CC BY
28
11. Bovine Tuberculosis Eradication: Uniform Methods and Rules / United States Depar-tament of Agriculture // Animal and Plant Health Ispection Servise. - Washington, D.C., USA, 1999. - 34 p.
12. Dubos, R. The White Plague: Tuberculosis, Man, and Society / R. Dubos, J. Dubos. - Boston: Little-Brown, 1952. - 676 p.
13. Faulder, E.T. Bovine Tuberculosis: Its Hystory, Control and Eradication / E.T. Faulder // New York State Departament of Agriculture and Marcets Bulletin. - 1928. -№ 218. - P. 23-28.
14. Mainning, E.J.B. Mycobacterial infections in domestic and wild animals / E.J.B. Mainning, M.T. Collins // Rev. sci. thech. Off. Int. Epiz. - 2001. - Vol. 20. - № 1. -P. 23-80.
15. Risk factors for bovine Tuberculosis at the national level in Great Britain / Paul R. Bes-sell [et al.] // Veterinary Research. - 2012. - Vol. 7. - P. 121-124.
16. The importance of Mycobacterium bovis as a zoonosis / C. Thoen [et al.] // Veterinary Microbiology. - 2006. - Vol. 112. - № 2/4. - P. 339-345.
УДК 619:616.98:579.873.21-07
ОЦЕНКА СТАНДАРТНОСТИ СЕРИЙ ТУБЕРКУЛИНА ОЧИЩЕННОГО ПО МОЛЕКУЛЯРНОМУ СОСТАВУ
А.Н. ПРИТЫЧЕНКО УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины» г. Витебск, Республика Беларусь, 210026
(Поступила в редакцию 10.01.2013)
Введение. Туберкулез остается ключевой проблемой в инфекционной патологии человека и животных. Эпизоотическая и эпидемическая ситуация по туберкулезу в нашей стране остается сложной.
Туберкулез чаще встречается среди крупного рогатого скота. В нашей стране поддерживается благополучие по туберкулезу крупного рогатого скота посредством проведения плановых массовых мероприятий [15].
Одним из ведущих методов поддержания благополучия по туберкулезу в стране является аллергическая проба с туберкулином. Выпуск препарата в настоящее время налажен на ОАО «БелВитунифарм».
Туберкулин представляет собой сложную смесь водорастворимых антигенов микобактерий туберкулеза, выращенных на жидкой питательной среде, инактивированных высокой температурой. Существует несколько разновидностей туберкулинов: альттуберкулины, HCSM (безальбумозные) и PPD (purified protein derivative, ППД) - туберкули-ны, которые получают по разным технологиям [6, 7, 15].
В 1890 г. R. Koch (Р. Кох) получил фильтрат кипяченой взвеси туберкулезных бактерий, под названием «туберкулин». Препарат предназначался для лечения туберкулеза. В последующем Koch получал туберкулин, выращивая МБТ на мясопептонном глицериновом бульоне 8-9 недель. Возбудитель инактивировался автоклавированием (121 °С 30-60 мин), бактериальная масса отделялась фильтрованием, а
полученный фильтрат выпаривался при температуре 80 °С до 1/10 первоначального объема [4]. Впоследствии такой препарат получил название «альттуберкулин Коха» (АТК).
АТК широко и успешно применялся для диагностики туберкулеза человека и животных [3, 9, 15]. Недостатком было присутствие в его составе концентрированных компонентов питательной среды, что затрудняло стандартизацию и обусловливало высокую реактогенность. С другой стороны, наличие примесей и высокая концентрация глицерина способствовали стабильности АТК и сохранению активности в течение 5-10 лет [18].
Технология получения АТК предусматривала концентрирование культурального фильтрата при повышенной температуре. Именно на этой стадии терялось значительное количество туберкулиноактивных веществ за счет денатурации и испарения. Это влияло на диагностическую эффективность и повышало стоимость препарата [7].
С учетом того что АТК невозможно стандартизировать по концентрации туберкулопротеинов, его стандартизировали по активности на зараженных животных относительно международного стандарта АТК с активностью 90000 МЕ в 1 мл [23].
С 70-х г. прошлого века АТК не используют для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.
Для выяснения природы и получения очищенных туберкулиноактивных компонентов в 20-30-е г. прошлого века начали использовать осаждение сульфатом аммония, этанолом, кислотами, электрофорез и ультрацентрифугирование [12]. В 1934 г. F. Seibert путем пятикратного переосаждения туберкулопротеинов из автоклавированного культу-рального фильтрата полунасыщенным раствором СА получила препараты, названные purified protein derivative (PPD) [22]. На основе этого метода была разработана соответствующая технология и создан американский туберкулин и стандарт PpD-S. В 1946 г. Н. Green предложил для осаждения туберкулопротеинов трихлоруксусную кислоту (ТХУ) [20, 22].
Институтом Пастера (Франция) разработан метод получения ППД I. Р. 48 с помощью осаждения туберкулопротеинов салициловой кислотой при рН 4,4 с последующим высушиванием ацетоном и переосаждением 95°-ным этанолом. Для осаждения туберкулопротеинов применялись и другие химические вещества, например, 0-аминофенол-диазониумхлорид, что повышало содержание азота в туберкулине до 10 % и его аллергическую активность [5].
Признано, что технологии получения ППД с многократным переосаждением туберкулопротеинов с обработкой органическими растворителями повышают выход белка. Однако на каждой стадии происходит значительная потеря активных компонентов, что с учетом технологических затрат существенно увеличивает стоимость конечного продукта [10]. Это не играет роли, если туберкулины предназначены для медицинских целей, где используются дозы 2-100 МЕ и нет необ-
307
ходимости наработки значительной массы туберкулопротеинов. В ветеринарной практике применяют гораздо большие дозы (500010000 МЕ), поэтому потери активных веществ при многократном переосаждении существенно повышают стоимость препарата. Кроме того, целесообразность применения высокоочищенных туберкулинов проблематична, так как убедительно не доказано, что по диагностическим свойствам они лучше АТК или HCSM [3, 8].
А.М. Говоров и Ф.И. Осташко [6] в 1956 г. разработали технологию приготовления ППД-туберкулина, включающую осаждение туберкуло-протеинов ТХУ и переосаждение сульфатом аммония. Почти без изменений она используется на Курской биофабрике. M. bovis 8 выращивают на синтетической питательной среде (6-8 недель при 37 оС), автокла-вируют (30 мин при 120 оС), культуральную жидкость фильтруют. Ту-беркулопротеины осаждают ТХУ (6-8 %), растворяют в дистиллированной воде, повторно переосаждают полунасыщенным СА, который удаляют диализом [3]. Получаемый ППД-туберкулин содержит 73,480 % белка, 4-5 % полисахаридов, 1-2 % нуклеиновых кислот и до 11 % липидов.
По данным А.Н. Шарова (1990), преципитация белков культураль-ной жидкости ТХУ и СА уменьшает отношение количества белка к сухому веществу с 1:37 до 1:1,26, а также повышает видовую специфичность ППД-туберкулина [17]. Недостаток такой технологии - потеря активных туберкулопротеинов при осаждении ТХУ (до 32 %), СА (до 40 %), при диализе - 4 %. Кроме того, дегидратанты (ТХУ, СА) уменьшают гидрофильность белковых мицелл, что способствует образованию высокомолекулярных агрегатов, снижающих специфичность туберкулина [12].
Технология получения ППД-туберкулина Курской биофабрики совершенствовалась В.М. Безгиным, Н.В. Безгиной и В.Е. Козловым [3, 11], применившими ультрафильтрацию на мембранах РТНК с отсекающим эффектом 100 kDa и ВПУ-15ПА 15 kDa, что позволило получить ППД с диапазоном размера молекул 100-15 kDa [2]. Однако такой вариант не был окончательно внедрен [3, 10]. Ультрафильтрация на мембранах ВПУ-15ПА использовалась для концентрирования куль-турального фильтрата перед осаждением ТХУ и удаления СА после переосаждения туберкулопротеинов [10]. Это позволило сократить объемы использования токсичной ТХУ и уменьшить потери при диализе.
Разработка технологий получения ППД-туберкулинов рассматривалась как мера повышения качества диагностикума. Но по мере использования ППД на практике выяснилось, что заметных преимуществ перед менее очищенными препаратами он не имеет [14]. Сравнение ППД- и HCSM-туберкулинов в полевых опытах на крупном рогатом скоте показало, что чувствительность HCSM была выше (87,9 %), чем ППД (81,9 %). Специфичность ППД составила 96,3 %, а HCSM -90,8 % [13], но при выравнивании активности небольшая разница в
специфичности исчезала. Примерно такая же закономерность была установлена при сравнении высокоочищенного туберкулина I.P. 48 (Институт Пастера, Франция) и альттуберкулина Коха [5].
Наиболее перспективной разновидностью туберкулинов является HCSM-туберкулин. Р. Кохом была предпринята одна из первых попыток избавить туберкулин от примесей питательной среды за счет использования сред без пептонов и альбумоз (Albumosfrei) или осаждения активных веществ [18]. Были разработаны питательные среды (Sauton, Dorset, Long, Моделя), не содержащие белков и пептидов [19].
Туберкулины, изготовленные по технологии АТК, но с применением безбелковой среды, получил название HCSM (heat culture syntetic medium - гретый культуральный фильтрат синтетической питательной среды) [5, 15]. HCSM содержал продукты автолиза МБТ и небелковые компонентов питательной среды, что позволило стандартизировать его по концентрации туберкулопротеинов и снизило реактогенность [15].
Туберкулины HCSM, в частности «Introvac poly» фирмы «Miffa Merieux», использовались в программах ликвидации туберкулеза разных стран. Directive 80/219 EEC и OIE Mannual of Diagnostic Tests [21] разрешает применение HCSM наравне с ППД.
Недостатком традиционной технологии изготовления HCSM, так же как и АТК, является концентрирование при высокой температуре, что приводит к потерям активных веществ и снижению их специфичности.
Туберкулиноактивные вещества появляются в культуральной жидкости в результате секреции белков и автолиза части клеток в период роста. Количество таких туберкулиноактивных веществ не велико -0,1-0,2 мг/мл. Основная масса туберкулиноактивных веществ появляется в культуральной жидкости из-за автолиза бактериальной массы при автоклавировании [8, 12]. Считается, что туберкулиновая активность присуща белкам и полипептидам микобактерий, хотя полисахариды, липиды, фосфатиды, имеющие полипептидные фрагменты, также могут обладать ею [8, 16].
Основные требования к производству туберкулинов определены ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения) и МЭБ (Международное эпизоотическое бюро). Они касаются терминологии, штаммов-продуцентов, безопасности производства и конечного продукта, а также обеспечения его соответствия международному эталону [21].
В этой связи перспективным направлением является совершенствование технологии производства туберкулина и оценка его биологических и физико-химических свойств.
Цель работы - изучить стандартность серий туберкулина очищенного для млекопитающих производства ОАО «БелВитунифарм» по молекулярному составу.
Материал и методика исследований. Работа выполнена на кафедре микробиологии и вирусологии УО «ВГАВМ», УП «Витебская
309
биофабрика», в отделе зоонозов и разработки диагностических препаратов РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вы-шелесского».
Для сравнения молекулярного состава стандартные растворы контрольных серий ТО № 37, 66 и 74 фракционировали на хроматографи-ческой системе Biologic LP (BioRad) методом жидкостной ионообменной хроматографии на колонке MonoQ в линейном градиенте 0-2 M раствора NaCl. Контролями служили автклавированный культураль-ный фильтрат производственного штамма M. bovis 8 и стандартный раствор ППД-туберкулина Курской биофабрики.
В работе использовали штамм Mycobacterium bovis 8 (КМИЭВ № 9). Штаммы поддерживали на среде Гельберга, пересевая через 6 месяцев. Для накопления туберкулопротеинов штаммы выращивали на жидкой синтетической среде Сотона 8-9 недель при 37 °С.
Морфологические, культуральные свойства M. bovis 8 изучали путем посева суспензий на среду Гельберга и МПА с инкубацией при температуре 20, 37 и 45 °С. Из культур готовили препараты-мазки, которые окрашивали по Цилю-Нильсену.
Получение культурального фильтрата производили путем посева производственного штамма M. bovis 8 на среду Сотона, выращивали 8 недель при 37 °С. Часть посевов инактивировали фенолом (3 %), часть автоклавировали в течение 30 мин при 121 °С. Для удаления бакмассы культуральную жидкость фильтровали через бумажный фильтр и пластины «Владипор» или 0,22 мк Durapore®.
Результаты исследований и их обсуждение. Установлено, что профили элюции ТО всех исследованных серий состояли из одной основной и четырех минорных фракций (рис. 1-4). Высота, форма и положение в хромотограмме основного пика были одинаковыми у всех серий. Высота минорных фракций варьировала незначительно.
Сравнение профилей ТО с профилем авткоклавированного культу-рального фильтрата производственного штамма M. bovis 8 показало отличия в белковом составе основной фракции. У культурального фильтрата она имела три пика, сливающихся в единое целое (рис. 1). У ТО основная фракция была представлена цельным симметричным пиком. Это указывало на то, что в процессе получения и очистки ТО при ультрафильтрации удалялась часть фракций с большой молекулярной массой, но относительно низким электростатическим зарядом.
ППД-туберкулин имел в профиле элюции одну основную фракцию, аналогичную по форме, высоте и положению основной фракции ТО (рис. 5), и одну минорную фракцию в начале профиля элюции, соответствующую таковой фракции в составе ТО.
Рис. 2. Профиль элюции ТО серии 37
Рис. 3. Профиль элюции ТО серии 66
Рис. 4. Профиль элюции ТО серии 74
Рис.5. Профиль элюции стандартного раствора ППД-туберкулина Курской биофабрики
Заключение. Серии туберкулина очищенного, полученные в разные годы, имеют, по данным ионообменной хроматографии низкого давления, близкий молекулярный состав, причем основная масса белков по физико-химическим свойствам соответствует таковым в ППД-туберкулине.
ЛИТЕРАТУРА
1. Авербах, М.М. Иммунология и иммунопатология туберкулеза / М.М. Авербах. - М.: Медицина, 1976. - 312 с.
2. Аллерген для диагностики туберкулёза и способ его получения: пат. (13) С (19) RU (11) 2045959 (51) 6. А 61. К 39/04, 39/35 / Н.С. Шевырев, В.М. Безгин, В.Е. Козлов [и др.]; Курская биофабрика. - 92014623/13; заявл. 25.12.92.; опубл. 20.10.95 // Описание изобретения. - 1995. - Бюл. № 29. - С. 9.
3. Безгин, В.М. Совершенствование промышленной технологии (ППД) туберкулина и его биохимическая характеристика: автореф. дис. ... канд. вет. наук; 16. 00.03 /
B.М. Безгин; ВАСХНИЛ. - М., 1990. - 27 с.
4. Биологическая активность препаратов туберкулинов, приготовленных разными методами / Т.П. Новик [и др.] // Эпизоотология. Иммунобиология. Фармакология. Санитария. - 2009. - № 2. - С. 99-106.
5. Василев, В.Н. Микобактериозы и микозы легких / В.Н. Василев. - София: Медицина и физкультура, 1971. - С. 9-13, 30-37, 42-53, 181-202, 205-227, 231-271.
6. Говоров, А.М. Получение и производственное испытание сухого туберкуло-протеина / А.М. Говоров, Ф.И. Осташко // Сб. науч. тр.; ВИЭВ. - М.,1956. - Т. 23. -
C.101-111.
7. Донченко, А. С. Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота / А.С. Дон-ченко, Н.П. Овдиенко, Н.А. Донченко / Ин-т экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока. - Новосибирск, 2004. - 309 с.
8. Донченко, Н.А. Усовершенствование средств и методов диагностики и профилактики туберкулеза крупного рогатого скота: автореф. дис. ... д-ра вет. наук; 16.00.03, 16.00.04 / Н.А. Донченко; ГНУ Ин-т экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН. - Новосибирск, 2008. - 36 с.
9. Евглевский, А.А. Совершенствование аллергической диагностики и специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота: автореф. дис. ... канд. вет. наук; 16.00.03 / А.А. Евглевский; Воронеж. гос. аграр. ун-т. - Воронеж, 1992. - 26 с.
10. Кассич, Ю.Я. Комлексная диагностика туберкулеза / Ю.Я. Кассич, А.Т. Бор-зяк // Ветеринария. - 1985. - № 4. - С. 28-29.
11. Козлов, В.Е. Аллергены для диагностики туберкулеза: совершенствование производства и стандартизация: автореф. дис. ... д-ра биол. наук; 16.00.03; 03.00.23 / В.Е. Козлов; ФГУ Всерос. гос. Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов. - М., 2007. - 43 с.
12. Л ы с е н к о , А . П . Результаты сравнительного испытания туберкулинов, изготовленных разными способами / А.П. Лысенко, А.Н. Притыченко // Ученые записки ВГАВМ. - Витебск, 1999. - Т. 35. - Ч. 1. - С. 253.
13. Найманов, А. Х. Сравнительное изучение внутрикожного и глазного методов применения ППД-туберкулина для млекопитающих / А.Х. Найманов // Проблемы профилактики и борьбы с туберкулезом и бруцеллезом животных: Бюл. ВИЭВ. - М., 1981. - Т. 43. - С. 12-16.
14. Овдиенко, Н. П. Сравнительное испытание туберкулинов для млекопитающих и для птиц на крупном рогатом скоте / Н.П. Овдиенко, В.Е. Щуревский, А.Х. Найманов // Труды ВИЭВ. - М., 1980. - Т. 62. - С. 8-20.
15. Притыченко, А.Н. Туберкулин очищенный для млекопитающих (оптимизация очистки, диагностические и иммунохимические свойства): автореф. дис. ... канд. вет. наук; 16.00.03 / А.Н. Притыченко; БНИИ экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского. - Минск, 2002. - 17 с.
16. Румачик, И.И. Парааллергические реакции на туберкулин у коров в благополучных по туберкулезу хозяйствах и их дифференциация / И.И. Румачик // Ветеринарная наука - производству: науч. тр. / НАН Беларуси, РНИУП Ин-т экспериментальной ветеринарии им. С.И. Вышелесского НАН Беларуси. - Минск, 2005. - Вып. 38. - С. 445-447.
17. Шаров, А.Н. Аллергическая диагностика туберкулеза у животных: повышение ее эффективности: автореф. дис. ... д-ра вет. наук; 16.00.03 / А.Н. Шаров; Всесоюз. ин-т экспериментальной ветеринарии. - М., 1989. - С. 9-10, 32-34.
18. Эбер, А. Прививка туберкулина. Борьба с туберкулезом рогатого скота: научные исследования и практические опыты / А. Эбер. - СПб: Тип. училища глухонемых, 1900. - 56 с.
19. Dixie, E. The tuberculin Skin Test / E. Dixie, J.R. Snider // Am. Rev. Resp. Dis. -1982. - Vol. 102. - № 3. - P. 2, 8, 108-118.
20. Green, H.H. Description and preparation of Weybridge purified protein derivative tuberculins / H.H. Green // World Helth Organization Monography Series. - 1953. - Vol. 19. -P. 45-54.
21. OIE Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals // Fifth Edition. -2004. - Vol. 1. - P. 723.
22. Seibert, F.B. A study of certein problems in the use of standard tuberculin, fractionation of PPD, standardization of tuberculins, and the question of sensitization / F.B. Seibert, E.H. Dufour // American Review of Tuberculosis. - 1948. - Vol. 35. - P. 363-364.
23. World Health Organization (WHO) Requirements for Biological Substances No. 16, Annex: Requirement for Tuberculins: technical Report Series № 745. - WHO, Geneva, 1987. -P. 31-59.
УДК 619:615.37:615.9:636.028
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КОМПЛЕКСНОГО ИНТЕРФЕРОНСОДЕРЖАЩЕГО ПРЕПАРАТА
П.А. КРАСОЧКО РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского НАН Беларуси» г. Минск, Республика Беларусь, 220003 И.В. ЧУЕНКО
УО «Гродненский государственный аграрный университет» г. Гродно, Республика Беларусь, 230008
(Поступила в редакцию 19.01.2013)
Введение. При современном ведении животноводства на фоне неблагоприятных условий содержания и кормления животных, загрязнений внешней среды, постоянного стрессового состояния иммунитета возникает иммунодепрессия, что приводит к ослаблению устойчивости организма к воздействию патогенной и условно-патогенной микрофлоры вирусно-бактериального происхождения. Ослабленная иммунная система и высокая степень инфицированности животных возбудителями инфекционных заболеваний ведут к повышенной заболеваемости и высокому непроизводительному выбытию сельскохозяйственных животных [5].
Широкое распространение инфекционных заболеваний, особенно респираторных инфекций, крупного рогатого скота в животноводче-
314
