CC BY
104
УДК / UDC 578.81:579.67
ВЫДЕЛЕНИЕ ЛИСТЕРИОЗНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ ИЗ ОБЪЕКТОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ
ISOLATION OF LISTERIAPHAGE FROM THE ENVIRONMENTAL OBJECTS
Сульдина Е.В., аспирант Suldina E.V., Post-graduate student Ковалева Е.Н.*, кандидат биологических наук Kovaleva E.N., Candidate of Biological Sciences Васильев Д.А., Золотухин С.Н., доктора биологических наук Vasilyev D.A., Zolotukhin S.N., Doctors of Biological Sciences ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина», Ульяновск, Россия Ulyanovsk State Agricultural Academy named after P.A. Stolypin, Ulyanovsk, Russia
*E-mail: elkov@pochta.ru
АННОТАЦИЯ
Статья посвящена вопросу разработки схемы выделения листериозных бактериофагов из объектов внешней среды. Авторами показано, что использование выделенных специфических бактериофагов позволяет проводить детекцию бактерий вида Listeria monocytogenes.
ABSTRACT
The article focuses on the development of allocation schemes listeriaphages from the environmental objects. The authors have shown that the use of allocated specific bacteriophages allows detection of the bacterium Listeria monocytogenes.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА
Listeria monocytogenes, пищевой листериоз, бактериофаги, детекция, биоконтроль. KEY WORDS
Listeria monocytogenes, food Listeria, bacteriophages, detection, biocontrol.
Листериозная инфекция животных впервые описана в 20-х гг. XX века. У людей отмечались лишь спорадические случаи заражения. Листерии как этиологический агент пищевого заболевания известны с конца ХХ века. Пищевой листериоз -инфекционное заболевание, вызываемое патогенными представителями рода Listeria, характеризуется множеством источников и резервуаров инфекции, разнообразием путей и факторов передачи возбудителя, полиморфизмом клинических проявлений, высокой летальностью у новорожденных и лиц с иммунодефицитами [1]. Был зафиксирован ряд крупных вспышек листериоза людей с высоким уровнем смертности при употреблении пищевых продуктов животного и растительного происхождения. По информации Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия в США с 17 октября 2014 года регистрируется очередная вспышка пищевого листериоза среди населения. Всего пострадало 28 человек, в том числе 26 было госпитализировано. В 5 случаях установлен летальный исход [2].
Продукты питания могут быть контаминированы листериями в процессе приготовления пищи. В первую очередь вызывают опасение те продукты, которые употребляются в необработанном виде - охлажденные свежие салаты, овощи, фрукты, а также молочные продукты и др. Тем самым актуальна проблема профилактики инфицирования листериями пищевого сырья и продуктов питания. Бактериофаги представляют собой эффективный способ борьбы с пищевыми патогенами без влияния на качество продукта [3-7].
Необходимо отметить, что, несмотря на успехи, достигнутые в выделении и изучении листериозных бактериофагов, они все еще относятся к числу малоизученных объектов [8-12].
Цели и задачи исследования. Целью работы является разработка схемы выделения листериозных бактериофагов из объектов внешней среды.
Материалы и методы. В работе использовали тест-штаммы бактерий вида рода Listeria: L.monocytogenes (9-127 (I серотип), 9-72 (II серотип), L.innocua, L.seeligeri, L.welshimeri, L.murrayi, L.grayi, L.ivanovii из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской ГСХА им. П.А. Столыпина.
Выделение и изучение биологических свойств фагов проводили по методам, предложенным M.R.J. Clokie, A.M. Kropinski [13], Э. Каттер, А. Сулаквелидзе [14], С.Н. Золотухиным [15].
Результаты исследований. Материалом для выделения являлись образцы почвы и сточных вод, взятые на территории различных районов Ульяновской области (таблица 1).
Таблица 1 - Источник выделения листериозных бактериофагов
№ Источник Район, населенный пункт Кол-во Кол-во
п/п выделения Ульяновской области образцов штаммов фагов
1 Сточные воды Майский район, Карлинское 3 -
2 Почва Мелекесский район, Филиповка 5 -
3 Почва Мелекесский район, Аллагулово 6 -
4 Почва Мелекесский район, Мулловка 2 -
5 Почва Мелекесский район, Моисеевка 8 1
6 Сточные воды Мелекесский район, Новоселки 11 -
7 Сточные воды Новомалыклинский район, Абдрееро 5 -
8 Сточные воды Новомалыклинский район, Александровка 7 -
9 Почва Новомалыклинский район, Новая Малыкла 4 1
10 Почва Новомалыклинский район, Новая Бесовка 6 -
Итого: 57 2
В колбу, содержащую 50 мл стерильного мясо-пептонного бульона, вносили 5 г почвы и/или 5 мл сточных вод и культивировали в термостате в течение суток при 37°С, после чего проверяли содержимое на наличие листерий, путем высева на селективные среды (Oxford agar). Затем в колбу добавляли по 0,5 мл индикаторных штаммов бактерий рода Listeria: L.m 9-127, L.m 9-72, помещали в термостат и инкубировали еще сутки при 37°С. После этого содержимое колбы фильтровали через фильтровальную бумагу и мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм для удаления бактериальных клеток. Полученные фильтраты исследовали методом агаровых слоев по Грациа с индикаторными штаммами. Чашки ставились в термостат на 12 - 20 часов при 37°С. Наличие негативных колоний или зон лизиса на газоне роста индикаторной культуры свидетельствовало о присутствии в исследуемом материале бактериофага.
В результате исследований образцов почв и сточных вод удалось по указанной схеме выявить 2 изолята листериозных бактериофагов.
Негативные колонии отвивали в мясо-пептонный бульон для проведения пассажа. Для этого, в две пробирки с 4,5 мл мясо-пептонного бульона добавляли стерильной пипеткой 0,2 мл 18-ти часовой бульонной культуры соответствующего индикаторного штамма. В одну из пробирок отвивали негативную колонию, вторая пробирка служила контролем.
Посевы помещали в термостат и инкубировали их при 37°С в течение 24 часов до выраженного помутнения контроля. Затем содержимое опытной пробирки освобождали от микробных клеток фильтрованием через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Фильтрат использовали для проведения следующего пассирования фага.
Для определения морфологии негативной колонии высевали фаг в на чашки методом агаровых слоев. Посевы культивировали в термостате при температуре 37°С. Изучение морфологии негативных колоний проводили через 24 часа.
Негативные колонии, образуемые изучаемыми листериозными бактериофагами, имели схожую морфологию: круглые прозрачные с ровными краями, диаметр до 3 мм, без зоны неполного лизиса.
В результате изучения специфичности действия по отношению к представителям других видов рода Listeria (L.innocua, L.seeligeri, L.welshimeri, L.murrayi, L.grayi, L.ivanovii) установлено, что выделенные бактериофаги способны лизировать культуры бактерий вида L.monocytogenes и не лизируют бактерии других видов листерий, что говорит о видовой специфичности исследуемых фагов.
В результате проведенных исследований разработана оптимальная схема выделения листериозных бактериофагов из объектов внешней среды, выделены бактериофаги бактерий вида L.monocytogenes.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Листерии и листериоз. Монография / И.А. Бакулов, Д.А. Васильев, Д.В. Колбасов, Т.И. Кольпикова, Ю.О. Селянинов, И.Ю. Егорова. - Ульяновск: Ульяновская ГСХА, 2008. - 168 с.
2. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека: http://rospotrebnadzor.ru/about/info/news/news_details.php?ELEMENT_ID=2803
3. Васильев, Д.А. Листериозные бактериофаги. Научное издание / Д.А. Васильев, Е.Н. Ковалева, С.Н. Золотухин. - Ульяновск, 2013 - 66 с.
4. Ковалева, Е.Н. Специфические бактериофаги как средство биоконтроля пищевого листериоза / Е.Н. Ковалева, Д.А. Васильев // Биотика. - 2015. - т. 2, № 1. - С. 13 -18.
5. Летаров, А.В. Экологические основы рациональной фаговой терапии / А.В. Летаров, А.К. Голомидова, К.К. Тарасян // Acta Naturae (русскоязычная версия). - 2010. - т. 2, № 1. - С. 66 - 79.
6. Пименов, Н.В. Специфическая борьба с сальмонеллой в условиях птицеводства / Н.В. Пименов // Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences: ISSUE. -2013, №11(23). - P. 16-23
7. Феоктистова, Н.А. Разработка методов фагоиндикации Bacillus megaterius в мясных и рыбных товарах / Н.А. Феоктистова, Н.А. Петрукова, Д.А. Васильев [и др.] // Инфекция и иммунитет. - 2014, № S. - С. 119.
8. Guenther, S. Bacteriophage biocontrol of Listeria monocytogenes on soft ripened white mold and red-smear cheeses / S. Guenther, M.J. Loessner // Bacteriophage. - 2011. -Vol. 1, N 2. - P. 94 - 100.
9. Loessner, M.J. Improved procedure for bacteriophage typing of Listeria strains and evaluation of new phages / M.J. Loessner // Appl. Environ. Microbiol. - 1991. - Vol. 57, N 3. - P. 882 - 884.
10. Loessner, M.J. Evaluation of luciferase reporter bacteriophage A511: luxAB for detection of Listeria monocytogenes in contaminated foods / M.J. Loessner, M. Rudolf, S. Scherer // Appl. and Environ. Microbiol. - 1997. - Vol. 63, N 8. - P. 2961 - 2965.
11. Klumpp, J. Listeriaphages: Genomes, evolution, and application / J. Klumpp, M.J Loessner // Bacteriophage. - 2013, 3:3, e26861.
12. Hagens, S. Phages of Listeria offer novel tools for diagnostics and biocontrol / S. Hagens, M.J. Loessner // Frontiers in Microbiology. - 2014. - V. 5, Article 159.
13. Clokie, M.R.J. Bacteriophages: methods and protocols, volume 1: isolation, characterization, and interactions / M.R.J. Clokie, A.M. Kropinski, 2009, Humana Press, 301 p.
14. Каттер Э. Бактериофаги: биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Сулаквелидзе; пер. с англ.: коллектив пер.; науч. ред. рус. изд. А.В. Летаров. -Москва: Научный мир, 2012. - 636 с.
15. Золотухин, С.Н. Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий / С.Н. Золотухин // Автореф. дис. ... доктор. биол. наук. - Ульяновск, 2007. - 39 с.
