CC BY
10
УДК 619:616-07:619:579.62
МОДИФИКАЦИЯ МЕТОДА ОЦЕНКИ КОЖНОЙ РЕАКЦИИ ПЧЗТ ПРИ КОНТРОЛЕ МИКОБАКТЕРИАЛЬНЫХ АЛЛЕРГЕНОВ
МЯСОЕДОВ Ю.М.,
кандидат биологических наук, ФКП «Курская биофабрика»; e-mail: MyasoedovYurij@Yandex.ru.
Реферат. Оценка иммунобиологических параметров микобактериальных аллергенов осуществляется на сенсибилизированных микобактериями туберкулёза морских свинках. Животным внутрикожно инъецируют несколько разведений исследуемого и контрольного образцов аллергенов, и спустя 24 часа после введений разведений препаратов, проводится визуальная оценка кожных реакций. В свою очередь метод визуального учёта кожных аллергических реакций характеризуется рядом недостатков обусловленных: различной фиксацией животного, при котором размеры реакции колеблются из-за неодинакового натяжения кожи, в местах развития воспалительного процесса; индивидуальными параметрами зрения разных специалистов, различной освещённостью реакций ПЧЗТ. Снижение влияния перечисленных недостатков на точность определения параметров качества ППД туберкулинов возможно путём использования специализированных технических устройств.
Принимая во внимание отсутствие данных устройств приемлемых для контроля аллергенов целью исследования было: модификация метода оценки кожной реакции ПЧЗТ при контроле микобактериальных аллергенов, включающая разработку технического устройства и апробацию аппаратного метода учёта аллергических туберкулиновых реакций при изучении биологических параметров ППД туберкулинов на морских свинках.
В результате проведённых исследований предложена модификация метода оценки кожной реакции ПЧЗТ используемая при контроле микобактериальных аллергенов. Оценка иммунобиологических характеристик микобак-териальных аллергенов при помощи разработанного устройства осуществляется получением цифрового изображения реакции с последующим анализом данных на ЭВМ с помощью программного обеспечения. Сопоставление результатов определения размеров визуальным методом и модифицированным методом с вероятностью 0,05 продемонстрировало отсутствие различий. Предложенный метод характеризуется высокой информативностью, позволяет формировать базу изображений для осуществления сравнительных исследований.
Ключевые слова: методы, активность, специфичность, ППД туберкулины, морские свинки. MODIFICATION OF A METHOD OF A SKIN REACTION ESTIMATION DTH AT THE CONTROL OF MYCOBACTERIUM ALLERGENS
MYASOEDOV Y.M.,
Candidate of Biology Sciences, Kursk biofactory; e-mail: MyasoedovYurij@Yandex.ru.
Essay. The estimation of immunobiological mycobacterium allergens parameters is carried out on sensibilized by my-cobacterium of tuberculosis guinea pigs. Animals intracutaneous are injected by some cultivations of researched and control allergens samples, and after 24 hours after introductions of cultivations of preparations, a visual estimation of skin reactions are carried out.
The method of the visual account of skin allergic reactions is characterized by a number of lacks caused: various fixing of an animal at which the sizes of reaction change because of a unequal tension of skin, in places of inflammatory process development; individual parameters of sight of different experts, various light exposure of borders of reactions delayed type hypersensitivity (DTH) because of a reactions relief. Decrease of the listed lacks influence on accuracy of definition quality parameters of PPD tuberculin is possible by using of the specialized technical devices.
Considering absence of the given allergens devices used at the control the guinea pigs of research was: updating of a method of an skin reaction DTH estimation at the control of the mycobacterium allergens, including development of the technical device and approbation of a hardware method of the account allergic tuberculin reactions at studying biological parameters PPD tuberculin on guinea pigs.
As a result of the carried out researches is offered the updating of an estimation of skin reaction DTH method that is used at the control of mycobacterium allergens. The estimation of immunobiology characteristics of mycobacterium allergens by means of the developed device is carried out by reception of the digital reaction image with the subsequent analysis of the data on the computer with the help of the specialized software. Comparison of definition results of the sizes by a visual method and the modified method has shown absence of distinctions with probability 0,05. The offered method is characterized by high information; it allows to form the base of images for realization of comparative researches.
Key words: methods, activity, specificity, PPD tuberculin, guinea pigs.
Введение. Контроль качества иммунобиологических параметров ППД туберкулинов: активность и специфичность осуществляется на модели туберкулёзной инфекции - сенсибилизированных микобактериями морских свинках. Методически процедура определения биологических количественных параметров микобакте-риальных аллергенов предполагает введение разведений контрольного и испытуемого препаратов, а спустя 24 часа, визуальный учёт кожной реакции ПЧЗТ, путём обозначения границ воспалительного процесса марке-
ром и последующим переносом линейных размеров на целлофан (ГОСТ 16739-88, 1988; В.А. Фрадкин 1990).
Недостатками метода визуальной оценки кожных реакций является затруднения при определении границ воспалительного процесса обусловленные: фиксацией животного, при котором размеры реакции колеблются из-за неодинакового натяжения кожи; индивидуальными параметрами зрения разных специалистов, различной освещённостью границ реакций ПЧЗТ (M.A. Chambers, 2002). Снижение влияния перечисленных факто-
ров на точность определения параметров качества ту-беркулинов возможно путём использования специализированных технических устройств. Так к настоящему времени разработаны устройства для анализа кожных покровов человека, широко используемые в медицинской и криминалистической исследованиях (Патент № 2150883, 1998; Патент № 2451333, 2007; Wohrl S., Vigl K, Binder M., et. al., 2006). Применение перечисленных устройств или их аналогов, для изучения иммунобиологических параметров микобактериальных аллергенов может нивелировать отрицательное влияние факторов связанных с визуальным учётом. В свою очередь предлагаемые приборы не имеют приспособлений для фиксации животного, что ограничивает их использование при изучении биологических параметров туберкулинов и обуславливает актуальность разработки специализированного устройства.
Принимая вышеизложенное целью исследования было: модификация метода оценки кожной реакции ПЧЗТ при контроле микобактериальных аллергенов, включающая разработку технического устройства и апробацию аппаратного метода при изучении биологических параметров ППД туберкулинов на морских свинках.
Условия, материалы и методы исследования. В
исследовании были использованы 22 беспородные самки морских свинок массой 400-500 гр., одновременно полученные из филиала «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Животных содержали на стандартном рационе кормления, с использованием гранулированного корма. Лабораторных животных за 30 дней, до проведения исследований, внутрикожно сенсибилизировали микобактериями штамма БЦЖ в дозе 0,2 мг/0,1 см3.
В работе были применены следующие микобакте-риальные аллергены:
- ППД туберкулин для млекопитающих - коммерческая серия;
- ППД туберкулин для млекопитающих - эталонный образец (эквивалентный Международному стандарту PPD- bovine).
Аллергены произведены ФКП «Курская биофабрика», по технологии молекулярного мембранного фракционирования (Козлов В.Е., Безгин В.М., 2003). Исследование препаратов на животных было осуществлено в разведениях 25 МЕ, 5 МЕ, 1МЕ в 0,1 см3 на фосфатно-буферном растворе.
Графическая обработка фотоматериалов осуществлялась с использованием ПО AxioVision LE 2009. Статистическая обработка результатов экспериментов осуществлялась с использованием ПО 1.0 Biological activity purified tuberculin for mammals и ПО 1.0 Specificity purified tuberculin for mammals.
Анализ и обсуждения результатов исследования. При разработке устройства, технические параметры которого позволят осуществлять исследование иммунобиологических свойств микобактериальных аллергенов, за основу были использованы различные технические решения. Так устройство, описанное в патенте № 2150883, 1998 было спроектировано для определения морфологических количественных параметров биологических объектов и представляет собой две цифровые камеры, соединённые с микроскопом и компьютером. Техническое устройство позволяет получать стереоскопические изображения объектов: кожи, ногтей, волос, костей, хрящей, зубов и др. с последующей компьютерной обработкой полученной стереопары рельефа поверхности биологических объектов.
Техническое решение, представленное в патенте № 2451333, 2007 представляет собой корпус с отверстием, в котором располагается субъект для захвата изображения, устройство захвата цифрового изображения, источник света для подсветки субъекта во время захвата изображения, компьютер для управления устройством захвата изображения и источником света. Устройство позволяет детально исследовать кожу лица человека, что особенно важно в косметологии и лицевой хирургии.
Устройство, описанное (V. Voipio H. Huttunen, H. Forsvik, 2012) состоит из блока освещения цифровой и светозащитной камер. Использования устройства применимо для анализа кожи предплечья, в том числе и при постановке прик - теста, с использованием инфекционных аллергенов.
Применение перечисленных технических решений для оценки размеров границ воспалительного процесса протекающего в дерме позволяет снизить влияние негативных факторов обусловленных индивидуальными параметрами зрения различных специалистов и не одинаковой освещённостью аллергических реакций. В свою очередь при контроле иммунобиологических параметров микобактериальных аллергенов на морских свинках, основным ограничением использования упомянутых технических решений является отсутствие конструктивных элементов позволяющих нивелировать погрешность обусловленной движением органов грудной и брюшной областей (и соответственно кожных покровов) на резкость получаемых снимков кожных туберкулиновых аллергических реакций.
В результате анализа устройства технических прототипов, с учётом определённых задач было разработано техническое устройство конической формы включающее: корпус с вмонтированной цифровой камерой (Olympus 3,2 мегапикселя), жидкокристаллическим дисплеем обращённое к оператору, а объективом к поверхности кожи с аллергической реакцией, кнопку управления цифрового захвата изображения, переключатель работы светоизлучающих диодов, светоизлу-чающие диоды, кронштейн, в основании которого имеется окно, внутри которого вмонтировано стекло, на поверхности, которого нанесена масштабная линия. Использование кварцевого стекла в основании кронштейна позволяет нивелировать движение органов грудной и брюшной областей при соприкосновении основания и поверхности кожи. Для захвата изображения туберкулиновых реакций ПЧЗТ, при определённых значениях длины световой волны, предусмотрен светозащитный кожух.
Оценка иммунобиологических характеристик ми-кобактериальных аллергенов при помощи разработанного устройства осуществляется путём получения цифрового изображения кожных аллергических реакций, с записью данных в память цифровой фотокамеры, после чего изображения, содержащиеся в памяти цифровой камеры, переносятся в память ЭВМ. В последующем, на ЭВМ осуществляется обработка полученных изображений с помощью специализированного программного обеспечения, например фоторедактора, AxioVision LE. Учёт размеров кожной реакции ПЧЗТ может быть осуществлён определением перпендикулярных размеров или площади аллергической реакции, обеспечивает равнозначные выводы, что было показано ранее (Мясоедов Ю.М., Морозов С.В., 2010).
При проведении расчётов на ЭВМ (ПО AxioVision LE) с использованием в расчётах площади реакции результат может быть выражен в пикселях. При осуществлении расчётов в миллиметрах значения пикселей пе-
ресчитываются в миллиметры относительно масштабной линии согласно формуле:
р х 1т
L =
Ipm
где Ь - длина линии (в миллиметрах) между границами воспалительного процесса;
р - длина линии (в пикселях) между границами воспалительного процесса;
1т - длина масштабной линии в миллиметрах; 1рт - длина масштабной линии в пикселях. Апробация аппаратного метода учёта кожных туберкулиновых аллергических реакций при изучении иммунобиологических параметров микобактериальных аллергенов была осуществлена в два этапа. При реализации первого этапа были сопоставлены результатов
полученных с помощью аппаратного и визуального методов. Исследование было осуществлено на группе морских свинок сенсибилизированных M. bovis БЦЖ. После развития состояния повышенной чувствительности, животным внутрикожно инъецировали три разведения ППД для млекопитающих: 25 МЕ, 5 МЕ, 1 МЕ. Метод визуального учёта предполагал определение границ реакций в коже и последующий перенос значений на целлофан. При использовании аппаратного метода были получены цифровые изображения, после чего значения пикселей были преобразованы в миллиметры, границы реакций были детализированы с помощью программного обеспечения. Результаты исследования представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Интенсивность кожной аллергической реакции на различные дозы ППД для млекопитающих при
Показатели Метод
Визуального учёта Аппаратного учёта
Доза туберкулина, МЕ 25 5 1 25 5 1
M±m 19,75±0,51 15,96±0,45 11,75±0,35 18,52±0,45 15,48±0,52 11,69±0,40
Р> - - - 0,05 0,05 0,05
аблица 2 - Биологическая активность ППД туберкулина для млекопитающих при использовании визуального и аппаратного методов учёта ^__
Показатели Метод визуального учёта (определение диаметра реакций в миллиметрах) Аппаратный метод (определение диаметра реакций в пикселях)
ППД для млекопитающих ППД для млекопитающих
Испытуемый Контрольный Испытуемый Контрольный
Доза МЕ 25 5 1 25 5 1 25 5 1 25 5 1
Средний диаметр 19,04 15,42 12,58 19,75 15,96 11,75 302,88 250,08 203,88 305,21 258,79 193,75
Коэффициент активности R=0,94 R=0,99
Доверительный интервал 74% - 136% 71%-141%
Из полученных данных видно, что при использовании методов визуального и аппаратного учёта с вероятностью 0,05 статистически значимых различий не выявляется.
На рисунке 1 представлено цифровое изображение кожной реакции ПЧЗТ на дозы ППД туберкулина для млекопитающих: 25 МЕ, 5 МЕ, 1 МЕ кожной туберкулиновой реакции ПЧЗТ после обработки с помощью программы Ахю\^юп ЬБ. Результаты выражены в пикселях.
Рисунок 1- Кожная аллергическая реакция ПЧЗТ на различные дозы ППД туберкулина для млекопитающих после цифровой обработки с помощью ПО АхюУ1яоп ЬБ
Представленный снимок демонстрирует, что использование устройства не приводит к деформации кожного покрова, позволяя получать цифровые изображения с выраженными границами аллергических реакций и возможностью осуществить детализацию границ воспалительных зон.
Следующим этапом исследования было сопоставление результатов биологической активности ППД для млекопитающих полученных с помощью аппаратного метода в сравнении с визуальным. При использовании аппаратного метода расчёт биологической активности был осуществлен в пикселях. Результаты исследования представлены в таблице 2.
Сопоставление результатов биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих полученных с помощью визуального и аппаратного методов учёта, целесообразно осуществлять с применением двух критериев: доверительного интервала и коэффициента активности (В.А. Фрадкин 1990). Из полученных данных видно, что значения доверительных интервалов в обоих случаях входят в предел 50-200 %, что характеризует достоверность полученных результатов (р=0,05). Значения биологической активности выраже-
ны в логарифме относительной активности в обоих вариантах сопоставлении коэффициента активности соответствуют границам R=1±0,2 характеризующие сопоставимость результатов активности микобактери-альных аллергенов. Таким образом, полученные данные с вероятностью р=0,05 позволяют утверждать, что метод визуального и аппаратного учёта являются тождественными.
Выводы
1. Предложена модификация метода оценки кожной реакции ПЧЗТ при контроле микобактериальных аллергенов на основе технического решения, альтернативная методу визуального учёта.
2. Показано, что аппаратный метод учёта кожных туберкулиновых аллергических реакций характеризуется высокой информативностью, позволяет формировать базу изображений для осуществления сравнительных исследований.
Список использованных источников
1. ГОСТ 16739-88. Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих. - М.: Изд-во стандартов, 1988. - 21 с.
2. Козлов В.Е., Безгин В.М. Новые технологии производства диагностических препаратов для ветеринарной медицины. Ветеринарная медицина. Мiжвiдомчий тематичний науковий збiрник.- Випуск 81.-Харьков, 2003.-С.41-45.
3. Мясоедов Ю.М., Морозов С.В. Сравнение вариантов учёта кожных аллергических реакций ГЗТ, при определении величины биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих. Материалы международной научно-практической конференции, посвящённой 140- летию со дня рождения профессора И. И. Иванова (Курск 25-26 ноября 2010). Обеспечение продовольственной безопасности России. Если не мы, то кто?! -! Курск, 2010. -С.199-201.
4. Мясоедов Ю.М. Оценка методов контроля качества микобактериальных аллергенов изготавливаемых с использованием M. Bovis // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. - 2015. - № 8.- С. 209-212.
5. Патент № 2150883, 1998 г. Способ определения морфологических количественных параметров рельефа поверхности биологических объектов: кожи, ногтей, волос, костей, хрящей, зубов и других. Омельяненко Н.П., Со-клов В.Н., Юрковец Д.И.
6. Патент № 2451333, 2007 г. Устройство и способы формирования изображений для захвата и анализа цифровых изображений кожи. П. Джеффри., П. Грегори, К. Никифорос., Д. Дик., Р. Эдуардо
7. Фрадкин В.А. Диагностические и лечебные аллергены. - М.: Медицина 1990. - С. 51-58.
8. Automated measurement of skin prick tests an advance towards exact calculation of wheal size. Experimental Dermatology 2006; 15; 119-124. Wohrl S., Vigl K, Binder M., Stringl G, Prinz M.
9. Chambers, M.A. Simple objective measurement of the cutaneous delayed-type hypersensitivity reaction to tuberculin using spectrophotometry / M.A. Chambers, K. Jahans, A. Whelan //Skin Res Technol. -2002. May- 8 (2). -S.89-93.
10. Practical Imaging in Dermatology. Ville Voipio, Heikki Huttunen, Heikki Forsvik., 2012. www.intechopen.com.
List of sources used
1. State Standard 16739-88. Purified Tuberculin (PPD) for mammals. M.: Publishing house standards, 1988. - 21p.
2. Kozlov V.E., Bezgin V.M. New technologies of diagnostic preparations for veterinary medicine. Veterinary medicine. Interdepartmental thematic scientific manual.- Release 81.-Harkov,2003.-P.41-45.
3. Myasoedov J. M., Morozov S.V. The variants of the account of skin allergic reactions DHT, at definition of size of biological activity PPD tuberculin for mammals. Materials of the International scientifically practical conference devoted 140 years from birthday of the professor I.I. Ivanov (Kursk November, 25-26 2010). Maintenance of food safety of Russia. If not we, who?! - Kursk, - 2010. - P. 199-201.
4. Myasoedov J.M. Estimation of a quality monitoring of quality микобактериальных allergens made with use M. bovis // Vestnik of Kursk state agricultural Academy .-2015.- № 8. - P. 209-212.
5. Patent № 2150883, 1998. A way of definition of morphological quantitative parameters of a relief of a surface of b i-ological objects: skin, nails, hair, bones, cartilages, a teeth and others. Omelianenko N.P., Soklov V.N., Jurkovets D.I.
6. Patent №2451333, 2007. The device and ways of formation of images for capture and the analysis of digital images of a skin. P. Gjeffri., P.Gregori., K. Nikiforos., D. Dic., R. Eduardo.
7. Fradkin V.A. Diagnostic and medical allergens. - M.: Medicine 1990. - P. 51-58.
8. Automated measurement of skin prick tests an advance towards exact calculation of wheal size. Experimental Dermatology 2006; 15; 119-124. Wohrl S., Vigl K, Binder M., Stringl G, Prinz M.
9. Chambers, M.A. Simple objective measurement of the cutaneous delayed-type hypersensitivity reaction to tuberculin using spectrophotometry / M.A. Chambers, K. Jahans, A. Whelan // Skin Res Technol. -2002. May- 8 (2). - S.89-93.
10. Practical Imaging in Dermatology. Ville Voipio, Heikki Huttunen, Heikki Forsvik., 2012. www.intechopen.com.
