей первого года жизни, включая пол, возраст и тип гена-партнера MLL.
Такие редкие химерные гены, как MLL-AFF3, MLL-MYO1F, MLL-SEPT6, MLL-SEPT9, не обнаружены на этапе первичной диагностики с использованием ОТ-ПЦР, а впервые были выявлены только после проведения ДИ-ПЦР.
ДИ-ПЦР помогла в 2 случаях верифицировать наличие редких вариантов химерного гена MLL-AF4. У мальчика в возрасте 2,5 мес с диагнозом ОЛЛ при отсутствии метафаз методом FISH была выявлена перестройка гена MLL, а исследование методом ОТ-ПЦР не выявило ни одного химерного транскрипта, не исключая и MLL-AF4. При выполнении ДИ-ПЦР было показано, что в этом случае точка разрыва локализовалась в 7-м интроне гена MLL, в то время как использовавшиеся праймеры для гена MLL в ОТ-ПЦР комплементарны 8-му экзону. В рамках крупнейшего на сегодняшний день исследования аналогичная локализация точки разрыва была описана только в 2 (0,3%) из 600 случаев [4]. Во втором случае у больной в возрасте 8,1 мес с диагнозом ОЛЛ и кариотипом лейкозного клона 46,XX,t(4;11) (q21;q23),der(7,10)?t(7;10)(q22;p15) было подозрение на то, что в образование химерного гена вовлечены не только MLL и AF4, но и еще какой-то третий ген, так как при ОТ-ПЦР химерный транскрипт MLL-AF4 не был выявлен. ДИ-ПЦР показала, что механизм образования химерного гена в этом случае — это обычная реципрокная транслокация, но точка разрыва в гене AF4 лежит в 10-м интроне за пределами покрытия использовавшихся праймеров, которые комплементарны 8-му экзону AF4. Такая ситуация описана всего в 7 (1,2%) из 600 случаев с наличием MLL-AF4 [4].
Сходные с нашими данные по относительной частоте выявленных перестроек гена MLL при ОЛЛ у детей первого года жизни были получены M.Jansen и соавт. [29], которые также использовали метод ДИ-ПЦР. Из 124 обследованных больных перестройки гена MLL были выявлены у 98 (79%). Из этого числа у 51 (52%) был выявлен химерный ген MLL-AF4, у 22 (22%) — MLL-MLLT1, у 11 (11%) — MLL-MLL3. У 12 (12%) больных были выявлены другие перестройки гена MLL, включая 3 — MLL-MLLT10, 2 — MLL-EPS15, 1 — EEFSEC (SELB), 1 — SEPT9 (MSF), 1 —
34
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 1
Таблица 5
Результаты цитогенетического и молекулярно-генетических методов обследования больных, у которых по данным ДИ-ПЦР
выявлены комплексные перестройки гена MLL
№
Пол
Воз-
раст,
мес
Иммуно-
фенотип,
FAB-
вариант
1 Ж. 2,4 B-I ОЛЛ
2 Ж. 2,8 B-I ОЛЛ
3 ж 3,0 B-I ОЛЛ
4 Ж. 5,8 B-I ОЛЛ
5 М. 2,2
ОМЛ
М2
6 М. 9,9
ОМЛ
М4
Химерный ген/ Механизм об-
Кариотип Данные FISH ция гена-
реципрокный ген разования партнера
46,XX[11] nuc ish 11q23 (5’ML.x2,3’ML.x2) (5’MLLsep3’MLLx1) [90]/(MLLx2)[10] MLL интрон 10-AFF3 интрон 6 Инсерция Внутрихро- 2q11.2-q12
ish ins(2;11)(?q11;q23q23)(5 MLL mv,3 CEP164 интрон 28 11q23.3
MLL st) - MLL интрон 10 мосомная
делеция
47, XX,del(2) (q33),t(4;11) (q21;q23), +22 [19]/46, XX [1] nuc ish 11q23 (5MLLx2)(3MLLx2) (5’MLLsep3’MLLx1)[95]/(MLLx2)[5] MLL интрон 11-AF4 интрон 3 2q21.2- Реципрокная транслока- ция Реципрокная 4q21
MLL интрон 10 транслока- ция
nuc ish 11q23 (5MLLx2)(3MLLx2) MLL интрон 11 -MLLT1 интрон 1 Реципрокная транслока- 19p13.3
46,XX,t(2;19;11) ция
(p11;p13.3;q23) (5’MLLsep3’MLLx1)[97]/(MLLx2)[3] DNAH6 интрон 71 -MLL интрон 11 Реципрокная транслока- ция 2p11.2
46,XX,der(1,3,11)t(3;4) MLL интрон 9-AF4 интрон 4 Реципрокная транслока- 4q21
(p2l;pl6) nuc ish 11q23 (5MLLx2)(3MLLx2) ция
t(4;11)(q21;q23) [6]/46,XX[4] (5’MLLsep3’MLLx1)[80]/ (MLLx2)[20] DCPA1 интрон 6-MLL интрон 9 Реципрокная транслока- ция 3p21.1
46,XY,der(1)add(1) MLL интрон 10- Транс-
(p32)del(1) (q12),add(4) nuc ish 11q23 (5’MLLx2,3’MLLx2) 19p13.3 сплайсинг
(p16),der(11)add(11) (p13)add(11)(q23) [12]/46,XY[7] (5’MLLsep3’MLLx1)[72]/ (MLLx2)[28] 3'-UTR* MCL1-MLL интрон 10 Реципрокная транслока- ция 1q21
MLL интрон 10- Инсерция Xq24
46,XY,t(2;11)(p21;q23) nuc ish 11q23 (5’MLLx2,3’MLLx2) SEPT6 интрон 2 Реципрокная
[20] (5’MLLsep3’MLLx1)[50] 2p21- транслока- —
MLL интрон 10 ция
Примечание. *3'-UTR-3’ — нетранслируемая область.
AFF3. В 4 случаях ген-партнер MLL определить не удалось. Авторы показали, что частота выявления перестроек гена MLL снижалась с возрастом. Еще одним доказательством в пользу биологического сходства ОМЛ и ОЛЛ у детей первого года жизни является тот факт, что выявленные нами в случаях ОМЛ химерные гены MLL-MLLT10 и MLL-SEPT9 в работе M. Jansen и соавт. [29] были найдены при ОЛЛ. И наоборот, наиболее часто встречающийся при ОЛЛ химерный ген MLL-AF4 был выявлен нами и в 1 случае ОМЛ.
В то же время у взрослых больных ОЛЛ спектр выявленных перестроек заметно отличается от такового у детей первого года жизни. С помощью ДИ-ПЦР перестройки гена MLL были выявлены у 118 (64%) из 184 взрослых больных CD10-отрицательным ОЛЛ [30]. Подавляющее количество — 101 (86%) — пришлось на химерный ген MLL-AF4; значительно реже выявлялся химерный ген MLL-MLLT1 — у 11 (9%). И в единичных случаях были обнаружены MLL-TET1 (п = 2), MLL-MLLT3 (п = 1), MLL-PTD (п = 1), MLL-ACTN4 (п = 1), MLL-11q23 (п = 1). Также авторы показали отличающееся от полученного нами распределение точек разрыва в гене MLL при формировании химерного гена MLL-AF4. В 40% случаев точка разрыва локализовалась в 9-м интроне MLL, в 34% — в 10-м интроне и в 24% — в 11-м интроне, который, по нашим данным, был самым частым при ОЛЛ у детей первого года жизни. Преобладание точек разрыва в 9-м интроне гена MLL было выявлено и в других работах, посвященных исследованию MLL-положительного ОЛЛ у взрослых [4, 11].
Более высокая частота выявления точек разрыва в 11-м интроне связывает между собой ОЛЛ у детей первого года жизни и вторичные ОЛ [10, 11, 31]. А выявленное нами бимодальное распределение точек разрыва при ОМЛ у детей первого года жизни очень сходно с картиной, описанной у взрослых больных ОМЛ [4]. В то же время распределение точек разрыва в гене AF4 не было связано с возрастом и было идентичным у детей первого года жизни, детей старше 1 года и взрослых [10]. Для других генов-партнеров MLL подобных исследований в доступной нам литературе не встретилось.
Мы проанализировали различные механизмы образования химерных генов. Ранее на основании данных ДИ-ПЦР было выделено несколько механизмов образования химерных генов, наиболее частым из которых является реципрок-ная транслокация (что также было подтверждено нами). Это становится возможным при наличии двух точек разрывов в двухцепочечной ДНК. Делеции и инверсии также происходят при наличии двух точек разрыва в ДНК. Комплексные транслокации с участием трех хромосом возможны только при наличии трех точек разрыва в двухцепочечной ДНК. Также описаны варианты, при которых комплексная транслокация сочетается с делецией; для реализации этого механизма также необходимо наличие трех разрывов в двухцепочечной ДНК. Выделяют инсерции 1-го типа, при которых часть хромосомы 11, включающая в себя ген MLL, встраивается в партнерскую, а также инсерции 2-го типа, харак-
35
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 1
теризующиеся тем, что ген-партнер вместе с хромосомой, на которой он расположен, встраивается в ген MLL. Самым сложным механизмом является комплексная транслокация с участием не менее четырех хромосом, которая возможна только при наличии четырех и более (хромотрипсис) точек разрыва в двухцепочечной ДНК [3, 4].
Показано, что большинство генов-партнеров имеют только один возможный механизм образования химерного гена, хотя имеются и исключения. Гены-партнеры, транскрибируемые в теломерном направлении, могут образовывать химерные гены с участием MLL путем реци-прокных транслокаций, транс-сплайсинга или делеций 11q. Гены, транскрипция которых идет в центромерном направлении, могут образовывать химерные гены только путем инсерций 1-го и 2-го типа или инверсии [3].
Особый интерес вызывает группа, в которой химерные гены образуются путем транс-сплайсинга (spliced fusions) [3, 4, 32]. При этом точка разрыва находится в некодирующей последовательности ДНК, расположенной выше (3’) по отношению к гену-партнеру. И для синтеза функционирующего химерного транскрипта необходимо, чтобы транскрипция происходила одновременно со сплайсингом, что приводит к тому, что последний по отношению к точке разрыва экзон генаMLL (находящийся 5’) соединяется с любым, но не 1-м экзоном гена-партнера [32]. Такой механизм описывается как для ряда редких генов-партнеров MLL, таких как DCPS, ZFYVE19, CT45A2 (для которых он является единственным), так и для AF4, EPS15, MLLT3, MLLT1, ELL, MYO1F, SEPT5 [3, 4] (для которых основным механизмом образования химерного гена является реципрокная транслокация). ДляМ^-MLLT1 такой механизм найден примерно в половине всех случаев [32] и примерно в 30% случаев для MLL-EPS15 [3]. При образовании химерных генов MLL-AF4, MLL-MLLT3, MLL-SEPT5 транс-сплайсинг встречается очень редко [4]. Нами найден первый случай транс-сплайсинга для MLL-MYO1F, который позднее был включен в работу С. Meyer и соавт. [4]. Также следует отметить, что из 12 описанных нами случаев MLL-MLLT1 подобный механизм выявлен в 9. Возможно, что его реальная частота у детей первого года жизни с MLL-MLLT1 -положительным ОЛЛ несколько выше, чем приводится в литературе.
В работе M. Emerenciano и соавт. [17] был проведен анализ исходов терапии больных MLL-положительными ОЛ в зависимости от локализации точки разрыва. Авторам удалось показать негативное прогностическое значение локализации точки разрыва в 11-м интроне гена MLL при ОЛ у детей в возрасте младше 24 мес по сравнению с больными, у которых точка разрыва находилась в 8, 9, 10-м интронах и 10-м экзоне. Одно из возможных объяснений, которое приводят авторы — различная структура PHD домена гена MLL, что в случае с локализацией точки разрыва в 11-м интроне приводит к повышенной стабильности химерного белка или потере его способности переключаться в направлении репрессии транскрипции [4, 17].
Мы не смогли подтвердить неблагоприятное прогностическое значение точки разрыва в 11-м интроне гена MLL. Возможной причиной полученных различий являются как разные терапевтические стратегии, так и отличающийся поло-возрастной состав больных: 30 девочек и 14 мальчиков в возрасте младше 12 мес в нашей работе; 10 девочек и 20 мальчиков в возрасте до 24 мес в работе M.Emerenciano и соавт. [17]. Еще одним объяснением различий могут служить различия в диагнозе: все больные, включенные в данную работу, страдали ОЛЛ и получали
терапию по протоколу MLL-Baby [33], в то время как в работе M.Emerenciano и соавт. [17] это была смешанная группа из 20 больных ОЛЛ и 10 больных ОМЛ.
Еще одно перспективное направление, использующее данные о структуре химерных генов, — это исследование МОБ. Ранее нами были получены сопоставимые результаты при определении МОБ в геномной ДНК и кДНК у больных с наличием MLL-MLLT4, MLL-EPS15 [14, 15]. Проведенное в рамках протокола Interfant-99 сравнительное определение МОБ у 98 детей первого года жизни, больных ОЛЛ, исходя из структуры зоны слияния в ДНК MLL и гена-партнера, а также по пациентспецифическим перестройкам генов Ig/TCR показало хорошую сопоставимость результатов [12]. Полученные дискордантные результаты распределились следующим образом. В 6 образцах величина МОБ, полученная при анализе перестроек Ig/TCR, была незначительно выше, чем данные, полученные с использованием MLL (диапазон различий 3,5—5,7 раза). И наоборот, в 14 образцах МОБ, полученная при анализе MLL, была значительно выше, чем при применении Ig/TCR-маркеров (диапазон различий 3,9—410 000 раз) [12]. Различия в полученных результатах обусловлены тем, что перестройки гена MLL связаны с процессами лейкозогенеза и с большой долей вероятности присутствуют во всех лейкозных клетках, в то время как для перестроек Ig/TCR, и в первую очередь гена IgH, характерна олигоклональность, т.е. они выявляются только в части (субклоне) лейкозных клеток [29]. Таким образом, использование MLL-маркеров имело значительные преимущества и было рекомендовано для использования в первой линии диагностики МОБ у детей первого года жизни при ОЛЛ [12]. В пользу MLL-маркеров говорит и тот факт, что количественный диапазон, равный 10-4, был достигнут в 70% их применения и только в 50% при использовании Ig/TCR--маркеров.
Таким образом, в настоящее время всем обследуемым нами больным с выявленными перестройками гена MLL, включая больных ОЛЛ, получающих терапию по протоколу MLL-Baby, а также ряду больных ОМЛ проводится исследование методом ДИ-ПЦР для верификации гена-партнера, определения точки разрыва в нем и гене MLL как для изучения биологии опухоли, так для последующего мониторинга МОБ в геномной ДНК.
Наиболее частой зоной разрыва в ДНК гена MLL при ОЛЛ является 11-й интрон, на долю которого приходится 48,1% случаев, при оМл — это 9-й интрон (42,1%). При ОЛЛ больные, у которых точка разрыва располагается в 11-м интроне, младше всех остальных. Зоны разрыва в генах-партнерах MLL чаще всего затрагивают один или два интрона, за исключением генов AF4 и MLLT10, в которых основные зоны разрывов более протяженные. В ходе работы были описаны различные механизмы образования химерных генов с участием MLL, наиболее частым из которых являются реципрокные транслокации. Наши результаты подтвердили, что ДИ-ПЦР является методом, позволяющим выявлять практически любую перестройку с участием гена MLL независимо от гена-партнера, зоны разрыва в ДНК и механизма ее образования.
REFERENCES [ЛИТЕРАТУРА]
1. Ziemin-van der Poel S., McCabe N., Gill H., Espinosa R. 3rd, Patel Y., Harden A., et al. Identification of a gene, MLL, that spans the breakpoint in 11q23 translocations associated with human leukemias. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991; 88(23): 10735—39.
36
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 1
2. Tkachuk D., Kohler S., Cleary M. Involvement of a homolog of Drosophila tritorax by 11q23 chromosomal translocations in acute leukemias. Cell. 1992; 71(4): 691—700.
3. Meyer C., KowarzE., Hofmann J., Renneville A., Zuna J., Trka J., et al. New insights to the MLL recombinome of acute leukemias. Leukemia. 2009; 23(8): 1490—9.
4. Meyer C, Hofmann J., Burmeister T., GrogerD., Park T.-S., Emeren-cianoM., et al. The MLL recombinome of acute leukemias in 2013. Leukemia. 2013; 27(11): 2165—76. doi: 10.1038/leu.2013.135.
5. Felix C., Hosler M., Slater D., Parker R., Masterson M., Whitlock J., et al. MLL genomic breakpoint distribution within the breakpoint cluster region in de novo leukemia in children. J. Pe-diatr. Hematol. Oncol. 1998; 20(4): 299—308.
6. DomerP., Fakharzadeh S., Chen C.S., Jockel J., Johansen L., Silverman G., et al. Acute mixed-lineage leukemia t(4;11)(q21;q23) generates an MLL-AF4 fusion product. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90(16): 7884—8.
7. Felix C., Kim S., MegonigalM., Slater D., Jones D., Spinner N., et al. Panhandle polymerase chain reaction amplifies MLL genomic translocation breakpoint involving unknown partner gene. Blood. 1997; 90(12): 4679—86.
8. Meyer C., Schneider B., Reichel M., Angermueller S., Strehl S., Schnittger S., et al. Diagnostic tool for the identification of MLL rearrangements including unknown partner genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102(2): 449—54.
9. Nilson I., Lochner K., Siegler G., Greil J., Beck J., Fey G., et al. Exon/intron structure of ALL1 (MLL) gene involved in translocations to chromosomal region 11q23 and acute leukemias. Br. J. Haematol. 1996; 94(4): 966—72.
10. Reichel M., Gillert E., Angermuller S., Hensel J.P., Heidel F., Lode M., et al. Biased distribution of chromosomal breakpoints involving the MLL gene in infants versus children and adults with t(4;11) ALL. Oncogene. 2001; 20(23): 2900—7.
11. Jung R., Jacobs U., Krumbholz M., Langer T., Keller T., De Lorenzo P., et al. Bimodal distribution of genomic MLL breakpoints in infant acute lymphoblastic leukemia treatment. Leukemia. 2010; 24(4): 903—7.
12. van der Velden V., Corral L., Valsecchi M., Jansen M., De Lorenzo P., Cazzaniga G., et al. Prognostic significance of minimal residual disease in infants with acute lymphoblastic leukemia treated within the Interfant-99 protocol. Leukemia. 2009; 23(6): 1073—9.
13. Burmeister T., MarschalekR., SchneiderB., Meyer C., GokbugetN., Schwartz S., et al. Monitoring minimal residual disease by quantification of genomic chromosomal breakpoint sequences in acute leukemias with MLL aberrations. Leukemia. 2006; 20(3): 451—7.
14. Tsaur G., Ivanova A., Plekhanova O., Riger T., Yakovleva Y., Popov A., et al. MRD Monitoring in AML Patients with MLL-MLLT4 by quantification of fusion gene transcripts and genomic chromosomal breakpoint sequences. Blood. 2008; 112(11): Abstr. 4888.
15. Tsaur G.A., Popov A.M., Plekhanova O.M., Kustanovich A.M., Aleinikova O.V., Gindina T. L. et al. Translocation t(1;11) (p32;q23) with MLL-EPS15 fusion gene formation in acute leukemias: a literature review and 6 new case report. Approaches to minimal residual disease monitoring (Translokaciya t(1;11) (p32;q23) s obrazovaniem khimernogo gena MLL-EPS15 pri os-tryh leikozakh: obzor literatury i opisanie 6 sluchaev. Podkhody k monitorirovaniyu minimalnoi ostatochnoi bolezni). Onkoge-matologiya. 2013; 1: 17—33]. (in Russian)
[Цаур Г.А., Попов А.М., Плеханова О.М., Кустанович А.М., Алейникова О.В., Гиндина Т.Л. и др. Транслокация t(1;11) (p32;q23) с образованием химерного гена MLL-EPS15 при острых лейкозах: обзор литературы и описание 6 случаев. Подходы к мониторированию минимальной остаточной болезни. Онкогематология. 2013; 1: 17—33].
16. Zuna J., Burjanivova T., Mejstrikova E., Zemanova Z., Muziko-va K., Meyer C., et al. Covert preleukemia driven by MLL gene fusion. Genes Chromosomes Cancer 2009; 48(1): 98—107. doi: 10.1002/gcc.20622.
17. Emerenciano M., Meyer C., Mansur M.B., Marschalek R., Pom-bo-de-Oliveira M.S.; Brazilian Collaborative Study Group of Infant Acute Leukaemia. The distribution of MLL breakpoints correlates with outcome in infant acute leukaemia. Br. J. Haematol. 2013; 161(2): 224—36. doi: 10.1111/bjh.12250.
18. Bennett J., Catovsky D., Daniel M., Flandrin G., Galton D., Gralnick H., et al. Proposals for the classification of the acute
leukaemias. French—American—British (FAB) co-operative group. Br. J. Haematol. 1976; 33(4): 451—8.
19. Bene M., Castoldi G., Knapp W., Ludwig W.-D., Matutes E., Orfao A., et al. Proposals for the immunological classification of acute leukemias. European Group for the Immunological Characterization of Leukemias (EgIL). Leukemia. 1995; 9(10): 1783—6.
20. Bene M., Nebe T., Bettelheim P., Buldini B., Bumbea H., Kern W., et al. Immunophenotyping of acute leukemia and lymphoprolif-erative disorders: a consensus proposal of the European Leuke-miaNet Work Package 10. Leukemia. 2011; 25(4): 567—74.
21. Mitelman F., ed. ISCN 1995: An International System for Human Cytogenetic Nomenclature. Basel: Karger; 1995.
22. ShafferL., Tommerup N., eds. ISCN 2005: An International System For Human Cytogenetic Nomenclature. Basel: Karger; 2005.
23. Schaffer L., SlovakM., Campbell L., eds. ISCN 2009: An International System For Human Cytogenetic Nomenclature. Basel: Karger; 2009.
24. Borkhardt A., Repp R., Haupt E., Brettreich S., Buchen U., Gos-sen R., et al. Molecular analysis of MLL/AF4 recombination in infant acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 1994; 8(4): 549—53.
25. Pallisgaard N., Hokland P., Riish0j D., Pedersen B., J0rgensen P. Multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction for simultaneous screening of 29 translocations and chromosomal aberrations in acute leukemia. Blood. 1998; 92(2): 574—88.
26. van Dongen J., Macintyre E., Gabert J., Delabesse E., Rossi V., Sa-glio G., et al. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia. 1999; 13(12): 1901—18
27. Tsaur G. A., Nasedkina T.V., Popov A. M., Kalennik O.V., Solodovnikov A.G., Riger T.O., et al. Time to complete molecular remission as risk factor in infant under 1 year of age with acute lym-phablasctic leukemia (Vremya dostizheniya molekulyarnoi remissii kak faktor prognoza u detei pervogo goda zhizni ostrym limfoblast-nym leikozom). Onkogematologiya. 2010; 2: 46—54. (in Russian) [Цаур Г.А., Наседкина Т.В., Попов А.М., Каленник О.В., Солодовников А.Г., Ригер Т.О. и др. Время достижения молекулярной ремиссии как фактор прогноза у детей первого года жизни острым лимфобластным лейкозом. Онкогематология. 2010; 2: 46—54].
28. Tsaur G.A., DruyA.E., Popov A.M., SemenikhinaE.R., Riger T.O., Ivanova A.S., et al. Microfluidic biochips for RNA quantity and quality evaluation in patients with oncological and oncohema-tological disorders (Vozmozhnost ispolzovaniya mikrostruinykh biochipov dlya otsenki kachestva i kolichestva RNK u patsientov s onkologicheskimi i onkogematologicheskimi zabolevaniyami). Vestnik Uralskoi medicinskoi akademicheskoi nauki. 2011; 37(4): 107—11. (in Russian)
[Цаур Г.А., Друй А.Е., Попов А.М., Семенихина Е.Р., Ригер Т.О., Иванова А.С. и др. Возможность использования микроструйных биочипов для оценки качества и количества РНК у пациентов с онкологическими и онкогематологическими заболеваниями. Вестник Уральской медицинской академической науки. 2011; 37(4): 107—11].
29. Jansen M., Corral L., Velden van der V., Panzer-Grumayer R., Schrappe M., Schrauder A., et al. Immunobiological diversity in infant acute lymphoblastic leukemia is related to the occurrence and type of MLL gene rearrangement. Leukemia. 2007; 21(4):633—41.
30. Burmeister T., Meyer C., Schwartz S., Hofmann J., MolkentinM., Kowarz E., et al. The MLL recombinome of adult CD10-negative B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia: results from the GMALL study group. Blood. 2009; 113(17): 4011—5.
31. Felix C., Winick N., Negrini M., Bowman W., Croce C., Lange B. Common region of ALL-1 gene disrupted in epipodophyllotox-in-related secondary acute myeloid leukemia. Cancer Res. 1993; 53(13): 2954—6.
32. Meyer C., Burmeister T., Strehl S., Schneider B., Hubert D., Zach O., et al. Spliced MLL fusions: a novel mechanism to generate functional chimeric MLL-MLLT1 transcripts in t(11;19) (q23;p13.3) leukemia. Leukemia. 2007; 21(3):588—90.
33. Fechina L., Shorikov E., Tsaur G., et al. Contribution of all-trans retinoic acid to improved early relapse-free outcome in infant acute lymphoblastic leukemia comparing to the chemotherapy alone. Blood. 2007; 110(11): 832А. Abstr. 2828.
Поступила 22.08.13
37
