CC BY
26
УДК 619:579.62/619:615
ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МИКОБАКТЕРИАЛЬНЫХ ФРАКЦИЙ M. BOVIS И M. AVIUM
МЯСОЕДОВ Ю.М.,
кандидат биологических наук, ФКП «Курская биофабрика»; e-mail: MyasoedovYurij@Yandex.ru. БЕЗГИН В.М.,
доктор биологических наук, профессор, директор ФКП «Курская биофабрика». КОЗЛОВ В.Е.,
доктор биологических наук, профессор, заместитель директора по науке ФКП «Курская биофабрика».
Реферат. Диагностика туберкулёза животных основана на выявлении возбудителей инфекции и иммунологических изменений, развивающихся при взаимодействии микобактерий и макроорганизма. Оценка иммунного ответа наиболее часто осуществляется в кожной туберкулиновой пробе с использованием ППД туберкулина. Микобак-териальные аллергены получают путём очистки культуральных фильтратов от балластных соединений при использовании разных физико-химических методов. Поэтому в процессе производства аллергены претерпевают изменение антигенных свойств. Целью исследования было: изучение биологических свойств микобактериальных фракций на различных этапах производственной очистки туберкулинов.Исследования включали: оценку активности и специфичности туберкулинов, а также определение эквивалентного соотношения антиген - антитело на разных этапах производства. В результате проведенных исследований было выявлено, что использование мембранного фракционирования, обуславливающего удаление молекулярных соединений более 100 кДа, при очистке туберку-линов, сопровождается снижением удельной активности и повышением специфичности конечного препарата. Установлено, что в процессе технологической очистки микобактериальных аллергенов из M. bovis и M. avium их активность в реакциях с антисыворотками снижается.
Ключевые слова: биологические свойства, микобактериальные фракции, активность, специфичность, эквивалентное соотношение
STUDYING OF BIOLOGICAL PROPERTIES MYCOBACTERIUM FRACTIONS M. BOVIS and M. AVIUM
MYASOEDOV Y.M.,
Candidate of Biology Sciences, Kursk biofactory; e-mail: MyasoedovYurij@Yandex.ru. BEZGIN V.M.,
Doctor of Biology Sciences, professor, director of Kursk biofactory. KOZLOV V.E.,
Doctor of Biology Sciences, professor, deputy director for science of Kursk biofactory.
Еssay. Allergic tuberculosis diagnostics of animals is one of the basic method that allows to carry out the animals selection for additional researches for the tuberculosis diagnosis. Allergic diagnostics is carried out with PPD tuberculin for mammal and PPD tuberculin for birds usage. Quality parameters activity and tuberculin's specificity define diagnostic efficiency of allergic one which depend manufacturing technology.
The research shows the influence of manufacturing technologies of tuberculin's production for tuberculosis diagnostics of the animals, used in Russia on immunobiology parameters of quality.
The technology of tuberculin's production used in Russian assumes various physical and chemical influences including concentration, chemical clearing and molecular separation mycobacterium proteins.
In the work mycobacterium: M. bovis and M. avium were used. Alive mycobacterium M. bovis strain BCG and M. avium strain 2282 (in structure of suspension prepared on a physiological solution) infected guinea pigs.
The rabbits immunizated with heath killed mycobacterium M. bovis штамм 8-88 and M. avium штамм 2282 (full complete Friend's adjuvant). Guinea pigs infected with mycobacterium estimated activity and specificity tub erculins.
This way Mycobacterium's allergens activity for mammals and PPD tuberculin specificity for birds were infected with M. bovis at different technological stages. Guinea pig infected M. avium activity PPD tuberculin for birds and specificity PPD tuberculin for mammal at various production phases was determined.
An immunological estimation of antigens tuberculin's on different technological step carried out the immunodiffusion reaction in comparison with specific antiwheys M. bovis and M. avium.
Giving immunological tuberculin's estimation on different production phases the decrease of affinity in the attitude homological antiwheys after physics and chemics processing was revealed. As a result, the ready products lose sensibilization properties.
The estimation of tuberculin's activity and specificity at different production phases has shown not significant de-crease(reduction) of biological activity but substantial increase of specificity after physical and chemical processing that allows to receive preparations a preparation with the stable properties, the qualities appropriate to requirements of the WHO and OIE.
Key words: tuberculin, mycobacterium, industry technology
Введение. Диагностика туберкулёза животных основана на выявлении в макроорганизме характерных для инфекции иммунологических, морфологических и других изменений, а также выделении возбудителя (Наставление по диагностике туберкулёза животных, 2002).
К иммунологическим методам оценки туберкулёзной инфекции относятся: аллергический, бласттранс-формации лимфоцитов, торможения миграции макрофагов (Кассич Ю. Я., 1990). При этом результативность тестов определяется качественными характеристиками используемых туберкулинов: величиной биологической активности и специфичностью, которые в свою очередь зависят от технологии производства (Козлов В.Е., Безгин В.М., 2003) Технология изготовления туберкулинов, используемая в РФ, включает следующие этапы: накопление на синтетической питательной среде массы микобактерий; термоинактивация посева; отделение бактериальной массы от растворимой фракции (на данном этапе аллерген обозначается как куль-туральный фильтрат-КФ), очистка белковых производных трихлоруксусной кислотой и сернокислым аммонием, а также мембранное фракционирование (на финишном этапе очистки аллерген обозначается как концентрат белка-КБ) (Козлов В.Е., Безгин В.М. и др., 1997).
Очевидно, что на различных технологических этапах очистки антигенов микобактерий изменяются их биологические характеристики, что является не достаточно изученным, в связи, с чем целью исследования было: изучение биологических свойств микобактери-альных фракций M. bovis и M. avium на различных этапах производства.
Условия, материалы и методы исследования. В исследовании были использованы микобактерии: M. bovis штамм 8-88, и штамм БЦЖ; M. avium штамм 2282. Биомассу микобактерий накапливали на картофельной среде Павловского, в течение 30 суток. Из перечисленных микобактерий приготавливали суспензии для иммунизации морских свинок и кроликов.
В работе по изучению биологических параметров туберкулиновых фракций активности и специфичности были использованы 40 голов самок морских свинок альбиносов, массой 500±100 гр., одновременно полученные из ФГБУН ФМБА России. Животных содержали на стандартном рационе кормления, с использованием гранулированного корма. Перед иммунизацией, животных тестировали на туберкулёз аллергической пробой с использованием 5 МЕ ППД для млекопитающих (Наставление по диагностике туберкулёза животных, 2002). После чего морских свинок по принципу аналогов распределили в четыре группы (по 10 голов в каждой). Животных первой и второй групп внутрикожно инфицировали микобактериями бычьего вида M. bovis штамм БЦЖ, в дозе 0,2 мг/ 0,1см3; морских свинок третьей и четвёртой групп внутримышечно инфицировали микобактериями птичьего вида M. avium штамм 2282, в дозе 3 мг/0,5 см3. Через 30 суток после инфицирования, животные были использованы в опытах. На морских свинках инфицированных M. bovis были определены активность КФ M. bovis, КБ M. bovis и специфичность КФ M. avium и КБ M. avium. На морских свинках инфицированных M. avium определены активность КФ M. avium, КБ M. avium и специфичность КФ M. bovis, КБ M. bovis.
Оценку эквивалентного соотношения микобактери-альных антигенов и антисыворотки исследовали в реакции иммунодиффузии. Были использованы кроличьи антисыворотки к M. bovis и M. avium. Для постановки реакции иммунодиффузии был использован 0,8% гель агара. После прорезывания лунок геля агара при помощи штампа и внесения реагентов чашки Петри выдерживались при температуре 20°С в течение 48 часов, после чего учитывались результаты.
Продуцентами антисывороток являлись кролики калифорнийской породы, массой 3,0-3,5 кг, предварительно тестированные на туберкулёз аллергическим методом с использованием 10 МЕ ППД туберкулина для млекопитающих (Наставление по диагностике туберкулёза животных, 2002). Животных с интервалом в 14 суток восьмикратно иммунизировали инактивиро-ванными микобактериями M. bovis и M. avium (на не полном адъюванте Фрейнда).
В исследовании были применены следующие ми-кобактериальные аллергены: 1. Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих, эталонная серия; 2. Туберкулин очищенный (ППД) для птиц, эталонная серия; 3. Культуральный фильтрат M. bovis; 4. Концентрат белка M. bovis; 5. Культуральный фильтрат M. avium; 6. Концентрат белка M. avium.
Эталонные серии ППД туберкулина для млекопитающих и ППД туберкулина для птиц - образцы препаратов по биологическим параметрам эквивалентные Международным стандартам PPD- bovis и PPD- avium. Исследования иммунобиологических показателей туберкулиновых фракций было осуществлено в соответствии с руководством МЭБ (OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2010 и ГОСТ 32306-2013, 2014).
Концентрация белка в микобактериальных аллергенов определяли по методу Кьельдаля (ГОСТ 16739-88., 1988).
Анализ и обсуждение результатов исследования. Опыты по оценке биологических свойств микобактери-альных фракций M. bovis и M. avium на различных этапах производства было осуществлено в три этапа. При реализации первого этапа были исследованы удельная биологическая активность и специфичность микобакте-риальных аллергенов КФ и КБ M. bovis. Определение удельной активности микобактериальных фракций M. bovis было осуществлено в сравнении с эталонной серией туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих. Специфичность микобактериальных фракций M. bovis была определена в сравнении с эталонной серией туберкулина очищенного (ППД) для птиц. Результаты исследования представлены в таблице 1.
Из представленных данных видно, что удельная активность культурального фильтрата M. bovis соответствует 14300 МЕ/мг. Сопоставляя полученные значения с требованиями МЭБ, видно соответствие требованиям нормы (ГОСТ 32306-2013). Полученный результат позволяют предположить, что, концентрируя культураль-ный фильтрат M. bovis до мг/см3 будет получен высокоактивный препарат. Вместе с тем при изучении показателя специфичность выявлено превышение значения в два раза, в сравнении с требованиями нормы (не более 10%) и соответствующего 20%, что в свою очередь не позволяет использовать подобный подход для получения специфичного диагностикума.
Определение удельной активности концентрата белка продемонстрировало значение 9500 МЕ, что является близким к номинальному значению активности -10000 МЕ/мг и в 1,5 раза ниже аналогичного показателя КФ M. bovis. Значение специфичности аллергена КФ M. bovis соответствовало 4%, что в пять раз меньше аналогичного значения культурального фильтрата M. bovis. Понижение величины биологическая активность и повышение специфичности объясняется технологией производства туберкулинов, предусматривающей удаление молекулярных соединений более 100 кДа (Козлов В.Е., Безгин В.М., 2003).
Следующим этапом исследования было изучение удельной биологической активности и специфичности микобактериальных фракций КФ и КБ M. avium. Оценка удельной активности аллергенов M. avium была осуществлена в отношении эталонной серией туберкулина очищенного (ППД) для птиц. Специфичность фракций была определена в сравнении с эталонной серией туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих. Результаты исследования представлены в таблице 2.
Зависимость изменения биологической активности и специфичности при изготовлении ППД туберкулина для млекопитающих выявленная в отношении микобак-териальных фракций КФ M. bovis и КБ M. bovis была также определена и для культурального фильтрата M. avium и концентрата белка M. avium. Так удельная биологическая активность культурального фильтрата из M. avium составила 59500 МЕ/мг, что для готового препарата приближается к крайнему значению, установленному в нормативных документах (37500-66500). При этом показатель специфичности превышал установленные нормы (не более 10%) и соответствовал 15%. После ряда технологических процессов по отделению от аллергена молекулярных соединений более 100 кДа концентрат белка характеризовался активностью 49000 МЕ/мг и специфичностью 3,5%. Таким образом, снижение активности составило 17,6%, при повышении специфичности в 4,3 раза.
Постановка иммунодиагностических реакций при изучении туберкулёзной инфекции предполагает использование ППД туберкулинов. Важным условием использования аллергенов в качестве специфического диагностикума является определение стабильности ми-кобактериальных антигенов. Поэтому на заключительном этапе исследования в реакции иммунодиффузии с гомологичными антисыворотками была осуществлена
оценка стабильности микобактериальных фракций. При постановке РИД были использованы кратные разведения КФ и КБ M. bovis и M. avium (1:2; 1:4; 1:8; 1:16). Расположение линии преципитации посредине между лунками геля агара принимался как титр с эквивалентным соотношением антиген - антитело. Результаты исследования представлены в таблице 3.
Из полученных результатов видно, что препарат КФ M. bovis с антисывороткой M. bovis характеризуется равнозначностью в разведении 1:16, в то время как аллерген КБ M. bovis являлся эквивалентным в разведении 1:2. Сопоставляя аллергены равной эквивалентности по содержанию белка, выявляется разница в 100 раз. Закономерность снижения эквивалентного соотношения антиген - антитела определённая при использовании аллергенов M. bovis была выявлена и в отношении аллергенов КФ и КБ M. avium. Так КФ M. avium характеризовался эквивалентным соотношением с антисывороткой M. avium в разведении 1:16, в то время как КБ M. avium в цельном разведении. Сопоставление титра КФ M. avium и КБ M. avium одинаковой эквивалентности по содержанию миллиграмм белка демонстрирует различие в 330 раз.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о более широком антигенном составе культу-ральных фильтратов, в сравнении с концентратами белка, и демонстрируют, что в туберкулиновых фракциях КБ M. bovis и КБ M. avium сконцентрированы соединения ответственные за специфичные клеточно- опосредованные реакции.
Проведённые исследования объясняют сложность получения антител на антигены ППД туберкулинов классическими методами (Староверов С.А., Видяшева И.В., Фомин А.С., и др., 2011). Не смотря на то, что готовый препарат ППД туберкулин содержит молекулярные соединения более 10 кДа способные индуцировать иммунный ответ, опосредованный антителами (Вязов, 1967) при многократной иммунизации лабораторных животных титры антител, как правило, очень низкие. Поэтому при оценке туберкулёзной инфекции по ПЧЗТ in vivo наиболее оптимальным будут аллергены, полученные методом мембранного фракционирования на финишном этапе производства. Вместе с тем, при постановке реакций опосредованных использованием клеток in vitro - РБТЛ и РТММ использование в качестве специфических антигенов КБ и КФ микобак-терий M. bovis и M. avium предполагает проведение дополнительных исследований.
Таблица 1 - Удельная активность и специфичность фракций микобактериальных аллергенов M. bovis
Препарат Показатель
Удельная активность Специфичность
КФ M. bovis 14300 МЕ/мг 20%
КБ M. bovis 9500 МЕ/мг 4%
Значения нормы готового препарата (ГОСТ 32306-2013) 6600-15000 МЕ/мг Не более 10%
Таблица 2 - Удельная активность и специфичность фракций микобактериальных аллергенов M. avium
Препарат Показатель
Удельная активность Специфичность
КФ M. avium 59500 МЕ/мг 15%
КБ M. avium 49000 МЕ/мг 3,5%
Значения нормы готового препарата (ГОСТ 32306-2013) 37500-66500 МЕ/мг Не более 10%
Таблица 3 - Определение эквивалентного соотношения антиген - антитело фракций M. bovis и M. avium
Препарат Титр Содержание белка
Использование антисыворотки к M. bovis
КФ M. bovis 1:16 0,03 мг/см3
КБ M. bovis 1:2 3 мг/см3
Использование антисыворотки к M. avium
КФ M. avium 1:16 0,013 мг/см3
КБ M. avium Без разведения 4,3 мг/см3
Выводы.
1. Выявлено, что в процессе технологической очистки микобактериальных аллергенов M. bovis и M. avium предполагающей мембранное фракционирование с удалением молекулярных соединений более 100 кДа
одновременно снижается удельная активность при повышении специфичности.
2. Установлено, что в процессе технологической обработки аллергенов из M. bovis и M. avium их активность с гомологичность с антисыворотками снижается.
Список использованных источников
1. Вязов О.Е. Лабораторная иммунология. - М.: Медицина, 1967. - С.14.
2. ГОСТ 16739-88. Туберкулин сухой очищенный (ППД) для млекопитающих. - М.: Изд-во стандартов, 1988. -
21с.
3. ГОСТ 32306-2013. Туберкулины очищенные (ППД) для животных. - М.: Стандартинформ, 2014. - 18 с.
4. Инструкция по применению туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих (Утверждена заместителем Руководителя Россельхознадзора 30. 09. 2011 года)
5. Кассич Ю. Я. Туберкулез животных и меры борьбы с ним. - Киев, Урожай, 1990. - С. 101.
6. Козлов В.Е., Безгин В.М. Новые технологии производства диагностических препаратов для ветеринарной медицины/ «Ветеринарна медицина» Мiжвiдомчий тематичний науковий збipник. - Випуск 81. - Харшв. - 2003. -С. 41- 45.
7. Мясоедов Ю. М., Морозов С. В. Оптимизация теста определения биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии.- 2012. - № 9.- С. 71-74.
8. Мясоедов Ю.М. Оценка методов контроля качества микобактериальных аллергенов изготавливаемых с использованием M. Bovis // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. - 2015.- № 8.- С. 209212.
9. Мясоедов Ю.М. Сравнительный анализ критериев формирования групп морских свинок используемых для моделирования реакций гиперчувствительности замедленного типа // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии.- 2013.- №7.- С. 66-67.
10. Министерство Здравоохранения РФ. Приказ от 21 марта 2003 года, № 109. «О совершенствовании противотуберкулёзных мероприятий в РФ. В редакции приказа Минздравсоцразвития РФ от 29. 10. 2009. №855.
11. Наставление по диагностике туберкулёза животных. Утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхо-за РФ 18 ноября 2002 г. - М. - 2002 г. - 63 с.
12. Способ получения туберкулина / Козлов В.Е. Безгин В. М. и др. // Патент на изобретение № 2113233. 1997 -
6 с.
13. Разработка иммунозолотых диагностических систем для идентификации возбудителя туберкулеза in situ / С.А.Староверов, И.В. Видяшева, А.С. Фомин и др. // Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные.- 2011.-№2.- С. 29-32.
14. OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. - Paris, 2010.
List of sources used
1. Viasov O.E. Laboratory immunology. - M.: Medicine. - 1967. - P.14.
2. State Standard 16739-88. Purified Tuberculin (PPD) for mammals. Publishing house standards, 1988. - 21p.
3. State Standard 32306-2013. Purified tuberculins (PPD) for animals.-М.-Standardinform.-2014.-18p.
4. The instruction on application Purified tuberculin (PPD) for mammal.- 30. 09. 2011.
5. Kassich J.J. The tuberculosis of animals and measures of struggle against him. - Kiev, the Crop. - 1990. - P. 101.
6. Kozlov V.E., Bezgin V.M. New technologies of diagnostic preparations for veterinary medicine. Veterinary medicine. Interdepartmental thematic scientific manual.- Release 81.-Harkov.-2003.-P.41-45.
7. Мyasoedov J.M., Morozov S.V. Optimization of the test of definition of biological activity PPD tuberculin for mammal // Vestnik of Kursk state agricultural Academy.-2012.-N 9.-P. 71-74.
8. Мyasoedov J.M. Estimation of a quality monitoring of quality mycobacterium allergens made with use M. bovis // Vestnik of Kursk state agricultural Academy.-2015.- N8.-P. 209-212.
9. Мyasoedov J.M. The comparative analysis of criteria of formation of groups of guinea pigs of reactions of hypersensitivity of the slowed down type used for modeling// Vestnik of Kursk state agricultural Academy.-2013.-N7.-P. 66-67.
10. Ministry of Health of the Russian Federation. The order from March, 21, 2003, N109. « About perfection of antitubercular actions in the Russian Federation. In edition of order The ministry of social development the Russian Federation from 29. 10. 2009. N 855.
11.Manual on diagnostics of a tuberculosis of animals. It is authorized by Department of veterinary science The Russian Federation Ministry of Agriculture, November, 18, 2002.- 63 p.
12. A way of reception tubeculin / Kozlov V. E., Bezgin V. M. et. al. // Patent for the invention N 2113233. 1997-6 p.
13. Development of immunogold diagnostic systems for identification of the causative agent of tuberculosis in situ / S.A.Staroverov, I.V.Vidyasheva, A.S. Fomin et. al. // Russian journal veterinary. Small domestic and wild animals. - 2011. - N2. - P. 29-32.
14. OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. - Paris, 2010.
