CC BY
41
Nikitin I.N., Vasiliev M.N.
Summary
The carried out(spent) researches on development and introduction of the state tasks of establishments of a State veterinary service of the subjects of Russian Federation. Is established, that the budget financing of state veterinary establishments as the grants provides rational use of budget means.
УДК 619:616.982
ВЫДЕЛЕНИЕ ВЫСОКОСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИГЕННЫХ СТРУКТУР МИКОБАКТЕРИЙ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
*Нуруллин А.А. - к.б.н, директор; Ахметов Т.М. - д.б.н., доцент;
*Нафиков М.М. - д.с.-х.н., профессор *Филиал Казанского (Приволжского) федерального университета, г. Чистополь Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана
тел.: (84342) 5-02-10
Ключевые слова: туберкулез, микобактерии, диагностика, антиген,
ИФА.
Keywords: tuberculosis, micobacteria, diagnostics, antigen, ELISA.
Разработка и совершенствование методов диагностики и профилактики туберкулеза сельскохозяйственных животных и птиц невозможны без точных знаний антигенного состава его возбудителя и родственных микроорганизмов.
По определению Р.В. Петрова [6], под специфичностью антигена микробной клетки следует понимать наличие в нем детерминант (против которых образуются антитела), уникальных для соответствующего вида. Чем меньше в антигене детерминант, общих для других родственных видов, тем большей специфичностью обладает антиген. Поэтому применение неочищенных препаратов антигенов резко снижает специфичность серологических методов исследования.
Микобактерии туберкулеза обладают многими антигенными субстанциями различной химической природы: белки, липопротеиды, фосфатиды, липополисахариды, которые представляют собой строго специфичные видовые или общие групповые антигены [7, 5]. Роль и значение отдельных химических микобактерий еще окончательно не выяснены [1].
Ю.К. Вейсфейлер [2] с помощью серологических методов разделили антигены микобактерий на 4 группы: первая из групп является
специфичной для вида, вторая - общая для всех, третья - для быстро растущих и четвертая для медленнорастущих микобактерий.
В результате анализа выделенных из микобактерий антигенных компонентов установлено, что наибольшей серологической активностью обладают полисахаридные фракции, которые определяют видовую специфичность микобактерий, а аллергенную - протеиновые фракции [4,
3].
Как у других родов микроорганизмов, так и у микобактерий для идентификации и определения степени родства антигенов решающее значение имеют иммунологические исследования. С этой целью широко используются иммуноферментный анализ, реакция агглютинации, реакция связывания комплемента, реакция диффузной преципитации в агаровом геле, электрофорез и другие.
В связи с этим, исследования, касающиеся антигенов возбудителя туберкулеза являются актуальными.
Материал и методы. Из благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйств Республики Татарстан от крупного рогатого скота получали для исследования пробы крови, сыворотки крови и молока. Патологический материал крупного рогатого скота (заглоточные, средостенные, брыжеечные лимфатические узлы) получали из Шеморданского мясокомбината и республиканской ветеринарной лаборатории. Автоклавированные культуры микобактерий М. bovis, M. avium, M. nonchromogenes, M. scotochromogenes получали из Курской биофабрики. В опытах был использован штамм M. bovis BCG -коммерческий, производство ФГУП «Аллерген» (г. Ставрополь).
Получение микобактериальных антигенов. Автоклавированную микобактериальную массу отмывали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин 5 раз в физиологическом растворе. Для удаления свободных липидов микробные клетки дважды обрабатывали ацетоном в соотношении 1:2, помещая их в термостат при 37°С на 1,5 часа и периодически перемешивая. По истечении этого времени методом центрифугирования при 5000 об/мин в течение 15 мин микробные клетки отделяли и подсушивали на воздухе. Обработанные ацетоном микробные клетки заливали раствором диметилсульфоксида (ДМСО), подогретым до 37°С, из расчета 6 мл на 1 г бактерий и встряхивали в течение 30 мин при 37°С, после чего микробные клетки отделяли центрифугированием в том же режиме. Экстракт диализировали против 0,01 М карбонатного буфера (рН 9,6) в течение двух суток. Диализат использовали в качестве антигена в дальнейших исследованиях (ДМСО-антиген).
Также изучали антигенные свойства туберкулинов путем иммунизации животных. Оптимальный способ получения иммунных
сывороток зависит от природы антигена, вида подопытного животного и цели, которой будет служить антисыворотка. В качестве продуцентов антисывороток использовали кроликов.
Были получены иммунные сыворотки против клеток M. bovis, ППД-туберкулина для млекопитающих и ППД-туберкулина для птиц. Титры антител и специфичность иммунных сывороток определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА).
ИФА ставили по стандартной методике в твердофазном неконкурентном варианте (ТФ), с использованием микротитрационных планшет для иммунологических реакций.
Результаты исследований. Проведенные исследования по оценке специфичности антисывороток показали, что наибольшие титры антител получены при иммунизации кроликов целыми клетками M. bovis и несколько ниже - при иммунизации ППД-туберкулином для млекопитающих, которые составляли от 1:16000 до 1:20000 (табл. 1).
1. Коэффициенты специфичности иммунных сывороток в ИФА
Иммунные сыворотки (IS) к: Клетки M. bovis ДМСО-аг M. bovis ППД-млекоп. ППД-птиц
клеткам M. bovis 2,6±G,13 2,8±G,14 2,4±G,12 2,5±G,11
ДМСО-аг M. bovis 3,G±G,15 3,2±G,16 2,4±G,12 2,4±G,11
ППД-млекоп. 2,4±G,11 2,5±G,1G 2,6±G,14 2,4±G,1G
ППД-птиц 2,4±G,11 2,4±G,1G 2,5±G,12 2,6±G,13
* - Р^5
Как видно из данных таблицы, наибольшей специфичностью обладает иммунная сыворотка против ДМСО-антигена M. bovis. Иммунные сыворотки против остальных антигенов дают между собой значительные перекрестные реакции.
Иммунизация животных ППД-туберкулинами не позволяет получать высокоспецифичные иммунные сыворотки. В серологических реакциях иммунные сыворотки против ППД-млекопитающих и ППД-птиц показывают одинаковые свойства.
Активность и специфичность полученных антисывороток изучали в ИФА с гомологичными микобактериальными антигенами. Гипериммунные сыворотки оказались примерно равными титрами специфических антител (средний титр в ИФА 1:30000-1:50000).
Изучали степень накопления в организме иммунизированных животных специфических антител в зависимости от сроков иммунизации: 50-й, 92-й, 130-й и 170-й дн. (табл. 2).
Наивысшие титры гипериммунных сывороток получены при иммунизации антигенами M. bovis и M. phlei. Несколько ниже титры при
иммунизации антигеном М. avium.
2. Титры специфических антител в антисыворотках M. bovis, M. avium, M. scotochromogenes, M. nonchromogenes и M. phlei при значениях К>2 против микобактериальных антигенов по срокам исследования
Иммунные сыворотки Титры специфических антител по срокам исследования
5G-M день 92-й день 13G-M день 17G-M день
M. bovis
M. bovis >1:2GG 1:32GG 1:64GG >1:128GG
M. avium 1:2GG >1:4GG 1:64GG 1:8GG
M. scotochromogenes 1:2GG >1:4GG 1:4GG 1:2GG
M. nonchromogenes 1:2GG >1:8GG >1:2GG 1:2GG
M. phlei 1:2GG >1:16GG >1:2GG 1:2GG
M. avium
M. bovis 1:2GG >1:4GG 1:32GG 1:8GG
M. avium >1:2GG 1:32GG 1:128GG >1:128GG
M. scotochromogenes 1:2GG >1:16GG 1:16GG 1:8GG
M. nonchromogenes 1:2GG >1:4GG >1:2GG 1:2GG
M. phlei 1:2GG >1:16GG >1:2GG 1:2GG
M. scotochromogenes
M. bovis 1:2GG >1:8GG >1:32GG 1:8GG
M. avium 1:2GG >1:8GG 1:4GG 1:4GG
M. scotochromogenes >1:2GG >1:16GG 1:64GG 1:128GG
M. nonchromogenes 1:2GG >1:8GG 1:4GG 1:4GG
M. phlei 1:2GG >1:8GG 1:4GG 1:4GG
M. nonchromogenes
M. bovis 1:2GG 1:4GG 1:4GG >1:8GG
M. avium 1:2GG 1:4GG >1:32GG >1:8GG
M. scotochromogenes 1:2GG 1:4GG 1:4GG 1:4GG
M. nonchromogenes >1:2GG 1:8GG 1:64GG 1:128GG
M. phlei 1:2GG 1:4GG 1:4GG 1:4GG
M. phlei
M. bovis 1:2GG 1:16GG >1:16GG >1:4GG
M. avium 1:2GG 1:16GG >1:16GG 1:4GG
M. scotochromogenes 1:2GG 1:8GG 1:8GG 1:4GG
M. nonchromogenes 1:2GG 1:8GG 1:4GG 1:4GG
M. phlei >1:4GG >1:16GG >1:32GG >1:64GG
При иммунизации кроликов против гомологичных микобактериальных антигенов образуются различные по специфичности антитела. Наиболее специфичные антитела образуются в более поздних сроках иммунизации, в нашем случае на 170-й день. В начальных стадиях иммунизации (на 50-й, 90-е день) титры неспецифических антител примерно на одном уровне со специфическими. Особенно ярко выражена такая особенность у антисывороток против M. phlei и M. scotochromogenes. Однако и наиболее специфичные сыворотки к концу иммунизации были
получены против антигена M. phlei.
Методом ИФА определяли специфичность и количество антител в иммунных сыворотках, рассчитывая коэффициенты специфичности (К) в двукратных разведениях антисывороток, начиная от 1:200 до 1:12800.
Нужно отметить также то, что антитела против птичьего вида микобактерий образуются в ответ на иммунизацию со всеми видами микобактерий и сохраняют высокие титры до конца срока иммунизации.
Активность и специфичность антисывороток изучали в ИФА в разведении 1:2000. Учет результатов реакции проводили на счетчике «ТйеЛес МиШБсап». Результаты опыта представлены в таблице 3.
3. Специфичность гипериммунных кроличьих сывороток по отношению гомологичным микобактиреальным антигенам
Гипериммун. сыворотки Антигены микобактерий
M. bovis M. avium M. phlei M. scotoc. M. nonch.
против:
M. bovis 1,26±0,14 0,65±0,07 0,45±0,06 0,58±0,07 0,74±0,09
К 1,9 2,8 2,1 1,7
M. avium 0,78±0,09 1,21±0,14 0,83±0,09 0,59±0,07 0,71±0,09
К 1,5 1,4 2,0 1,7
M. phlei 0,78±0,09 0,51±0,06 1,28±0,15 0,61±0,08 0,69±0,08
К 1,6 2,5 2,0 1,8
M. scotoc. 0,48±0,06 0,66±0,08 0,76±0,09 1,13±0,12 0,41±0,06
К 2,3 1,7 1,4 2,7
M. nonch. 0,50±0,06 0,63±0,07 0,33±0,04 0,44±0,06 1,27±0,15
К 2,5 2,0 3,8 2,8
*** - Р<0,001, К - коэффициент специфичности при ИФА
Из представленных в таблице данных видно, что гипериммунные сыворотки, полученные против соответствующих антигенов микобактерий, обладают специфичностью и могут быть использованы при типизации этих штаммов в патматериале. Однако между некоторыми видами микобактерий наблюдаются значительные перекрестные реакции: IS M. bovis против антигена M. nonchromogenes с коэффициентом специфичности 1,7; IS M. phlei против M. bovis с К = 1,6; IS M. scotochromogenes против M. phlei с К = 1,7 и M. avium с K = l,5; IS M. avium против M. bovis с К = 1,5.
Выводы. 1. Метод ТФ-ИФА может быть использован для выявления возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота; 2. Наиболее
перспективным является комбинированный метод ТФ-ИФА; 3. Для повышения эффективности ТФ-ИФА необходимо совершенствовать способы получения специфических антигенов возбудителя.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Авербах, М.М. Иммунология и иммунопатология туберкулеза / М.М. Авербах. - М.: Медицина, 1976. - 312 с. 2. Вейсфейлер,
Ю.К. Биология и изменчивость микобактерий Туберкулеза и атипичные микобактерии / Ю.К. Вейсфейлер - Будапешт: АН Венгрии, 1975. - 335 с.
3. Коляков, Я.Е. Ветеринарная иммунология / Я.Е. Коляков - М.: Агропромиздат, 1986. - 71 с. 4. Коромыслов, Г.Ф. Сравнительная иммунохимическая характеристика диагностических компонентов из микобактерий / Г.Ф. Коромыслов, Г.И. Устинова, Н.П. Овдиенко и [др.] // Труды ВИЭВ, 1984. - Т. 61. - С. 3-9. 5. Лысенко, А.П. Специфические антигены различных штаммов Mycobacterium bovis / А.П. Лысенко. -Ветеринария, 1987, № 5. - С. 34-36. 6. Петров, Р.В. Иммунология / Р.В. Петров - М.: Медицина, 1987. - 416 с. 7. Benjamin, R.G. Evaluatin of mycobacterial antigens in enzyme - linked immunosorbent assay (ELISA) for the serodiagnosis of tuberculosis / R.G. Benjamin, S.M. Debanne, Y. Ma et [ al. ] // J. Med. Microbiol., 1984 - V. 18. - N 3. - P. 309-318.
ВЫДЕЛЕНИЕ ВЫСОКОСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИГЕННЫХ СТРУКТУР МИКОБАКТЕРИЙ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
Нуруллин А. А., Ахметов Т.М., Нафиков М.М.
Резюме
В результате проведенных исследований показана возможность повышения эффективности методов идентификации возбудителя туберкулеза. Для повышения качества исследований необходимо совершенствовать способы получения специфических антигенов возбудителей туберкулеза.
ALLOCATION HIGH-SPECIFIC ANTIGENE STRUKTRUR MIKOBAKTERY AND STUDYING THEIR SEROLOGICHESKIKH OF PROPERTIES
Nurullin A.A., Ahmetov T.M., Nafikov M.M.
Summary
As a result of the conducted researches possibility of increase efficiency for methods of identification causative agent of tuberculosis is shown. For improvement of quality researches it is necessary to improve ways of receiving specific antigenes of causative agents of tuberculosis.
