Изучение связывания l-глугамата с Т-лимфоцитами человека и перитонеальными макрофагами мыши и его влияние на активность этих клеток Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Таблица

Название препарата ИЦ (%) при объёмном содержании препарата в среде

20% 30% 50% 60% 100%

Перфтордекалин 22 19 36

6 МФ-130 8 12 12 15 53

6 МФ-240 9 17 16 17 49

Перфтороктилбромид 8 19 19 36

Перфтор-N-OKraH 4 24 20 24 40

При увеличении концентрации препаратов в культуральной среде от 20% до 50% уровень цитотоксичности изменялся незначительно. При этом “Перфтордекалин” оказывал более выраженное цитотоксическое действие, “Перфтороктилбромид” и “Перфтор-Ы-октан” занимали промежуточное положение. При 100% замещении препаратами культуральной среды ИЦ оказывались существенно более высокими у препаратов “б МФ-130” и “6 МФ-240” по сравнению с остальными.

Таким образом, препараты, содержащие перф-торорганические соединения, оказались нетоксичны или низкотоксичны в отношении фибробластоподоб-ных клеток линии Ь929. Из изученных наилучшие показатели имели “Перфтороктилбромид” и “Перфтор-Ы-октан”. Высокая клеточная гибель (более 40%) наблюдалась лишь в случае 100% замещения препаратами (“6 МФ-130” или “6 МФ-240”) культуральной среды и могла быть связана с дефицитом веществ, необходимых для поддержания жизнеспособности клеток. Ни в одном из случаев ИЦ не принимали отрицательных значений, что, возможно, свидетельствует против усиления пролиферации клеток в присутствии изученных препаратов.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ№97-04-48889.

Изучение связывания 1_-глутамата с Т-лимфоцитами человека и перитонеальными макрофагами мыши и его влияние на активность этих клеток

Нуриева Р.И., Наволоцкая Е.В., Костанян И. А., Малкова Н.В.,ЛипкинВ.М.

Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Пущино, Россия

Известно, что Ь-глутаминовая кислота (Ь-б1и) выполняет ряд важнейших функций в центральной нервной системе: она является основным медиатором возбуждения, участвует в формировании памяти, регулирует рост и развитие нейронов. Действие Ю1и в центральной нервной системе опосредовано глутаматными рецепторами различных типов, которые принято подразделять на ионотропные и метаботропные.

Исследования последних лет свидетельствуют о прямом участии L-Glu и глутаматных рецепторов в функционировании эндокринной и иммунной систем. Так, недавно была обнаружена способность L-Glu и ряда ее структурных аналогов стимулировать секрецию инсулина Р-клетками поджелудочной железы крысы. Одновременно было показано существование на поверхности этих клеток специфических глутаматных рецепторов, близких по своим характеристикам к ионотроп-ным глутаматным рецепторам в центральной нервной системе.

Несколько лет назад было показано, что возрастающие концентрации внеклеточной L-GIu подавляют синтез ДНК в культуре митоген-стимулированных лимфоцитов. Среди изученных в этом тесте агонистов глутаматных рецепторов наиболее сильное ингибирование пролиферации вызывала квискалиновая кислота (квискапат). Было высказано предположение, что антипролиферативное действие L-Glu на лимфоциты может быть опосредовано через глутаматные рецепторы, подобные глутаматным рецепторам центральной нервной системы.

Цель данной работы: изучение связывания L-Glu с Т-лимфоцитами человека и перитонеальными макрофагами мыши и ее влияние на активность этих клеток.

Задача исследования: 1) изучение связывания [!H]L-Glu с Т-лимфоцитами; 2) изучение связывания ['H]L-Glu с макрофагами; 2) изучение влияния L-Glu на адгезию, распластывание макрофагов; 3) влияния L-Glu на фаг оцитоз макрофагами бактерий авирулентното штамма Salmonella typhimurium В 416/71.

Методы исследования: радиолигандный анализ; выделение и культивирование 'Г-лимфоцитов человека in vitro; выделение, культивирование и оценка функциональной активности макрофагов in vitro (жизнеспособность, распластывание и адгезия); изучение фагоцитарной активности макрофагов in vitro.

Основные результаты. Обнаружены и охарактеризованы специфические рецепторы к L-Glu на Т-лимфоци-тах, выделенных из крови здоровых доноров. Установлено, что немеченый агонист глутаматных рецепторов мозга квискапат и немеченые дипегтгиды Ala-G lu, Glu-Ala, Glu-Glu конкурентно ингибируют специфическое связывание [!H]L-Glu с Т-лимфоцитами. С помощью коньюгатов меченой и немеченой L-Glu с декстраном показано, что рецепторы L-Glu локализованы на внешней стороне плазматической мембраны 'Г-лимфоцитов. Таким образом, максимальным сродством к рецепторам обладали L-Glu и квискалат. L-Glu в составе пептидов частично или полностью теряла способность к специфическому связыванию с рецепторами Т-клеток. Для ответа на вопрос о природе выявленных рецепторов Т-лимфоцитов, клетки обрабатывали трипсином до проведения реакции связывания. В результате они теряли способность специфически связывать L-Glu, что свидетельствует в пользу белковой природы участков, связывающих L-Glu.

Установлено, что специфические рецепторы к L-Glu у перитонеальных макрофагов отсутствуют. Показано,

что L-Glu (10''°-10ц М) не влияет на жизнеспособность макрофагов, но, в то же время, снижает их способность к адгезии и распластыванию. При концентрации 1 мкМ L-Glu подавляет переваривающую функцию макрофагов при фагоцитозе авирулентного штамма S. typhimurium В 416/71: к шестому часу фагоцитоза более 45% фагоцитов в монослое было разрушено, в то время как в контроле этот показатель был равен нулю.

Заключение: полученные результаты свидетельствуют об универсальности действия L-глутаминовой кислоты в организме: она является регулятором важнейших функций нервной, эндокринной и иммунной систем.

Влияние полиреашвных антител на адгезию и миграцию клеток in vitro

Петрова Ю.И.

Институт биохимии им А.В.Палпадина НАН Украины Киев, Украина

Полиреактивные антитела (ПАТ), которые способны реагировать с широким спектром как собственных, так и чужеродных антигенов, содержатся в сыворотке нормальных, неиммунизированных животных и человека. Такая реактивность объясняется не только поликлональ-ностью сыворотки. В начале 80-х годов были впервые описаны моноклональные ПАТ. Клетки, синтезирующие ПАТ, часто экспрессируют на поверхности маркер CD5 и составляют значительный процент В-лимфоцитов. Функция ПАТ in vivo все еще не ясна.

Целью данной работы было изучить влияние ПАТ на миграцию как нормальных, так и злокачественных клеток in vitro и определить механизм такого влияния. Скорость миграции клеток определяется силой адгезивных взаимодействий с субстратом, осуществляемых интегринами, составом адгезивных комплексов и внешними сигналами от цитокинов и ростовых факторов. Задачей данной работы было выяснить, какой из перечисленных механизмов регуляции может подвергаться влиянию ПАТ.

Материалы н методы.

1. ПАТ были получены в отделе молекулярной иммунологии института биохимии НАН Украины. Остальные антитела (АТ), используемые в работе, являются коммерческими.

2. Нормальные человеческие фибробласты получали из кусочков кожи и культивировали не более 15 пассажей.

3. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток, фиксированных на слайдах, проводили при помощи РАР-и АРААР-комплексов.

4. Миграцию изучали при помощи фагокинетического метода, адаптированного для 96-луночного планшета. Коллоидное золото получали путем восстановления АиС104. Миграционные треки фотографировали и после сканирования вычисляли миграционные индексы.

5. Адгезию измеряли в динамике. Для каждой временной точки использовали отдельный 96-луночный планшет из бактериологического пластика с сорбированными на нем адгезивными белками. Количество клеток оценивали по включению МТТ.

Основные результаты. ПАТ стимулировали миграцию как нормальных, так и злокачественных клеток в дозо-зависимой манере. Миграция клеток человеческой фибросаркомы НТ1080 на фибронектине в присутствие Г1АТ усиливалась в 4.6 раза, а нормальных человеческих фибробластов — на 20%. ПАТ также усиливали миграцию слабомигрирующих клеток меланомы Бовеса. АТ к фибронектиновому рецептору подавляли миграцию нормальных человеческих фибробластов на 77%. При изучении адгезии клеток было показано, что ПАТ дозозависимо ослабляют адгезию различных типов клеток к фибронектину, коллагену I типа и фибриногену, что, по-видимому, является причиной усиления миграции. ПАТ не препятствовали связыванию интегринов с субстратом, т.к. не влияли на форму и распластывание клетки.

Важным компонентом адгезивного комплекса быстромигрирующих клеток (особенно злокачественных) является рецептор урокиназы. Оказалось, что урокина-за, как и ПАТ, усиливала миграцию НТ1080. Урокиназа, сорбированная на коллагене I типа, ослабляла адгезию клеток к коллагену. В присутствие ПАТ действие урокиназы как на адгезию, так и на миграцию усиливалось.

ПАТ не взаимодействовали с рецептором тромбо-цитарного ростового фактора (PDGF), т.к. оказывали противоположное воздействие на пролиферацию, адгезию и миграцию клеток.

Заключение: ПАТ способны усиливать миграцию клеток in vitro путем ослабления адгезии к субстрату. Т.о., ПАТ MOiyr служить дополнительным регуляторным механизмом при заживлении ран и при других процессах, требующих миграции клеток. В то же время, они могут являться фактором риска при метастазировании опухолей, т.к. уровень ПАТ в крови при некорых видах рака значительно повышен.

Изучение функциональной активности нейтрофилов мышей разного возраста

Плешакова О.В., Рассказова Е. А., Садовников В.Б.

Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякиной Ю.А. Овчинникова РАН Пущино, Московская область, 142292 Россия

Нейтрофилы играют важную роль в неспецифической защите организма от патогенных микроорганизмов, участвуют в противоопухолевом иммунитете. Недавно мы исследовали роль нейтрофилов как источника “рестрикционных протеаз”, участвующих в поддержании иммунологической толерантности [1]. Известно, что с возрастом повышается восприимчивость к инфекционным заболеваниям и частота аутоиммунных заболеваний. В этой связи представляется актуальным изучение изменения активности нейтрофилов при старении. Описанные в литературе