CC BY
8УДК 579.678
К ВОПРОСУ ФАГОТИПИРОВАНИЯ ЛИСТЕРИЙ
(Question of Listeria monocytogenes)
Е. Н. Ковалева, кандидат биологических наук E. N. Kovaleva, Candidate of Biological Sciences Д. А. Васильев, доктор биологических наук D. A. Vasiliev, Doctor of Biological Sciences ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина», Ульяновск, Россия 432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1, e-mail: elkov@pochta.ru
В научной статье рассматриваются вопросы эпидемиологической работы по детекции и идентификации бактерий вида Listeria monocytogenes. Экспериментальные данные ряда авторов подтверждают возможность использования специфических бактериофагов как средств мониторинга листериозной инфекции
Ключевые слова: детекция, идентификация, Listeria monocytogenes, пищевое сырье, пищевые продукты.
Листериоз - инфекционное заболевание человека и животных, вызываемое патогенными представителями рода Listeria, характеризуется множеством источников и резервуаров инфекции, разнообразием путей и факторов передачи возбудителя. Наибольшее значение в распространении листериоза играет способность возбудителя длительно сохраняться в различных пищевых продуктах, в том числе упакованных в барьерные пленки, ограничивающие доступ кислорода. Источником инфекции являются животные - больные и бессимптомные носители, которые выделяют возбудителя во внешнюю среду [1, 2].
Для облегчения эпидемиологической работы по обнаружению и слежению за листериозными инфекциями необходимо знать маркеры штаммов Listeria. Одной из возможностей является фаготипирование
[1, 2, 3].
A. Audurier и соавторы [4] описали систему для фаготипирования штаммов L.monocytogenes с использованием 15 фагов, выделенных из лизогенных штаммов. С помощью такого набора фагов 238 из 350 штаммов (68 %) можно было классифицировать на 22 типа. В то же время они опубликовали кодовую систему для оценки результатов фаготипирования. Этот «октальный код» не только рациональный, но и полезный метод, облегчающий сравнение изучаемых штаммов с помощью компьютера.
Те же авторы [5] исследовали 823 штамма Listeria, полученные во Франции, с помощью 20 фагов. Смогли провести типирование 645 из всех штаммов (78,4 %). 131 штамм принадлежал к серо-типу 1/2, 499 к серотипу 4, 5 к серотипу 5 и 10 к другим серотипам. Удалось фаготипировать 57,7% штаммов серотипа 1/2, 88 % штаммов серотипа 4, все штаммы серотипа 5 и менее половины других серо-типов (10 из 24 штаммов).
In a scientific article discusses the epidemiological work on the detection and identification of Listeria monocytogenes bacteria. The experimental data of some authors affirm the possibility of using specific bacteriophages as a means of monitoring infection of listeriosis.
Key words: detection, identification, Listeria monocytogenes, food raw materials and food products.
Для оценки пригодности этого метода B. Ralovich [3] исследовал литическую модель 247 штаммов Listeria, выделенных из разных источников - людей, животных, воды - в Венгрии. Было типировано 39,6% всех штаммов. Такой результат несколько низок, поэтому для использования этого метода требуется больше фагов. В последующих исследованиях использовались 27 фагов Listeria и определили 34 литические модели.
Было типировано 36 (40,9%) из 88 штаммов Listeria серотипа 1/2 а, а остальные представляли 14 типов фагов. 77,7% из 18 штаммов были отнесены к серотипу 4. Они принадлежали к 10 типам фагов. 3 штамма L.monocytogenes серотипа 5 можно было разделить на 2 типа фагов, 2 из них с одной и той же литической моделью были выделены в Венгрии, третий с другим типом фага выделен в Болгарии. 36 штаммов принадлежали к серотипу 6а и 6в.
Литическую модель можно было определить у 20 штаммов, 16 штаммов остались нетипируемыми. 20 штаммов можно было распределить на 10 типов фагов. Кроме того, были исследованы еще 18 других штаммов Listeria. Не было определено к каким серо-типам, сероварам они принадлежали. Можно было определить литическую модель 7-ми из всех штаммов.
Результаты свидетельствуют о том, что между антигенной структурой и фаговым типом данного штамма Listeria существует специфическая связь.
Когда данные типирования фагов венгерских штаммов Listeria сравнивают с таковыми французских штаммов, оказывается, что соотношение типи-руемых и нетипируемых штаммов различно в двух странах (табл. 1).
* - разница значительна, ** - разница незначительна; X2=7,186 p<0,01
Таблица 1 - Соотношение типируемых и нетипируемых
штаммов листерий в двух странах [3]
Серотип Страна Типируемые штаммы (коэффиц.) Нетипируемые штаммы Всего
1/2 Венгрия 36 (10,40*) 52 88
Франция 131 (10,57**) 96 237
4 Венгрия 14 (10,77*) 4 18
Франция 499 (10,88**) 68 567
5 Венгрия 2 - 2
Франция 5 - 5
Другие Венгрия 27 (10,47) 30 57
Франция 10 (10,41) 14 24
Эти результаты позволяют допустить, что между штаммами Listeria могут существовать небольшие различия в разных странах, чему можно приписать патологические и эпидемиологические различия.
S. Ortel [6] тоже использовал систему типирования фагов и обнаружил, что эпидемиологическая ситуация и литическая модель штаммов Listeria, выделенных в течение 1957-1979 гг. в Германии, изменилось. Кроме того, ежегодно менялась частота обнаружения Listeria с одним и тем же типом фага.
J. McLauchlin, A. Audurier, A.G. Taylor [7] исследовали штаммы L.monocytogenes, выделенные в период 1967 - 1984 от 475 человек, зараженных листерио-зом, отнесенные к одной из трех серогрупп (1/2, 3 или 4). Штаммы были фаготипированны при помощи 28 фагов для выявления трех аспектов эпидемиологии листериоза. У троих пациентов, страдающих листериозом, от 3 месяцев до 2 лет, были обнаружены штаммы одной и той же серогруппы, неразличимые типированием. Имело место десять случаев возможной перекрестной инфекции между парами новорожденных в одной больнице; первый ребенок заболевал в день рождения или на следующий день после него, а второй ребенок заболевал через 8-12 дней после контакта с первым. В каждой паре L. monocytogenes принадлежали к одной серогруппе и были неразличимы типированием.
Три группы случаев, возможно, были вызваны типичным источником инфекции. Штаммы L. monocytogenes в 10 из 11 случаев листериоза в области Карлайл в июле-декабре 1981 принадлежали к одной серогруппе; девять штаммов являлись нетипи-руемыми. Вторая группа случаев включала взрослых людей, находившихся в больнице, и третью пару -новорожденных детей, которые заболели вскоре после рождения. В каждой группе штаммы принадлежали к одной серогруппе и были неразличимы типи-рованием. Авторы предполагают возможность общего источника инфекции, т.к. два последних случая зафиксированы в короткий временной период, когда было выделено необычайно высокое количество штаммов листерий, которые не различались фаготи-пированием.
M.J. Loessner, M. Busse [8] была создана схема типирования бактериофагов для выделения изолятов Listeria из молочных и других пищевых продуктов. Для типирования было использовано 16 изолятов фа-
гов выделенных из природных источников и из лизо-генных штаммов. Согласно их литическим спектрам, изоляты были разделены на четыре группы. До сих пор наблюдалась 41 четкая модель (структура) лизиса, когда данный набор был использован в типирова-нии 57 определенных эталонных штаммов, представляющих пять утвержденных видов и 16 серогрупп в дополнение к 454 изолятам Listeria преимущественно пищевого происхождения. В целом, типируемость составляла 84,5 %; т.е., штамм был лизирован не менее чем одним фагом при 100 % типовом тестовом спаде. Штаммы, принадлежащие к серовару 3, были в основном сопротивляемы к лизису внесенных фагов. Результаты оказались высоко воспроизводимыми, что было подтверждено посредством ретипиро-вания несколько недель спустя. Некоторые фаги, изолированные из природных источников, показали более широкий литический спектр, чем фаги, изолированные из лизогенных штаммов. В соответствии с этим, фаги были обнаружены в различных кластерах в созданной компьютером карте систем связи. Видовая специфичность и сероварная специфичность ли-тической реакции не была выявлена. Ни один из фагов не был способен лизировать штаммы L.grayi, L.murrayi или Jonesia denitrificans. Система фаготи-пирования может предоставить важную информацию для способов обнаружения и устранения источников контаминации вида Listeria в оборудовании молочных заводов.
Система типирования J. McLauchlin, A. Audurier, A.G. Taylor [9] для штаммов L.monocytogenes основывается на литических способностях 28 фагов и была проанализирована при помощи ряда штаммов, изолированных в Соединенном Королевстве, и проверена на «слепом эксперименте». Система оказалась высоко воспроизводимой и избирательной. 64 % из проверенных штаммов удалось типировать.
Комбинированный анализ (N. van der Mee-Marquet, A. Audurier [5]) 5179 фаговых реакций 20 штаммов L.monocytogenes на протяжении 14 лет и результаты фаготипирования 2659 и более штаммов L.monocytogenes позволили оценить специфичность литического спектра и разнообразие литических реакций 35 фагов. Данное исследование включало 26 фагов, рекомендованных для международного метода типирования фагов, разработанного в 1985 году J. Rocourt [et al]. Авторами внесены предложения для
модификации системы с целью производства оптимального набора бактериофагов для рутинного использования.
Таким образом, метод фаготипирования позволяет проводить более глубокий эпидемиологический ана-
лиз вспышек, может оказать неоценимую помощь при установлении связи между отдельными вспышками и спорадическими случаями болезни, а также при выявлении источника возбудителя инфекции.
Литература
1. Васильев Д.А. Листериозные бактериофаги. На-
учное издание / Д.А. Васильев, Е.Н. Ковалева, С.Н. Золотухин. - Ульяновск: НИИЦМиБ, 2013 - 66 с.
2. Листерии и листериоз / И.А. Бакулов, Д.А. Ва-
сильев, Д.В. Колбасов [и др.] // монография. -Ульяновск, УГСХА, 2008. - 168 с.
3. Ralovich, B. Listeriosis research. Present situation
and perspective / B. Ralovich. - Budapest, 1984. -222 p.
4. Mee-Marquet, N. Evaluation of seven experimental
phages for inclusion in the international phage set for the epidemiological typing of Listeria monocytogenes / N. van der Mee-Marquet, M. Loessner, A. Audurier // Appl. Environ. Microbiol. - 1997. -Vol. 63, N 9. - P. 3374 - 3377.
5. Mee-Marquet N. Proposals for optimization of the
international phage typing system for Listeria mo-nocytogenes: combined analysis of phage lytic spectrum and variability of typing results / N. van
der Mee-Marquet, A. Audurier // Appl. Environ. Microbiol. - 1995. - Vol. 61, N 1. - P. 303 - 309.
6. Ortel, S. Fine structure of Listeria monocytogenes
under the effect of ampicillin / S. Ortel // Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. - 1972. - N 19. - P. 311 - 323.
7. McLauchlin J. Aspects of the epidemiology of hu-
man Listeria monocytogenes infections in Britain 1967-1984; the use of serotyping and phage typing / J. McLauchlin, A. Audurier, A.G. Taylor // J. Med. Microbiol. - 1986. - Vol. 22. - P. 367 - 377.
8. Loessner M.J. Bacteriophage typing of Listeria
species / M.J. Loessner, M. Busse // Appl. and Environ. Microbiol. - 1990. - Vol. 56, N 6. - P. 1912 - 1918.
9. McLauchlin J. The evaluation of a phage-typing
system for Listeria monocytogenes for use in epidemiological studies / J. McLauchlin, A. Audurier, A.G. Taylor // J. Med. Microbioi. -1986. - Vol. 22 - P. 357 - 365.
Поступила в редакцию: 20.02.2015 г.
Е. Н. Ковалева, кандидат биологических наук, ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина», Ульяновск, Россия 432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1, e-mail: elkov@pochta.ru
