CC BY
10
В. Г. ГЕЙМБЕРГ и Д. В. КИССИНА
Изучение серологических свойств грибков Fusarium, выделенных из перезимовавших под снегом злаков
Из сектора пищевой гигиены Института питания Академии медицинских наук СССР
Попытки применить серологические методы для типизации патогенных и некоторых сапрофитных грибков предпринимались неоднократно. Серологические методы разрабатывались ддя диагностики грибковых! заболеваний, для определения примеси грибков к пищевым продуктам. По этим вопросам имеется довольно обширная литература как у нас, так и за рубежом.
Однако в то время как серологические методы в большинстве случаев дают возможность различать бактерии более тонко, чем культу-ральные, у грибов, повидимому, серологические группы обнимают куль-турально различные типы.
Цель нашей работы — установить, имеется ли различие в антигенной структуре между токсичными и нетоксичными штаммами Fusarium, попытаться применить серологические реакции для определения токсического зерна и проверить, возникают ли в крови переболевших алиментарно-токсической алейкией, а также в крови экспериментальных животных, кормленных токсическим зерном, антитела к грибковым антигенам. При получении положительных результатов это могло бы дать некоторое указание на природу токсического начала в грибке.
Приступая к настоящей работе, мы имели в своем распоряжении штаммы грибка Fusarium, выделенные из перезимовавшего зерна, полученного с опытного поля Института питания (1944—1945). Токсичность всех этих штаммов была проверена методом кожной реакции на кроликах. Среди них были сильно токсичные, слабо токсичные и нетоксичные штаммы. Кроме того, нами были получены два токсичных штамма — Fusarium рое и Fusarium sporotrichioides — от т. Билай (Киев). Ю. И. Рубинштейн предоставила нам штамм Fusarium sporotrichioides, специфичная токсичность которого была установлена ею в опытах на животных (кошки, обезьяны). От нее же мы получили сыворотки 3 обезьян, которых кормили зерном, зараженным токсичным грибком, и сыворотки 4 больных алименуарно-токсической алейкией, привезенные экспедицией Института питания в 1947 г. Мы получили также от проф. Смородинцева две сыворотки переболевших алиментарно-токсической алейкией.
Для изготовления специфических антигрибковых сывороток в качестве антигена мы использовали тщательно растертую пленку грибка, выращенного на синтетической среде. Эта среда состояла только из неорганических солей и глюкозы и была нами избрана, чтобы исключить из антигена чужеродный белок, который мог бы внести путаницу в наши исследования. Антиген вводился кроликам подкожно в нарастающих дозах с 4—5-дневными интервалами между инъекциями. После 9 инъекций (через 2 месяца от начала иммунизации) были получены сыворотки, дающие преципитацию с гомологичными антигенами.
Таким образом, были получены две серии антисывороток путем иммунизации 8 штаммами грибков (четырьмя нетоксичными и четырьмя токсичными). В качестве тест-антигенов при постановке серологических реакций были использованы жидкая культура грибка на синтетической среде (5—10% NaCl) и водно-солевые вытяжки из мицелия грибка. Сыворотки имели невысокие титры — не больше 1 : 300 (разведение антигена).
В качестве тест-реакций нами были использованы реакция преципи-
тации, реакция адсорбции преципитинов и реакция связывания комплемента. При серологических работах с грибками возможность применения реакции агглютинации ограничена. Нам ее применить не удалось.
Реакция преципитации. Для постановки реакции преципитации сыворотки разводились 1:2 и 1:4 физиологическим раствором. Жидкая культура в качестве антигена применялась в разведении 1 :4. Белковые антигены (водно-солевые вытяжки из пленки грибка) брались в разведении 1 : 10 и выше. Реакция ставилась при комнатной температуре, а читалась через 10—15 минут и через 3 часа. Для исключения неспецифических реакций все антигены предварительно сверялись с несколькими нормальными кроличьими сыворотками.
В табл. 1 1 приведены результаты перекрестной реакции преципитации сывороток первой серии. В качестве антигена использована жидкая культура грибка на синтетической среде. В этом опыте выявляется тенденция к разделению штаммов на две группы: группу нетоксичных штаммов — № 573, 542 и 558 и группу токсичных штаммов — № 1, 415 и 420.
Таблица 1
№ сыворотки
№ антигена Т X—ч 1 Ч I ■ч 1 4- Нормальная кроличья
ОО 1— ю о. ю о сч •Ч" сыворотка
573 (-) + + + 4 + + + — + —
542 (-) -+- + + + + + + — +
558 (—) — — + + —
1 (++ + ) — — — + + + + + +
415 (+++) — . — — + + + + + +
420 (+ + +) — — — + + + 4- + + —
Сыворотки против токсичных штаммов дают групповые реакции, но; преципитация с гетерологическими антигенами слабее.
Аналогичные данные были получены с сыворотками второй серии. Однако количество групповых реакций с повышением титра сывороток увеличивается (табл. 2).
С белковыми антигенами (водно-солевыми вытяжками из пленки-грибка) были поставлены перекрестные реакции преципитации в разведениях до титра. Средний титр преципитации сывороток нетоксичных штаммов с тремя антигенами нетоксичных же штаммов равнялся: для сыворотки № 558 — 1 : 160; № 573 — 1 : 70; № 525 — 1 : 50. Эти же сыворотки с антигенами токсичных штаммов дали соответственно титры: 1:10, 1 :8 и 1:2. Таким образом, разница определяется в 17, 10 и 25 раз.
Сыворотки против токсичных штаммов имели больше групповых антител. Титры реакции преципитации этих сывороток с гомологичными антигенами (токсичными) равнялись: № 1 — 1 : 45; № 804 — 1 : 20; № 420 — 1 : 80. Титры с гетерологичными (нетоксичными): № 1 — 1 : 10;. № 804 — 1 : 10; № 420 — 1 : 30. Разница только в 2—4 раза.
1 В табл. 1 и во всех остальных таблицах введены следующие условные обозначения: (—) нетоксичные штаммы или сыворотки против нетоксичных штаммов: (+++) резко токсичные штаммы или сыворотки нротив токсичных штаммов.
№ антигена Сыворотки против токсичных штаммов Сыворотки против нетоксичных штаммов
1 <+++) 804 (-НЧ-)1 420 (-|—1—(-) 558 (—) 573 (-) 525 (-)
!(+ + +) 804 ( + + + ) 420 ( Н—1—) 415 (+ + + ) 1:40 1:40 1:20 1:80 1:40 1:20 1:20 1:10 1:80 1:40 1:80 0 1:80 1:10 1:80 j 0 0 1:20 1:10 0 0 0 0 1:10
Средний титр с антигенами токсичных штаммов 1:45 1:42 1:80 1:10 1:8 1:2
558 (-) 573 (-) 525 (-) 1:10 1:20 0 1:10 1:20 0 1:40 1:40 1:10 1:200 1:200 1:10 1:80 1:100 1:40 1:40 1:80 1:40
Средний титр с антигенами нетоксичных штаммов 1:10 1:10 1:30 1:160 1:70 1:50
При постановке реакции преципитации антифузариозных сывороток с антигенами 40 культур Fusarium (токсичных и нетоксичных) выявилось следующее: антисыворотки против нетоксичных штаммов преципи-тировали lOOVa антигенов, приготовленных из нетоксичных штаммов, и около 30—40°/о антигенов токсичных штаммов. Две антисыворотки токсичных штаммов дали обратную картину. Они преципитировали 100% антигенов из токсичных культур и около 40%и из нетоксичных. Однако две другие сыворотки против токсичных штаммов дали положительную реакцию преципитации со всеми антигенами как из токсичных, так и из нетоксичных культур, хотя реакция с гомологичными антигенами была выражена резче.
При попытке получить реакцию преципитации антифузариозных сывороток с антигенами, приготовленными из грибков Aspergillus, Clado-sporium, Alternaria и др., мы неизменно получали отрицательные результаты.
Анализируя данные, полученные при постановке реакции преципитации, мы можем отметить выраженную тенденцию к серологической группировке токсичных и нетоксичных штаммов, которая выявляется более отчетливо при сопоставлении перекрестных реакций. Отмечена большая поливалентность сывороток, приготовленных против токсичных штаммов. Некоторые сыворотки преципитировали 100% антигенов как из токсичных, так и нетоксичных штаммов. Сыворотки против нетоксичных штаммов дают меньше групповых реакций. Для повышения специфичности реакций мы пытались применить антигены, приготовленные по методу Буавена, предложенному им для выделения полного антигена из бактерий. Однако в небольших разведениях мы получали неспецифические реакции с нормальной кроличьей сывороткой, а в высоких разведениях не было реакции ни с нормальной, ни с гомологичной сывороткой. Этот метод получения антигенов из грибков Fusarium не дал никаких результатов.
Реакция адсорбции преципитинов. При изучении серологических взаимоотношений грибков в ряде работ с успехом использовалась реакция адсорбции преципитинов. Однако при работе с жидки-
ми неконцентрированными антигенами эта реакция не может быть использована широко, так как не всегда можно добиться полной адсорбции преципитинов в пределах разведений сывороток, допускаемых титрами. В табл. 3 представлены некоторые опыты, в которых нам удалось полностью удалить преципитины из сывороток.
Таблица 3
№ антигена Сыворотка № 573 (—) Сыворотка № 420 ( + + +)
до адсорбции адсорбированная штаммом № 558 (—) адсорбированная штаммом № 415 (4 + +) до адсорбции адсорбированная штаммом № 573 (—) адсорбированная штаммом № 415 | (4- 4- + ) ]
573 (-) + + 542 (-) + 4 j 558 (-) ; + + I 1 V + + + 4-+ + + + ± —
1 415 (-1 420 (Н -н -н Ь) -) Ь) + " у - 1 4- + ! + 4-4- + I 4-4- + 4- 1 + 1- | 14 1 1
Сыворотка № 573 (—) до истощения дает реакцию преципитации со всеми нетоксичными антигенами и с антигеном из токсичного штамма № 415 (+ ++). Антиген № 558 при насыщении сыворотки № 573 полностью удаляет из нее все преципитины. Адсорбированная штаммом Л"? 558 сыворотка не дает реакции ни с одним антигеном, в том числе и гомологичным. Антиген № 415 извлекает из сыворотки № 573 преци-питипы только по отношению к своему штамму. Сыворотка против токсичного штамма № 420 до истощения дает реакцию со всеми шестью используемыми антигенами. Антиген № 573 удаляет из сыворотки № 420 преципитины для всех антигенов из нетоксичных культур. Сыворотка № 420 после насыщения антигеном № 573 перестает преципитировать с антигенами № 573, 542 и 558, но дает преципитацию с антигенами № 1, 415 и 420. Антиген № 415 полностью адсорбирует из сыворотки № 420 все преципитины. Сыворотка № 420 после адсорбции этим штаммом не дает реакции преципитации ни с одним антигеном, кроме гомологичного, по отношению к которому сохраняется сомнительная (-1—) реакция.
Гаким образом, на основании опытов адсорбции преципитинов мы можем отметить наличие качественного различия в антигенной структуре токсичных и нетоксичных грибков типа Fusarium.
Реакция связывания комплемента применялась рядом исследователей для обнаружения комплементсвязывающих антител в крови людей при различных грибковых заболеваниях. При серологической классификации грибков эта реакция нашла лишь ограниченное применение, так как грибковые антигены часто проявляют антикомплементарные свойства в пределах разведений, допускаемых их титрами (Шарп). Мы в нашей работе столкнулись с аналогичными затруднениями. Как антигены, так и некоторые антифузариозные сыворотки проявляли антикомплементарные свойства. Однако мы не отказались от попытки применить реакцию связывания комплемента в нашей работе. Чтобы избежать указанных затруднений, мы до постановки основного опыта подтитройывали комплемент в присутствии антигена и отдельно в присутствии сыворотки. Реакция ставилась холодным методом. Кроме
Л4
контролей на антикомплементарные и гемолитические свойства ингредиентов, ставились дополнительно следующие контроли: 1) среда до посева + испытуемая сыворотка; 2) нормальная сыворотка + испытуемый антиген; 3) заведомо положительный контроль.
•В качестве антигена использована жидкая культура грибка (разведение 1:10) и водно-солевой вытяжки из пленки (разведение 1 :40). Реакция связывания комплемента обнаруживает те же закономерности, что и реакция преципитации. При постановке перекрестной реакции имеется заметное различие между группой токсичных и нетоксичных штаммов. Отмечается большая поливалентность антисывороток против токсичных штаммов Fusarium. Эти сыворотки дали положительную реакцию со всеми антигенами как из токсичных, так и из нетоксичных штаммов в указанных разделениях. Сыворотки против нетоксичных штаммов дали реакции только с гомологичными (нетоксичными) антигенами.
(Следующим разделом работы было изучение специфических свойств сывороток больных алиментарно-токсической алейкией и экспериментальных животных, кормленных токсическим зерном. .В качестве антигена при постановке реакции преципитации и реакции связывания комплемента были использованы жидкая культура грибка на синтетической среде и водно-солевые вытяжки из пленки грибка. В работе были применены антигены из 4 токсичных штаммов.
Реакция преципитации изучаемых сывороток с грибковыми антигенами неизменно получалась отрицательной. Лишь в одном случае с сывороткой больной алиментарно-токсической алейкией была получена сомнительная реакция.
Реакцию связывания комплемента мы ставили тем же методом, как и при работе с кроличьими сыворотками. Для уточнения реакции мы применяли несколько доз комплемента, начиная с титра и выше.
В табл. 4 приведены результаты реакции связывания комплемента сыворотки больной алиментарно-токсической алейкией с двумя антигенами штамма Fusarium sporotrichioides № 1, токсичность которого была проверена Ю. И. Рубинштейн на обезьянах.
Таблица 4
ч s Антиген белковый Среда синтети- Среда синтетическая Белковый антиген
о СП № 420 ческая незасеян- после выращивания грибка № 1 из грибка № 1
« ная
н
а V я g я о
сыворотка
кроличья № 420 нормальная кроличья больной больной нормальная человеческая больной нормальная человеческая
0,5 + + + + Гемолиз ± ± Гемолиз ± Гемолиз
0,6 + + + + » Гемолиз Гемолиз • Гемолиз я
0,8 + + + + ш » » я » « »
1,0 + + + + » • я • • я
1,2 + + + + » я • я я я
2,0 4- + + + » я я я я
Как данные, приведенные в табл. 4, так и результаты, полученные при постановке реакции с антигенами других токсичных грибков с сыворотками больных людей и животных, оказались отрицательными. Та-
ким образом, нам не удалось обнаружить 'наличия антител к грибковому антигену ни в крови людей, болеющих или переболевших алиментарно-токсической алейкией, ни в крови экспериментальных животных. Считаем необходимым отметить, что мы работали со слабыми антигенами (дающими невысокие титры с кроличьими сыворотками), а потому при возможности получения более сильных антигенов такие наблюдения должны быть продолжены.
Таким образом, в объеме проведенной нами работы удалось обнаружить достаточно отчетливо выраженную тенденцию к серологической группировке токсичных и нетоксичных штаммов Fusarium. Полученные данные представляют определенный теоретический интерес, но возможность применения серологических методов в повседневной лабораторной диагностике грибков ограничена вследствие сложности метода. Ни в крови людей, больных или переболевших алиментарно-токсической алейкией, ни в крови экспериментальных животных не обнаружено' антител к грибковым антигенам. Однако количество материала, использованного нами, было невелико. Работы по изучению иммунобиологических свойств больных алиментарно-токсической алейкией и определению специфических свойств их сывороток в отношении грибковых антигенов должны быть продолжены.
Выводы
1. Методом подкожной инъекции кроликам суспензии пленки грибка Fusarium были получены прецигтитирующие и комплементсвязывающие антисыворотки.
2. В качестве тест-антигенов была использована жидкая культура грибка и водно-солевые вытяжки из растертой пленки грибка.
3. Грибки Fusarium обнаружили родовую серологическую специфичность.
4. Внутри рода Fusarium все штаммы обнаружили групповые реакции независимо от их токсичности.
5. Выявлена выраженная тенденция к серологической группировке штаммов грибков рода Fusarium, в зависимости от наличия или отсутствия у них способности давать токсическую реакцию (кожная проба).
6. В крови больных алиментарно-токсической алейкией и в крови экспериментальных животных антител к грибковым антигенам не обнаружено.
Проф. г. М. НАТАДЗР
К С-витаминной активности женского молока
Из лаборатории питания Министерства здравоохранения Грузинской ССР
Вопрос о С-витаминной активности женского молока возник с особой остротой в связи с изучением медико-санитарных последствий воины. В 1945 г. проф. Б. А. Лавров поставил этот вопрос как весьма актуальный.
В своих исследованиях мы поставили целью выявить содержание витамина С в молоке кормящей матери и на основании полученного материала установить (в норме) средний уровень этого витамина в женском молоке.
1 Доложено в Обществе гигиенистов Грузинской ССР.
