CC BY
24
что L-Glu (10''°-10ц М) не влияет на жизнеспособность макрофагов, но, в то же время, снижает их способность к адгезии и распластыванию. При концентрации 1 мкМ L-Glu подавляет переваривающую функцию макрофагов при фагоцитозе авирулентного штамма S. typhimurium В 416/71: к шестому часу фагоцитоза более 45% фагоцитов в монослое было разрушено, в то время как в контроле этот показатель был равен нулю.
Заключение: полученные результаты свидетельствуют об универсальности действия L-глутаминовой кислоты в организме: она является регулятором важнейших функций нервной, эндокринной и иммунной систем.
Влияние полиреашвных антител на адгезию и миграцию клеток in vitro
Петрова Ю.И.
Институт биохимии им А.В.Папладииа НАН Украины Киев, Украина
Полиреактивные антитела (ПАТ), которые способны реагировать с широким спектром как собственных, так и чужеродных антигенов, содержатся в сыворотке нормальных, неиммунизированных животных и человека. Такая реактивность объясняется не только поликлональ-ностью сыворотки. В начале 80-х годов были впервые описаны моноклональные ПАТ. Клетки, синтезирующие ПАТ, часто экспрессируют на поверхности маркер CD5 и составляют значительный процент В-лимфоцитов. Функция ПАТ in vivo все еще не ясна.
Целью данной работы было изучить влияние ПАТ на миграцию как нормальных, так и злокачественных клеток in vitro и определить механизм такого влияния. Скорость миграции клеток определяется силой адгезивных взаимодействий с субстратом, осуществляемых интегринами, составом адгезивных комплексов и внешними сигналами от цитокинов и ростовых факторов. Задачей данной работы было выяснить, какой из перечисленных механизмов регуляции может подвергаться влиянию ПАТ.
Материалы н методы.
1. ПАТ были получены в отделе молекулярной иммунологии института биохимии НАН Украины. Остальные антитела (АТ), используемые в работе, являются коммерческими.
2. Нормальные человеческие фибробласты получали из кусочков кожи и культивировали не более 15 пассажей.
3. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток, фиксированных на слайдах, проводили при помощи РАР-и АРААР-комплексов.
4. Миграцию изучали при помощи фагокинетического метода, адаптированного для 96-луночного планшета. Коллоидное золото получали путем восстановления AuCI04. Миграционные треки фотографировали и после сканирования вычисляли миграционные индексы.
5. Адгезию измеряли в динамике. Для каждой временной точки использовали отдельный 96-луночный планшет из бактериологического пластика с сорбированными на нем адгезивными белками. Количество клеток оценивали по включению МТТ.
Основные результаты. ПАТ стимулировали миграцию как нормальных, так и злокачественных клеток в дозо-зависимой манере. Миграция клеток человеческой фибросаркомы НТ1080 на фибронектине в присутствие Г1АТ усиливалась в 4.6 раза, а нормальных человеческих фибробластов — на 20%. ПАТ также усиливали миграцию слабомигрирующих клеток меланомы Бовеса. АТ к фибронектиновому рецептору подавляли миграцию нормальных человеческих фибробластов на 77%. При изучении адгезии клеток было показано, что ПАТ дозозависимо ослабляют адгезию различных типов клеток к фибронектину, коллагену I типа и фибриногену, что, по-видимому, является причиной усиления миграции. ПАТ не препятствовали связыванию интегринов с субстратом, т.к. не влияли на форму и распластывание клетки.
Важным компонентом адгезивного комплекса быстромигрирующих клеток (особенно злокачественных) является рецептор урокиназы. Оказалось, что урокина-за, как и ПАТ, усиливала миграцию НТ1080. Урокиназа, сорбированная на коллагене I типа, ослабляла адгезию клеток к коллагену. В присутствие ПАТ действие урокиназы как на адгезию, так и на миграцию усиливалось.
ПАТ не взаимодействовали с рецептором тромбо-цитарного ростового фактора (PDGF), т.к. оказывали противоположное воздействие на пролиферацию, адгезию и миграцию клеток.
Заключение: ПАТ способны усиливать миграцию клеток in vitro путем ослабления адгезии к субстрату. Т.о., ПАТ MOiyr служить дополнительным регуляторным механизмом при заживлении ран и при других процессах, требующих миграции клеток. В то же время, они могут являться фактором риска при метастазировании опухолей, т.к. уровень ПАТ в крови при некорых видах рака значительно повышен.
Изучение функциональной активности нейтрофилов мышей разного возраста
Плешакова О.В., Рассказова Е. А., Садовников В.Б.
Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякиной Ю.А. Овчинникова РАН Пущино, Московская область, 142292 Россия
Нейтрофилы играют важную роль в неспецифической защите организма от патогенных микроорганизмов, участвуют в противоопухолевом иммунитете. Недавно мы исследовали роль нейтрофилов как источника “рестрикционных протеаз”, участвующих в поддержании иммунологической толерантности [1]. Известно, что с возрастом повышается восприимчивость к инфекционным заболеваниям и частота аутоиммунных заболеваний. В этой связи представляется актуальным изучение изменения активности нейтрофилов при старении. Описанные в литературе
исследования проводились на нейтрофилах периферической крови человека, что обусловило высокий разброс и противоречивость данных. Для выяснения причин нарушения защитных механизмов организма необходимо использование линейных животных, содержащихся в стандартных условиях. В данной работе использовали мышей инбредной линии С57В1 (самцы 3-24 мес). НеГпрофилы выделяли из перитонеальной полости по стандартной методике через 6 часов после в/б инъекции зимозана. Продукцию супероксидного анион-радикала оценивали по восстановлению НСТ. В качестве стимулятора использовали РМ А. Протеолитическую активность в клеточных экстрактах и супернатантах активированных нейтрофилов измеряли флуориметрическим методом по расщеплению FITC-меченых белков. Белки подвергали окислительной модификации in vitro в системе аскорбат +железо (III). Уровень окислительных повреждений в них оценивали по содержанию карбонильных групп (реакция с 2,4-ДНФГ). Установлено, что протеазы нейтрофилов лучше расщепляют белки, окисленные в присутствии аскорбата+железо (III), чем их исходные формы. Протеазы, специфичные к окисленным белкам, вероятнее всего, локализованы в гранулах и высвобождаются наружу при активации. Ингибиторный анализ установил их принадлежность к классу сериновых протеаз. Однако растворимые белки печени, выделенные из старых мышей той же линии, были заметно более устойчивы к протеолизу ферментами нейтрофилов, чем белки молодых животных. Гликатированный альбумин также расщеплялся нейтрофилами гораздо хуже своей исходной формы. Общая протеолитическая активность лизатов нейтрофилов и специфичность к окисленным белкам с возрастом не снижалась. Высказывается предположение, что повышение аутореактивности иммунной системы при старении может быть, по крайней мере, частично связано с накоплением неких модификаций (вероятнее всего, продуктов поздних стадий реакции гликатирования) в белках организма, которые делают их недоступными для “рестрикционных” протеаз нейтрофилов. Способность нейтрофилов к активации окислительного взрыва под действием РМА была снижена у старых мышей, что может частично объяснять снижение их бактерицидности при старении. Обнаружено, что уровень окислительных повреждений в белках нейтрофилов, полученных из старых мышей, повышен. По-видимому, НАДФН-оксидаза, ответственная за активацию окислительного метаболизма в этих клетках, является первичной мишенью свободных радикалов, образующихся в старом организме с повышенной скоростью [2], поскольку она расположена в плазматической мембране. Локализация протеаз в гранулах, в условиях относительной изоляции от оксидантов, препятствует их инактивации даже у старых животных.
1. Lefkovits, I., Frey, J.R., Kuhn, L., Sadovnikov, V.B., Pleshakova, O.V., and Sukharev, S.A. (1997) J. Immunol., vol. 158, no. 10,4908—4915.
2. Ames, B.N., Shigenaga, M.K., and Hagen, T.M. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 90,7915 - 7922.
Исследование нитроксидергических процессов при иммунокорригирующей терапии
Ратников В.И., Рассохина Л.М., Важенина З.П., Ратников К.В., Тренина Е.А.
Челябинская Государственная медицинская академия Россия
Выяснение важной роли системы “Ь-аргинин - азота оксид” в регуляции физиологических функций организма, в том числе иммунных реакций и механизмов неспецифической защиты, определяет необходимость изучения и учета характера изменений нитроксидергических процессов при проведении медикаментозной, и в частности, иммунокорригирующей терапии. В этой связи целью настоящего исследования явилась оценка влияния широкого круга препаратов (антинитроксидергические, глюкокортикоидные и антиглюкокортикоидные средства, иммуностимулятор бемитил, антибиотик тиенам) на генерацию оксида азота при назначении в условиях нормальной и измененной иммунологической реактивности. Об уровне продукции оксида азота судили по суммарному содержанию в крови его стабильных конечных метаболитов — нитратов и нитритов, фотометрическое определение которых осуществляли по реакции Грисса.
Установлено, что препараты с антинитроксидерги-ческой активностью, уменьшающие образование оксида азота либо блокирующие его эффекты на уровне гу-анилатциклазы, существенно продлевали сроки функционирования трансплантатов у мышей С57В1, которым пересаживали полнослойные кожные лоскуты от мышей СВА. Этот эффект сохранялся и при комбинированном применении указанных средств с классическими иммунодепрессантами — в частности, с глюкокортико-идами, что позволило оптимизировать схемы применения последних и дало возможность уменьшить дозы и побочные эффекты при сохранении терапевтической эффективности. В свою очередь, глюкокортикоиды (гидрокортизон в дозах 10-50 мг/кг) мало изменяли базальную продукцию азота оксида и существенно снижали активность нитроксидергических процессов на фоне стимуляции липополисахаридом. Нарушение генерации азота оксида под влиянием глюкокортико идо в предотвращалось назначением их рецепторного антагониста — препарата 486 (мифепристона) в дозах 10-50 мг/кг.
Существенное влияние на функционирование системы “Ь-аргинин - азота оксид” выявлено у тиенама — бета-лактамного антибиотика группы карбапенемов. При введении интактным мышам препарат снижал уровень стабильных метаболитов оксида азота, причем выраженность эффекта зависела от дозы.
В клинических исследованиях показано, что интенсивные методы лучевой терапии онкологических больных, при воздействии суммарной очаговой дозы 16-20 Грей, приводят к изменению выраженности нитроксидергических процессов и у части пациентов вызывают тяже-
