CC BY
173
/ Е.В. Сафонова. Автореферат дис. ... канд. биол. наук. Владивосток, 2011. - 25 с.
3. Виноградова, Ю.К. Черная книга флоры Средней России: чужеродные виды растений в экосистемах Средней России /Ю.К. Виноградова, С.Р. Майорова, Л.В. Хо-
рун. - М.: ГЕОС, 2009. - 512 с.
4. Raunkiaer Cr. C. The life form of plants and statical plant geography. Oxford: Clatren-don, 1934. - 632 p.
5. Серебряков, И.Г. Экологическая морфология растений /И.Г. Серебряков. - М.: Высшая школа, 1962. - 380 с.
УДК 578.81:579.67
ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ LISTERIA MONOCYTOGENES
МЕТОДОМ ИНДУКЦИИ
Ковалева Елена Николаевна, кандидат биологических наук, доцент*
Васильев Дмитрий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор*
Золотухин Сергей Николаевич, доктор биологических наук, профессор*
Сульдина Екатерина Владимировна, аспирант*
Имамов Марат Амиржанович, аспирант*
Швиденко Инна Григорьевна, доктор медицинских наук, профессор**
*ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина», кафедра микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы 432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1, e-mail: elkov@pochta.ru
** ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ имени В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России, кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии 410012, Саратов, ул. Большая Казачья, 112
Научные исследования проводятся при финансовой поддержке государства в лице Минобрнауки России в рамках реализации федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 годы (соглашение № 8267 от 10.08.2012).
Ключевые слова: Listeria monocytogenes, бактериофаг, пищевое сырье, контаминация.
В статье рассматриваются аспекты контаминации пищевого сырья и продуктов бактериями вида Listeria monocytogenes. В качестве инактивирующего средства предложены бактериофаги и представлена методика их выделения с помощью индуцирующих факторов из лизогенных культур.
Уже более 100 лет известны заболевания людей и животных, обусловленные листериями, но до настоящего периода ли-стериоз остается недостаточно изученным. Данную инфекцию, как на причину пищевой инфекции ранее не обращали внимания, только в 80-х годах двадцатого столетия в ряде высокоразвитых стран мира (США, Великобритания, Швейцария, Франция, Кана-
да) после вспышек в связи с употреблением готовых продуктов, данное заболевание стали рассматривать как пищевую инфекцию [4].
Во многих странах мира приняты государственные системы контроля продуктов питания, несущими риск заражения листе-риями, выработаны стандарты для готовой пищевой продукции с учетом возможности
их реконтаминации при хранении в холодильниках, законодательно закреплена необходимость соблюдения правил и технологических норм в пищевой индустрии, при транспортировке, хранении и реализации продуктов.
В настоящее время актуальна проблема профилактики инфицирования листери-ями кормов и продуктов питания, тем самым обусловлена необходимость ускоренной индикации и идентификации указанных бактерий. Бактериофаги являются простым и надежным инструментом для реализации данной цели [5, 6, 8, 9].
Цели и задачи исследования
Целью работы является разработка схемы выделения бактериофагов бактерий вида L.monocytogenes методом индукции из лизогенных культур.
Для достижения поставленной цели необходимо подобрать оптимальные параметры воздействия индуцирующих факторов на бактериальную клетку и взаимодействия бактериальных клеток и фаговых корпускул, определить рациональный метод очищения фаголизата.
Материалы и методы
В работе использовали тест-штамм бактерий вида L.monocytogenes 766, индикаторный референс-штамм 9-127 (I серотип) из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской ГСХА им. П.А. Столыпина.
Выделение и изучение биологических свойств фагов проводили по методам, предложенным Н.А. Капыриной [2], M.R.J. Clokie, A.M. Kropinski [7], Э.Каттер, А. Сулаквелидзе [3], C.P. Sword, M.J. Pickett [10], Д.А. Викторовым [1].
Результаты исследований
В качестве тест-штамма для оптимизации параметров индукции использовали вирулентный штамм L.monocytogenes - 766 (рис.1), индикаторным служил референс-штамм L.monocytogenes 9-127. В качестве индуцирующего агента использовали ультрафиолетовые лучи (УФ-лучи), источником которых служила ртутно-кварцевая лампа, дающая не менее 90 % излучаемой энергии в виде УФ-лучей с длиной волны 254 нм.
Плотность среды при облучении, время экспозиции и расстояние до источника света варьировали, в ходе эксперимента применялись 3 схемы:
1 схема: 0,5 мл 24-часовой культуры тест-штамма L.monocytogenes наносили сплошным газоном на чашки Петри с мясо-пептонным агаром и подсушивали в термостате при температуре 37°С 15 - 30 минут. Затем на бактериальный газон в чашках воздействовали ультрафиолетовым излучением с длиной волны 254 нм с расстояния 1,0 м в течение 5 минут.
Облученную таким образом чашку инкубировали в термостате 24 ч при температуре 37°С. Через указанный срок, чашку просматривали на наличие бактерий. На поверхности агара наблюдался рост отдельных колоний (рис.2). Затем с помощью шпателя Дригальского растирали выросшую бактериальную массу по поверхности среды до получения однородного слоя, после чего повторно воздействовали УФ-лучами на чашки с тест-штаммом в течение 10 минут и последующем инкубированием в термостате при аналогичных условиях (37°С, 24 ч). На третьем этапе снова растирали бактериальную массу по поверхности агара, проводили облучение в течение 15 минут с расстояния 1,0 м и инкубировали чашки 24 ч при 37 °С.
Затем проводили смыв с поверхности агара мясопептонным бульоном в количестве 5,0 мл, фильтровали полученную суспензию через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм для удаления бактериальных клеток, и переносили суспензию в пустую стерильную пробирку для дальнейших исследований на наличие в ней активных фаговых корпускул. Для этого сначала проводили накопление бактериофага. В пробирку с 4,5 мл мясопептонного бульона добавляли 0,2 мл 18-часовой индикаторной бульонной культуры штамма L.monocytogenes 9-127 и 1,0 мл исследуемой суспензии, инкубировали 24 ч при 37°С, после чего освобождали суспензию от бактериальных клеток фильтрованием и исследовали на наличие фага методом стекающей капли на чашках со сплошным газоном штамма L.monocytogenes 9-127. Посевы ин-
кубировали при 37°С 24 ч. При наличии фага в суспензии на сплошном бактериальном газоне индикаторной культуры должна наблюдаться дорожка лизиса или отдельные негативные колонии бактериофага. В случае отсутствия фага газон на чашках однородный, без признаков выраженного лизиса или задержки роста [1].
2 схема: проводили однократное облучение 4-х часового газона культуры тест-штамма L.monocytogenes - 766, с использованием экспозиции различной продолжительности (с): 20; 40; 60; 120; 180, при этом чашку с газоном помещали на расстоянии 40 см от источника излучения. Облученную таким образом чашку термостатировали при 37°С в течение 24 ч, после чего проводили смыв с поверхности агара мясопептонным бульоном в количестве 5,0 мл, фильтровали полученную суспензию через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм и переносили суспензию в стерильную пробирку. Для накопление бактериофага в пробирку с 4,5 мл мясопептонного бульона добавляли
0,3 мл 18-часовой индикаторной бульонной культуры штамма L.monocytogenes 9-127 и 1,0 мл исследуемой суспензии, инкубировали 24 ч при 37°С, после чего освобождали суспензию от бактериальных клеток фильтрованием. Полученные фильтраты исследовали методом агаровых слоев. Для этого мясопептонный 1,5 % агар разливали в чашки Петри в количестве 25 - 30 мл (первый слой). После застывания среды чашки ставили на 1,5 - 2 часа для подсыхания. В пробирку с 2,5 мл 0,7 % расплавленного и остуженного до температуры 45°С агара вносили 1 мл исследуемого фильтрата и 0,2 мл 18-часовой бульонной культуры штамма L.monocytogenes 9-127. Содержимое пробирок быстро перемешивали, чтобы не произошло застывания агара, и выливали в ту же чашку вторым слоем. После того, как агар принимал плотную консистенцию, посевы ставили в термостат при 37°С.
Контролем служила индикаторная культура референс-штамма бактерий вида L.monocytogenes, засеянная методом агаровых слоев с 1 мл стерильного мясопептон-ного бульона. Учет результатов проводили
Рис. 1 - Контроль 24-х часового бактериального газона из тест-штамма L.monocytogenes - 766
Рис. 2 - Рост отдельных колоний после воздействия на газон УФ-лучей в течение 5 мин, при расстоянии 1 м до источника излучения
через 18 часов инкубирования при температуре 37°С [3, 7].
3 схема: облучению подвергали 4-х часовую бульонную культуру тест-штамма L.monocytogenes - 766, выращенную при 37°С. Перед облучением бактерии разводили в слабощелочном фосфатном буфере (рН-7,6) в отношении 1:100. Разведенную бактериальную взвесь выливали в чашку Петри с таким расчетом, чтобы толщина облучаемого слоя не превышала 2 мм. Чашки с культурой помещали на расстоянии 40 см от источника излучения и облучали с экспозицией (с) - 20; 30; 40; 60. Для более равномерного воздействия УФ-лучей на бактериальные клетки чашки во время облучения периодически покачивали. После облучения 50 мкл культуры вносили в мясо-
Рис. 3 - Дорожки лизиса на сплошном бактериальном газоне индикаторной культуры L.monocytogenes 9-127
пептонный бульон комнатной температуры. Облученные листериозные культуры инкубировали при 22°С в течение 16 часов, после чего полученные лизаты пропускали через бактериальные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм, выдерживали сутки при комнатной температуре, а затем исследовали на присутствие в них бактериофага. Во время облучения, с целью предохранения обработанных культур от фотореактивации, все манипуляции проводили в затемненном помещении. Выявление индуцированных фагов проводили методом «стекающей капли» с индикаторным штаммом L.monocytogenes 9-127. Учет результатов осуществляли после 24-х часового инкубирования в термостате при 37°С (рис.3). Присутствие бактериофага, определяли по наличию прозрачных пятен, хорошо видимых на матовом фоне глубинного роста бактерий [2, 10].
Выводы. В результате проведенных исследований выделен бактериофаг бактерий вида L.monocytogenes, разработана оптимальная схема выделения листериоз-ного бактериофага методом индукции УФ-лучами. Экспериментально установлено, что для облучения наилучшим образом подходит жидкая слабощелочная среда, время экспозиции - 30 с, расстояние до источника излучения - 40 см.
Библиографический список
1. Викторов, Д.А. Выделение бактериофагов бактерий Pseudomonas putida и их се-
лекция в целях создания биопрепарата для диагностики псевдомоноза рыб / Д.А. Васильев, Д.А. Викторов, И.И. Богданов // Естественные и технические науки. - 2011. - № 2 (52). - С. 79 - 82.
2. Капырина, Н.А. Изучение листериоз-ного бактериофага и использование его для идентификации возбудителя болезни / Н.А. Капырина // Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Покров, 1973. - 22 с.
3. Каттер Э. Бактериофаги : биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Сулаквелидзе; пер. с англ.: коллектив пер.; науч. ред. рус. изд. А.В. Летаров. - Москва: Научный мир, 2012. - 636 с.
4. Листерии и листериоз / И.А. Бакулов, Д.А. Васильев, Д.В. Колбасов [и др.] // монография. - Ульяновск, УГСХА, 2008. - 168 с.
5. Bacteriophage P100 for control of Listeria monocytogenes in foods: genome sequence, bioinformatic analyses, oral toxicity study, and application / R.M. Carlton, W.H. Noordman, B. Biswas [et al.] / Regulatory Toxicology and Pharmacology. - 2005. - 43. - P. 301 - 312.
6. Biocontrol of Listeria monocytogenes on fresh-cut produce by treatment with lytic bacteriophages and a bacteriocin / B. Lever-entz, W.S. Conway, M.J. Camp [et al.] // Appl. and Environ. Microbiol. - 2003. - 69, № 8. - P. 4519 - 4526.
7. Clokie, M.R.J. Bacteriophages: methods and protocols, volume 1: isolation, characterization, and interactions / M.R.J. Clokie, A.M. Kropinski, 2009, Humana Press, 301 p.
8. Guenther, S. Bacteriophage biocontrol of Listeria monocytogenes on soft ripened white mold and red-smear cheeses / S. Guenther, M.J. Loessner // Bacteriophage: Landes Bioscience. - 2011. - P. 94 - 100.
9. Loessner, M.J. Bacteriophage typing of Listeria species / M.J. Loessner, M. Busse // Appl. and Environ. Microbiol. - 1990. - 56, №
6. - P. 1912 - 1918.
10. Sword, C.P. The isolation and characterization of bacteriophages from Listeria monocytogenes / C.P. Sword, M.J. Pickett // J. gen. Microbial. - 1961. - 25, № 2. - P. 241 -248.
