CC BY
101
ФИТОПАТОЛОГИЯ
К ИДЕНТИФИКАЦИИ GROSMANNIA AOSHIMAE - СПЕЦИФИЧНОГО ГРИБНОГО АССОЦИАНТА УССУРИЙСКОГО ПОЛИГРАФА
Н.В. ПАШЕНОВА, с.н.с. Института леса им.В.Н.Сукачева СО РАН, канд.биол.наук,
ЮН. БАРАНЧИКОВ, зав.лаб. Института леса им.В.Н.Сукачева СО РАН, канд.биол.наук
[email protected], [email protected]
Офиостомовые грибы, связанные в своей жизнедеятельности с агрессивными видами короедов, часто демонстрируют фитопатогенные свойства и, как считается, могут участвовать в заселении деревьев насекомы-ми-переносчиками Уссурийский полиграф Polygraphus proximus Blandford (Coleoptera, Curculionidae, Scolytinae), активно изучаемый в настоящее время дальневосточный вид, чье ин-вазийное продвижение на запад повлекло масштабные повреждения пихтовых лесов в Сибири [1], переносит несколько видов офиостомовых грибов. В работах японских исследователей приведены сведения об 11 грибах, обнаруженных в ходах полиграфа на разных видах пихт в северных районах Японии [9]. Следует отметить, что не все обнаруженные грибы являлись специфическими ассоциантами полиграфа, поскольку могли распространяться и другими вредителями пихт: Cryphalus montanus Nobuchi, Dryocoetes hectographus Reitter, D. autographus (Ratzeburg) и D.striatus Eggers [9]. Но гриб Grosmannia (Ophiostoma) aoshimae Ohtaka & Masuya демонстрирует наиболее тесную связь именно с уссурийским полиграфом и претендует на роль постоянного и специфичного ассоци-анта этого вредителя [7].
Описывая данный гриб в 2006 г., японские исследователи отмечали, что его морфология и экология во многом совпадают с характеристиками гриба Ceratocystispolygrapha, обнаруженного доктором К. Аошима (K. Aoshima) еще в 1965 г. С учетом этого и общепринятых на тот момент воззрений на систематику офиостомовых грибов для нового вида было предложено название Ophiostoma aoshimae Ohtaka & Masuya [7]. В том же году были опубликованы результаты молекулярно-генетического анализа большой группы офиостомовых грибов, которые дали основание для выделения самостоятельного рода Grosmannia Goid., объединившего виды рода
Ophiostoma Syd. & P. Syd. с конидиеносцами Leptographium-типа [10]. При описании гриба
O. aoshimae в 2006 г. конидиальное спороношение (анаморфа) не было обнаружено. Но, отнеся новый вид к роду Ophiostoma, авторы уже в тот период, по данным генетического анализа, отмечали его близость к офиостомо-вым грибам с анаморфой Leptographium-типа [7]. На этом основании описываемый гриб недавно был переведен в род Grosmannia с названием Grosmannia aoshimae (Ohtaka & Masuya) Masuya & Yamaoka [6], что почти совпало по времени с обнаружением анаморф Leptographium-типа в его сибирских культурах [4].
Изолированные в Японии культуры G. aoshimae (под условным названием Ophiostoma sp. B) продемонстрировали сравнительно высокую вирулентность для пихты Вича (Abies veitchii Lindl.) , сравнимую с таковой грибов O. subalpinum и O. europhioides. Эти три вида не только вызывали некрозы флоэмы ствола (рис. 1А), но были способны проникать в заболонь, нарушая ее проводимость, что значительно усиливало повреждающее воздействие на растение и делало его гибель необратимой [9]. Массовое усыхание пихты в сибирских очагах уссурийского полиграфа заставляет с вниманием отнестись к
G. aoshimae специфичному ассоцианту данного вредителя.
Изучение взаимоотношений офиосто-мовых грибов, распространяемых короедами, с окружающими организмами (растение-хозяин, насекомое-переносчик, микроорганизмы из ходов вредителя и проч.), прежде всего, требует их изолирования в чистую культуру. Чистота культуры подтверждается соответствующими морфологическими признаками, а в последние годы и генетическими исследованиями. Изучение сибирских изолятов G. aoshimae в течение последних лет показало,
106
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 6/2013
ФИТОПАТОЛОГИЯ
что описание, опубликованное японскими исследователями [7], не отражает некоторые особенности морфологии этого гриба. Это может привести к ошибкам при изолировании и идентификации данного вида, что, к сожалению, уже имело место в недавней отечественной публикации [2]. В настоящей работе на примере сибирских изолятов мы охарактеризуем некоторые культурально-морфологические признаки гриба G. aoshimae, важные для его правильной идентификации.
Образцы для изолирования чистых культур гриба G. aoshimae собирали в разнотравных пихтарниках Козульского района Красноярского края, в очагах массового размножения уссурийского полиграфа. Образцы, собранные на заселенных короедом деревьях, были представлены высечками луба и подстилающего слоя древесины, содержащими ходы отдельных семей полиграфа. При изучении офиостомовых грибов, связанных с короедом, использовали метод прямого наблюдения за развитием грибных структур в образцах растительной ткани, помещенных во влажные камеры. Учет грибных структур, развивающихся в ходах полиграфа и прилегающих к ним растительных тканях, выполняли еженедельно в течение 1 месяца, используя стереоскопический микроскоп МБС-9. Для изучения микроморфологических характеристик грибов готовили препараты «раздавленная капля» и исследовали их с применением светового микроскопа Микмед-2, снабженного фазово-контрастным устройством КФ-4М и цифровой видеокамерой DCM 510 с программным обеспечением для фотографирования и измерения микрообъектов. Идентификацию гриба выполняли на основании культуральных и морфологических признаков [7]. Изолирование чистых культур проводили путем переноса аскоспор и конидий на стерильную плотную питательную среду.
В качестве основной среды для изолирования, культивирования и поддержания чистых культур использовали агаризирован-ное неохмеленное пивное сусло (СА), разбавленное до концентрации сахаров - 2 градуса по Баллингу. При изолировании для подавления роста бактерий и ограничения роста не-
совершенных грибов сусло-агар подкисляли молочной кислотой (4 мл/л среды). Кроме сусло-агара для культивирования изолятов использовали среду с водным экстрактом луба пихты сибирской (СПЛА) [3] и, в некоторых случаях, водный агар (ВА) - 15 г агара на 1 л водопроводной воды. Чистые культуры выращивали при температуре 20-24 °С. Скорость роста мицелия оценивали по разнице длины радиусов колонии, измеренных с интервалом в сутки.
Замеры микроморфологических
структур гриба и скорости роста на плотных питательных средах выполняли в 30-50 и 5 повторностях, соответственно.
Сибирские культуры G. aoshimae, изолированные из луба и древесины пихт, поврежденных P. proximus, образовывали достаточно крупные перитеции, достигающие размера 1-1,5 мм и различимые невооруженным глазом (рис. 1 Б, В). Стандартные идентификационные параметры плодовых тел сибирских и японских культур показали большое сходство (таблица). Плодовые тела развивались на поверхности субстрата (луб, агаровая среда) или могли быть полу- или полностью погруженными в него. Остиоляр-ные гифы, окружающие у некоторых видов офиостомовых выводное отверстие на вершине перитециальной шейки, отсутствовали (рис. 1 Г). Шейки перитециев, образующихся в природе и в лабораторных условиях, были покрыты многочисленными выростами (projections) (рис. 2), которые авторы вида упоминают в качестве специфического признака G. aoshimae [7].
Аскоспоры, появляющиеся в виде слизистой капли на вершине созревших перитециев, имели овально-вытянутую форму и были окружены тонкой желатинозной оболочкой (рис. 1 Е ).
При росте на агаровых средах колонии гриба имели окраску от буро-коричневой до оливково-темной. Однако при изолировании культур из растительных тканей иногда наблюдалось развитие серовато-белых колоний (рис. 1 Д). Появление светлоокрашенных колоний наблюдали и в чистых культурах, которые поддерживали в лабораторных услови-
ЛЕСНОИ ВЕСТНИК 6/2013
107
ФИТОПАТОЛОГИЯ
Таблица
Сравнение культурально-морфологических признаков культур Grosmannia aoshimae из Сибири и Японии
Признаки Происхождение культур
Сибирь [4] Япония [8]
Перитеции: - диаметр основания (мкм) - длина шейки (мкм) - диаметр шейки - у основания (мкм) - у вершины (мкм) - остиолярные гифы - выступы на поверхности шейки - аскоспоры - размеры (мкм) - форма 165-319 429-1055 33-55 22-44 Нет Есть 2,7-4,3 x 1,2-2,0 Овально-вытянутая 155-275 300-820 45-80 20-50 Нет Есть 2,5-4,5 x 1,2-2,4 Овальная до овально- вытянутой
Конидиальное спороношение Leptographium-типа Не обнаружено
Цвет колоний на сусло-агаре и солодовом агаре, соответственно Темно-коричневый Коричневый до темно-оливкового
ях более года и неоднократно пересевали на свежую среду. В старых культурах (возраст более 1 месяца) на агаровых средах иногда появлялись пятна светлоокрашенного мицелия, развивающегося поверх темного воздушного мицелия (рис. 1 Д). Скорость роста мицелия по поверхности агаровых сред варьировала у разных культур в пределах 4,3-6,0 мм/сут (СА), 4,0-4,7 мм/сут (среда СПЛА). В лабораторных условиях на агаровых средах перитеции начинали формироваться через
3-4 недели культивирования, но способность к плодоношению наблюдали не у всех полученных культур.
При осмотре уже развившихся (возраст от 7 до 14 суток) колоний разных изо-лятов на СА конидиальное спороношение не было выявлено, но в микроскопических препаратах наблюдали небольшое количество неокрашенных конидий каплевидной, яйцевидной, грушевидной или булавовидной форм (рис. 1 И). Данные конидии формировались терминально на концах гиф или на простых конидиеносцах шиловидной формы, одиночных, перпендикулярно расположенных на несущей гифе, или в группах, напоминающих кисточку (рис. 1 Ж, З). На СА простые конидиеносцы встречались нечасто, но иногда наблюдали их скопления. На среде СПЛА у молодых культур (возраст 5-10 су-
ток) увеличивалась интенсивность формирования простых шиловидных конидиеносцев, одиночных и в группах.
Кроме простых конидиеносцев в сибирских культурах были обнаружены кониди-еносцы, состоящие из темноокрашенной ножки и неокрашенной верхушечной кисточки, на которой формировались конидии, склеенные слизью в головки (рис. 1 Л, М). Подобная морфология конидиеносцев является характерной для Leptographium-типа. Хотя следует отметить, что в сибирских культурах конидиеносцы часто имели недоразвитый и неупорядоченный вид (рис. 1 К), в сравнении с анаморфами других видов рода Grosmannia [5].
У сибирских культур G. aoshimae формирование Leptographium-конидиеносцев не являлось признаком стабильным и типичным для всех культур. Впервые данные конидие-носцы были обнаружены при посеве шпателем суспензии аскоспор на водный агар. В этом случае формирование Leptographium-конидиеносцев было скудным и наблюдалось не у всех изолятов. Проявляясь в начале развития колонии (3-5 сутки), Leptographium-конидиеносцы со временем исчезали или, может быть, маскировались воздушным мицелием. Культивирование G. aoshimae на среде СПЛА, содержащей, наряду с разбавленным суслом, водный экстракт луба пих-
108
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 6/2013
ФИТОПАТОЛОГИЯ
Рис. 1. Морфология гриба G. aoshimae. А - некроз флоэмы вокруг места втачивания уссурийского полиграфа; Б,В
- перитеции G. aoshimae; Г - вершина шейки зрелого перитеция с каплей аскоспор; Д - светлая (слева) и темноокрашенные (центр и справа) колонии G. aoshimae на сусло-агаре, возраст 30 сут; Е - аскоспоры; Ж,З
- формирование конидий на гифах и шиловидном конидиеносце, соответственно; И - конидии; К - вершина Leptographium-конидиеносца с неупорядоченным строением; Л,М - Leptographium-конидиеносцы G. aoshimae. Линии в нижнем правом углу соответствуют: 500 мкм - Б,В, 10 мкм - Г,К,Л,М, 5 мкм - Е,Ж,З,И
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 6/2013
109
ФИТОПАТОЛОГИЯ
ты сибирской, показало, что в этих условиях Leptographium-конидиеносцы не только формировались у некоторых изолятов, но и сохранялись на протяжении 2-х месяцев роста, хотя и не были обильны.
Впоследствии было отмечено, что Leptographium-конидиеносцы могли развиться на кусочках свежего луба пихты сибирской, помещенного на поверхность
3-4 недельных колоний G. aoshimae на сусло-агаре. И, наоборот, перенос на питательную среду конидиальной массы с вершины Leptographium-конидиеносцев, развившихся в образцах, собранных в природе и помещенных во влажные камеры, нередко давал колонии G. aoshimae. Случайное загрязнение аскоспорами G. aoshimae в данном случае исключалось, поскольку отбор конидиальной массы с вершин конидиеносцев контролировали визуально с помощью стереоскопического микроскопа МБС-9, следя, чтобы вблизи Leptographium-конидиеносцев перитеции G. aoshimae либо отсутствовали, либо не достигли стадии зрелых аскоспор.
В целом, культурально-морфологические особенности гриба, доминирующего по обилию и частоте встречаемости среди офи-
Рис. 2. Фрагмент шейки перитеция G. aoshimae с многочисленными выступами на боковой поверхности. Линия в нижнем правом углу соответствует 10 мкм
остомовых грибов-асоциантов P. proximus в Сибири, проявили большое сходство с известным видом Grosmannia (Ophiostoma) aoshimae [6,7]. Предварительные результаты генетического анализа, полученные в лаборатории д-ра С. Вудворта (Абердин, Великобритания), совпали с информацией в ГенБанке [8] и подтвердили принадлежность сибирских культур к виду G. aoshimae (S.Woodward, личное сообщение). Единственным существенным отличием сибирских культур G. aoshimae от японских являлось наличие у первых Leptographium-подобных конидиеносцев. Недавний «перевод» гриба из рода Ophiostoma в род Grosmannia полностью соответствует данной морфологической характеристике, поскольку Leptographium-анаморфа является доминирующим типом конидиального спороношения у грибов рода Grosmannia [10].
Обильное конидиальное спороношение, представле нное микроскопиче скими конидиеносцами Sporothrix-типа и полумикроскопическими коремиальными конидиеносцами Pesotum-типа, которое было отмечено Ю.И. Гниненко и соавторами в культурах, определенных ими как O. aoshimae из европейской части России [2], не соответствует как нашим наблюдениям за сибирскими культурами G. aoshimae, так и зарубежным источникам:
1) Сомнение в правильности определения вызывает обилие конидиогенных структур, упомянутое в указанной работе. Сибирские культуры G. aoshimae, как было указано выше, при росте на агаризированных средах демонстрировали конидиальное спороношение от скудного до умеренного, а японские исследователи - авторы вида, вообще не обнаружили анаморфу у данного гриба [7].
2) В сибирских чистых культурах, чья принадлежность к виду G. aoshimae, подтверждена молекулярным анализом, было обнаружено только два типа конидиального спороношения: на мицелии или шиловидных простых конидиеносцах и на кониденосцах Leptographium-типа. Конидиальные спороношения Sporothrix- и Pesotum-типов не были обнаружены [4].
3) Согласно современным воззрениям на систематику офиостомовых грибов, призна-
110
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 6/2013
ФИТОПАТОЛОГИЯ
ваемую большинством работающих в этой области специалистов, сочетание конидиеносцев Sporothrix- и Pesotum-типов является типичным для грибов собственно рода Ophiostoma, объединяющего виды, оставшиеся после выделения самостоятельных родов Ceratocystiopsis
H.P Upadhyay & W.B. Kendr. и Grosmannia [10]. Следует отметить, что среди представителей рода Grosmannia, наряду с безусловно преобладающим Leptographium-типом анаморфы, известны единичные виды-исключения, формирующие коремиальные Pesotum-конидиеносцы. Однако виды, сочетающие на стадии анаморфы три типа конидиеносцев (Sporothrix, Pesotum и Leptographium), в пределах рода Grosmannia пока неизвестны [10].
Учитывая эти несоответствия, а также то, что видовая принадлежность культур, изолированных в европейской части России, не подтверждена молекулярными методами [2], следует заключить, что имела место ошибка при изолировании G. aoshimae или, что более вероятно, была изолирована смешанная культура нескольких видов грибов (G. aoshimae + Ophiostoma spp.).
Таким образом, в свете вышеизложенного, в качестве идентификационных признаков G. aoshimae, помимо количественных параметров, можно указать следующие:
- связь гриба с уссурийским полиграфом;
- достаточно крупные перитеции (общий размер - около 1 мм);
- шейка перитеция без остиолярных гиф, но с многочисленными полупрозрачными выступами (projections) на боковой поверхности;
- овально-вытянутая форма аскоспор, окруженных тонкой желатинозной оболочкой;
- конидиальное спороношение на плотных питательных средах от скудного до умеренного, тип конидиеносцев может варьировать от простых, шиловидных (при росте на агаровых средах) до Leptographium-подобных (при росте на агаровых средах и лубе растения-хозяина).
Авторы выражают глубокую признательность докторам С. Вудворту и Э. Сайасоу
за проведение генетического анализа грибных культур. Работа частично поддержана грантом РФФИ № 12-04-00801а и проектом ISEFOR, финансируемым Европейской комиссией.
Библиографический список
1. Баранчиков, Ю.Н. Уссурийский полиграф - новый агрессивный вредитель пихты в Сибири / Ю.Н. Баранчиков, В.М. Петько, С.А. Астапенко, Е.Н.Акулов и др. // Вестник МГУЛ - Лесной вестник, 2011. - № 4 (80). - С. 78-81.
2. Гниненко, Ю.И. Уссурийский короед и пихтовая офиостома - новая угроза пихтовым лесам в Сибири и Европе. Первое обнаружения патогена./ Ю.И. Гниненко, А.М. Жуков, М.С. Клюкин // Защита и карантин растений, 2012. - С. 42-45.
3. Пашенова, Н.В. Взаимоотношения грибов, распространяемых вредителями пихты сибирской, при лабораторном культивировании. / Н.В. Пашенова, Я.И. Лихута // Экологические и экономические последствия инвазий дендрофильных насекомых. Мат. Всеросс. Конф. с международ. Участием, 2527 сентября, г. Красноярск. Красноярск: ИЛ СО РАН, 2012. - С. 75-81.
4. Пашенова, Н.В. Перенос офиостомовых грибов уссурийским полиграфом Polygraphus proximus Blandford (Coleoptera, Scolytidae) в Сибири / Н.В. Пашенова, В.М. Петько, И.А. Керчев, Н.С. Бабичев // Известия СПбЛТА, 2012. - № 200. - С. 114-120.
5. Jacobs K. Leptographium species. / K. Jacobs, M.J. Wingfield - St. Paul, MN: APS PRESS, 2001. 207 p.
6. Masuya H. Ophiostomatoid fungi and their associations with bark beetles in Japan / H. Masuya, Y Yamaoka, M.J. Wingfield // Ophiostomatoid Fungi: Expanding Frontiers (Seifert KA, Wingfield MJ, eds). - Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands. - CBS Biodiversity Series 12. 2013. - P. 79-91.
7. Ohtaka N. Two new Ophiostoma species lacking conidial states isolated from bark beetles and bark beetle-infested Abies species in Japan / N. Ohtaka, H. Masuya, Y. Yamaoka, S. Kaneko. // Can. J. Bot., 2006, 84: 282-293.
8. Sequence Passport GU134162 Grosmannia aoshimae. StrainInfo Beta. 2009. http://www.straininfo.net/ sequences/GU134162
9. Yamaoka Y. Ophiostoma species associated with bark beetles infesting three Abies species in Nikko, Japan / Y. Yamaoka, H. Masuya, N.Ohtaka, H. Goto, S. Kaneko, Y Kuroda // J. For. Res. 2004. № 9. P. 67-74.
10. Zipfel R. D. Multi-gene phylogenies define Ceratocystiopsis and Grosmannia distinct from Ophiostoma / R.D. Zipfel, Z.W. de Beer, K. Jacobs, B.D. Wingfield and M.J. Wingfield // Studies in mycology, 2006, 55: 75-97.
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 6/2013
111
