CC BY
20
УДК 619:616-07;619:579.62
ОЦЕНКА МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА АЛЛЕРГЕНОВ МИКОБАКТЕРИЙ M. AVIUM-INTRACELLULARE И M. SCROFULACEUM
МЯСОЕДОВ Ю.М.,
кандидат биологических наук, ФКП «Курская биофабрика»; e-mail: MyasoedovYurij@yandex.ru.
Реферат. Дифференциальные исследования на туберкулёз в РФ осуществляют с использованием ППД для млекопитающих и аллергенов, изготовленных с использованием микобактерий комплекса M. avium-inracellulare и M. scrofulaceum. Диагностическая эффективность аллергических методов исследований зависит от параметров качества аллергенов, которые напрямую определяются технологией производства. Промышленный метод изготовления аллергенов из микобактерий 2 и 3 групп был предложен более 70 лет назад и постоянно совершенствовался. Предложенные изменения в основном были направлены на снижение содержания в препаратах балластных и неспецифических соединений, а также на разработку новых методов контроля. Целью обзора является оценка методов контроля качества микобактериальных аллергенов, изготавливаемых с использованием микобактерий комплекса M. avium-inracellulare и M. scrofulaceum. Для оценки методов контроля аллергенов изготавливаемых с использованием микобактерий 2 и 3 групп использована отечественная и международная нормативная документация периода 1968 - 2015 гг. Совокупность методов контроля качества микобактериальных аллергенов можно подразделить на 3 группы: 1. Методы контроля физических параметров. 2. Методы контроля химических параметров. 3. Методы контроля биологических параметров. Анализ методов контроля, изложенный в нормативной документации, продемонстрировал, что методические подходы претерпели значительные изменения, что с одной стороны связано с совершенствованием технологии производства, а с другой стороны с формированием современной международной нормативной базы, определяющей качество препаратов. В настоящее время методы контроля качества микобактериальных аллергенов являются стандартизированными, что позволяет всесторонне исследовать свойства препаратов и выпускать качественные диагностикумы.
Ключевые слова: методы, активность, специфичность, туберкулины, морские свинки.
QUALITY CONTROL METHODS FOR ASSESSMENT OF ALLERGENS MYCOBACTERIA M. AVIUM-INTRACELLULARE AND M. SCROFULACEUM
MYASOEDOV Y.M.,
Candidate of Biology Sciences, Kursk biofactory; e-mail: MyasoedovYurij@yandex.ru.
Essay. Differential studies in tuberculosis are performed with using PPD for mammals and allergens produced of complex mycobacteria M. avium- intracelulare and M. scrofulaceum. The diagnostic efficiency allergy methods research depends on the quality parameters of allergens, which are directly determined by the production technology. Industrial method of manufacturing allergens from mycobacteria Groups 2 and 3 was proposed over 70 years ago and constantly improved. The proposed changes were aimed at reducing of non-specific drugs and ballast compounds content and the development of new control methods. The review purpose is the quality control methods of mycobacterial allergens manufactured from mycobacterium complex M. avium- intracellulare and M. scrofulaceum. To assess the allergens methods control of produced with using Mycobacterium the 2 and 3 group domestic and international regulatory documents for 1968-2015 years were used. The set of methods quality control of mycobacterial allergens can be divided into 3 groups: 1. Methods of physical parameters monitoring; 2. Methods of chemical parameters monitoring; 3. Methods of biological parameters monitoring. Methods control analysis showed that the methodological ways of studies have been changed. At first it depends an the technology improvement, at second it depends on the forming of a modern international regulatory base which defined the products quality. Nowdays control quality methods of mycobacterial allergens are considered to be stadartizated. It helps to fully observe the drugs properties and to produce highly quality diagnostics.
Key words: methods, activity, specificity, PPD tuberculins, guinea pigs.
Введение. Эффективным методом диагностики туберкулёза животных является аллергический тест, основанный на использовании ППД туберкулинов [17]. Несмотря на успехи, достигнутые в борьбе с туберкулёзной инфекцией, в последние десятилетия в популяциях сельскохозяйственных животных повсеместно регистрируются не специфические реакции на туберкулины, опосредованные изменением микробиоценоза и расширением ареала распространения атипичных форм микобактерий [8].
Для проведения дифференциально-диагностических исследований на туберкулёз, в Российской Федерации применяют ППД туберкулин для млекопитающих и аллергены, изготовленные с использованием микобактерий комплекса M. avшm-шracellulare, а также M. scrofulaceum
[1, 5, 6, 7]. Использование в диагностических целях аллергенов из атипичных микобактерий обусловлено широким их распространением.
Диагностическая эффективность аллергических, дифференциальных исследований в условиях животноводческих комплексов и фермерских хозяйств зависит от параметров качества аллергенов, которые напрямую определяются технологией производства [17, 19, 20]. Технология изготовления аллергенов с использованием микобактерий 2 и 3 групп была разработана более 70 лет назад и совершенствовалась от производства препарата, содержащего балластные соединения к высокоочищенному варианту [17], что сопровождалось изменением используемых в разработке новых методов контроля [20]. В свою очередь осуществление системного анализа методов контроля,
исторически принятых в мировой практике, является критерием качества производимых аллергодиагностикумов. Целью обзора является оценка методов контроля качества аллергенов из микобактерий комплекса M. avшm-
mracelШare и M. scroíulaceum.
Качественные и количественные показатели аллергенов, изготовленных из микобактерий комплекса М. avium-тгасеИШаге и М. scroíulaceum представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Методы контроля качества аллергенов, изготовленных с использованием микобактерий комплекса М. avшm-imнceИulare и М. scroíulaceum
Параметр Аллергены, изготавливаемые с использованием М. avium Аллергены, изготавливаемые с использованием М. ¿атасеНи^е и М. crofulaceum
Нормативный документ Нормативный документ
ГОСТ 13909-68 ТУ 46-876-73 ГОСТ 23881-79 СТО 004829090011-2011 ГОСТ 32306-2013 ТУ 10-19-518-87 СТО 004829090021-2006
Наименование аллергена Туберкулин для птиц Туберкулин сухой очищенный (ППД) для птиц Туберкулин сухой очищенный (ППД) для птиц Туберкулин очищенный (ППД) для птиц Туберкулин очищенный (ППД) для птиц Аллерген сухой очищенный комплексный из атипичных микобактерий (КАМ) Аллерген очищенный комплексный из атипичных микобактерий (КАМ)
Форма выпуска р/р. с/м. с/м. с/м. р/р. с/м. р/р. с/м. с/м. р/р.
Внешний вид + + + + + + + + + +
Наличие вакуума в ампулах - + - + - + - - + -
Растворимость - + + + - + - + + -
Однородность раствора - - + + - + - - + -
Концентрация водородных ионов + + + + + + + + + +
Количество белка мг/см3 - - - + + + + - - +
Массовая доля белка, % - + + - - - - + - -
Массовая доля хлористого натрия, % - - - - + - + - - +
Массовая доля фенола, % - - - - + - + - - +
Массовая доля глицерина, % - - - - + - + - - +
Специфическая безвредность - - - + + + + - - -
Активность + + + + + + + + + +
Специфичность + + + + + + + - + +
Стерильность + + + + + + + + + +
Безвредность - + + - - + + - - -
Сенсибилизирующие свойства - + + + + + + - + +
Реактогенность - - - + + + + + + +
Токсичность - - - + + - - - - -
Видовая специфичность - - - - - - - + - -
Суммарное значение используемых методов 4 10 11 13 13 13 13 8 10 11
Примечание: - тест не предусмотрен для препарата;
+ - тест предусмотрен для препарата; с/м - сублимированный; р/р - раствор.
Совокупность методов контроля качества микобак-териальных аллергенов можно классифицировать в 3 группы: 1. Методы контроля физических параметров (внешний вид, наличие вакуума в ампулах, растворимость, однородность раствора). 2. Методы контроля химических параметров (концентрация водородных ионов, количество белка мг/см3, массовая доля белка %, массовая доля хлористого натрия %, массовая доля фенола %, массовая доля глицерина %). 3. Методы контроля биологических параметров (специфическая безвредность, активность, специфичность, стерильность, безвредность, сенсибилизирующие свойства, реакто-генность, токсичность, видовая специфичность).
Методы определения физических показателей качества
Внешний вид. Микобактериальные аллергены первоначально производили в жидкой форме по технологии, предложенной Р. Кохом. С совершенствованием технологии изготовления и разработки очищенной формы, туберкулины стали производить в сублимированном, а позднее и в жидком виде [3]. Оценка внешнего вида предусмотрена для сублимированной и жидкой форм. Определение внешнего вида сублимированных препаратов позволяет оценить форму, цвет, структуру, точность фасовки [1, 5-7, 13-16, 20]. Сублимированные препараты должны представлять пористую аморфную массу светло-коричневого цвета с серым оттенком, без плесени и примесей [1, 6, 7, 13, 14, 16]. Определение внешнего вида растворов аллергенов осуществляется в проходящем свете, встряхиванием флаконов и последующим просмотром содержимого, что позволяет выявить: механические включения неорганической и органической природы, а также определить цвет. Туберкулин для птиц, изготовленный по методу Коха (альт-туберкулин Коха) представляет собой прозрачную, просвечивающуюся в проходящем свете, маслянистую жидкость, характерного запаха, от коричневого до тёмно-коричневого цвета, без механической примеси, плесени, осадка, хлопьев, помутнения [5]. Стандартный раствор туберкулина очищенного (ППД) для птиц и КАМ представляет собой прозрачную жидкость светло-коричневого цвета без осадка [7, 13, 14].
Наличие вакуума в ампулах. Показатель регламентирован для препаратов выпускаемых в сублимированном виде и вводится в список методов контроля с появлением очищенной субстанции. Наличие вакуума в ампулах определяется в высокочастотном электромагнитном поле, с помощью аппарата Дарсонваль, по характерному фиолетово-синему свечению, сопровождающемуся характерными микро разрядами [7, 13, 14, 16].
Растворимость. Критерий разработан для препаратов, представленных в сублимированной форме, и предполагает определение периода времени полного растворения сухой массы в растворителе микобактери-альных аллергенов. Временной интервал растворимости препаратов не должен превышать 3 минуты [1, 6, 7, 13, 14, 16].
Однородность в растворе. Определение параметра осуществляется после растворения аллергена в растворителе и позволяет оценить гомогенность раствора [6, 7, 13, 14].
Методы контроля химических показателей качества
Концентрация водородных ионов (рН). Нормирование аллергенов по рН является первым этапом, позволившим разработать методы аллергического теста с конъюнктивальным и внутривенным введением тубер-
кулинов. Определение показателя предусмотрено для жидких и сублимированных форм аллергенов (после растворения в растворителе микобактериальных аллергенов). Оптимальные значения рН должны соответствовать пределу от 6,5 до 7,8; изучение показателя осуществляется потенциометрически [1, 6, 7, 13, 14, 16].
Количество белка мг/см . В анализируемых документах концентрация белка оценивается в мг/см3 и %. Согласно ГОСТ 23881-79 содержание белка в туберкулине ППД для птиц, должно быть не менее 60 % [6]. Согласно ТУ 10-19-518-87 в препарате КАМ массовая доля белка должна составлять 80±20 % [1]. В нормативных документах, используемых в настоящее время, количество белка выражено только в мг/см3. Так содержание белка в ППД туберкулине для птиц должно составлять 0,5±0,1 мг/см3 [13]. В препарате КАМ (жидкая форма) концентрация белка должно быть не более 1,4 мг/см3. Оценка показателя осуществляется методом Кьельдаля или спектрофотометрически [14].
Массовая доля хлористого натрия. Нормирование растворов микобактериальных аллергенов по содержанию хлористого натрия явилось вторым этапом в разработке конъюнктивального и внутривенного методов аллергического теста. Содержание натрия хлорида должно быть в пределах 0,85±0,05 %. Определение показателя осуществляется для растворов препаратов, титрованием 0,1 М раствором азотнокислого серебра [7, 13, 14].
Массовая доля фенола. Использование фенола в составе диагностической формы позволяет снизить жизнеспособность микроорганизмов, обсеменяющих вскрытую стерильную тару с препаратом, в условиях большой обсемененности животноводческих помещений [8]. Определение показателя осуществляется титрованием аллергена 0,05 М раствором тиосульфата натрия. Содержание фенола в препарате не должно превышать 0,5 % [7, 13, 14].
Массовая доля глицерина. Использование глицерина в составе диагностической формы аллергена позволяет нивелировать сорбционную способность поверхностью стекла биологически активных микобактериальных антигенов, и таким образом, стабилизировать препарат в течение всего периода хранения. Определение массовой доли глицерина осуществляется по плотности раствора, при помощи ареометра. Массовая доля глицерина в препарате должна соответствовать 10,0±1 % [7, 13, 14].
Методы контроля биологических показателей качества
Специфическая безвредность. Тест позволяет выявлять жизнеспособные микобактерии, гипотетически сохранившиеся в готовом препарате (регламентирован в отношении ППД для птиц). Методика предполагает внутривенное «заражение» исследуемым аллергеном кроликов (восприимчивая животная модель к микобак-териям птичьего вида), с последующим проведением через 43 дня аллергического, патологоанатомического и бактериологического исследований. Препарат считается специфически безвредным, если животные остаются живыми в период наблюдения, отсутствуют реакции на внутрикожное введение ППД для птиц, а при осуществлении дополнительных исследований, микобактерии не выявляются [7, 13].
Активность. Метод позволяет оценить содержание единиц действия в объёме препарата. Определение активности микобактериальных аллергенов является одним из первых методов контроля, претерпевшим наибольшие изменения, совпадающие с совершенствованием технологии производства. Так, например, согласно
ГОСТ 13909-68, оценка активности туберкулина для птиц осуществляется на курах, больных туберкулёзом. Для постановки теста используют 15 кур, внутримышечно инфицируют вирулентной туберкулёзной культурой птичьего вида (доза 10-20 мг). Через 30 дней, каждой курице, в одну из бородок внутрикожно вводят 0,1 мл испытуемого, а в противоположную - 0,1 мл контрольного туберкулина. Учёт реакции осуществляют через 24-48 часов, после первого введения и через 24 часа после второго. Повторно туберкулин вводят спустя 96 часов после первой инъекции. Активность туберкулина оценивается визуально (положительный результат - бородки отёчно-припухшие, красноватые, горячие на ощупь, утолщены, тестоообразны, отвисают вниз, увеличены в 2-3 раза; сомнительная реакция -припухлость незначительная; отрицательная реакция -бородки нормальные, на месте введения туберкулина изменений нет) [5]. Описанная методика позволяет проводить только качественную оценку активности туберкулина. Количественная оценка активности туберкулина для птиц на курах инфицированных (или сенсибилизированных) микобактериями туберкулёза до настоящего времени не разработана.
Определение активности туберкулина сухого очищенного (ППД) для птиц согласно ТУ 46-876-73, предполагает использование сенсибилизированных морских свинок и инфицированных кур. Определение активности аллергена из микобактерий птичьего вида на туберкулёзных курах методически предполагает инфицирование птицы M. avium (аналогично ГОСТ 13909-68), при использовании исследуемого и контрольного ту-беркулинов в дозах 0,05 мг/ 0,1 см3. Учёт реакции осуществляется через 30 -36 часов после введения препаратов по критерию выраженности реакции [16].
Изучение активности препарата на морских свинках, предполагает их предварительную сенсибилизацию (5-10 голов) микобактериями птичьего вида. После развития состояния ПЧЗТ животным внутрикожно вводят испытуемой туберкулин в дозах 0,0001; 0,0005 и 0,0025 мг в объёме 0,1 мл растворителя, а туберкулин контрольной серии в дозах 5, 25 и 125 ТЕ в объёме 0,1 мл растворителя. Активность туберкулина в ТЕ определяют пропорцией интенсивности кожной реакции ПЧЗТ на введение стандартной и испытуемой серий туберкулина [16].
Оценка биологической активности ППД туберкулина для птиц, согласно ГОСТ 23881-79, осуществляется на больных туберкулёзом курах, и сенсибилизированных морских свинках. Определение биологической активности на курах, больных туберкулёзом, проводится аналогично ТУ 46-876-73. Исследования на морских свинках предполагают сенсибилизацию животных ми-кобактериями туберкулёза птичьего вида, в дозе 3 -4 мг влажной массы. При постановке теста используют по два разведения испытуемого и контрольного препаратов. Расчёт активности осуществляется пропорцией [6].
Согласно СТО 00482909 -0011-2011 и ГОСТ 323062013 определение активности туберкулина очищенного ППД для птиц проводится только на морских свинках, сенсибилизированных M. avium (дозе микобактерий 3 -4 мг). В исследовании применяют по 3 разведения испытуемого и контрольного препаратов. При учёте реакций используют только тех животных, у которых размер реакции ПЧЗТ соответствует от 8 до 25 мм. Расчёт активности в отличии от ГОСТ 23881-79 осуществляют по статистическим формулам, рекомендованным ВОЗ [17].
Определение биологической активности аллергена сухого очищенного, комплексного из атипичных микобактерий согласно ТУ 10-19-518-87 проводится на морских свинках, сенсибилизированных смесью атипичных микобактерий (в дозе 0,5 мг каждого штамма в объёме 0,5 мл физ. раствора). При проведении теста используют не менее 10 животных. Введение разведений (100 ЕД/0,1см и 10 ЕД/0,1см3) аллергенов опытной и контрольной серии осуществляют согласно схеме полного латинского квадрата. Для проведения расчётов учитывают реакции размером более 5 мм. Количество единиц в растворе определяется пропорцией значений сумм реакций на исследуемый и контрольный препараты [1].
Согласно СТО 00482909-0021-2006, определение активности КАМ осуществляют аналогично ТУ 10-19518-87, за исключением использования трёх дозировок (125, 25 и 5 ЕД) испытуемого и контрольного препаратов. Расчёт активности проводится по стандартным формулам, рекомендованным МЭБ [14].
Специфичность. Параметр специфичность туберкулина для птиц ГОСТ 13909-68 оценивается на курах, больных туберкулёзом, и характеризует способность аллергена вызывать аллергическую реакцию у больных туберкулёзом кур. Методически тест осуществляется введением в разные бородки диагностической дозы (0,1 см3) испытуемого и контрольного препаратов. Специфичный препарат характеризуется выраженной аллергической реакцией, аналогичной контрольному туберкулину [5]. Оценка специфичности туберкулина для птиц согласно ТУ 46-876-73 и ГОСТ 23881-79 осуществляется на здоровых курах и морских свинках и характеризует свойство препарата индуцировать не специфическую воспалительную реакцию в месте внутри-кожного введения. Определение специфичности на курах предполагает введение в одну из бородок 0,1 мл испытуемого, в другую- 0,1 мл контрольного туберкулина. Для исследования используют 15 голов животных. Специфичным является препарат через 30-36 часов после введения, не индуцирующий воспалительную реакцию. Для проведения теста на морских свинках, животных предварительно депилируют и в одну сторону внутрикожно инъецируют испытуемый препарат, в другую - контрольный в дозе 0,025 мг/ 0,1 см3. Специфичным является препарат который через 24 и 48 часов в месте введения не вызывает воспалительную реакцию. Оценка реакции осуществляется через 24 часа. Критерием пригодности аллергена является отсутствие реакции или развитие эритемы в месте инъекции диаметром не более 5 мм. В нормативных документах, используемых в настоящее время, данный показатель обозначается как реактогенность.
Определение специфичности ППД для птиц согласно СТО 00482909-0011-2011 и ГОСТ 32306-2013, предполагает оценку биологической активности в гете-рологичной системе (морских свинках, сенсибилизированных микобактериями бычьего вида). Биологическая активность определяется по отношению к ППД для млекопитающих, а результат выражается в процентах [7, 13]. Тест стали использовать после получения препарата более высокой степени очистки (в РФ посредством использования мембранных технологий) [2].
Определение специфичности КАМ, согласно СТО 00482909-0021-2006, осуществляется на морских свинках, сенсибилизированных микобактериями БЦЖ, и морских свинках, сенсибилизированных смесью атипичных микобактерий. Сенсибилизация животных осуществляется аналогично ТУ 10-19-518-87. Методика
предполагает на морских свинках, сенсибилизированных микобактериями БЦЖ, использование доз КАМ 675 и 27 ЕД, ППД для млекопитающих - 25 и 1 МЕ. При осуществлении теста на морских свинках, сенсибилизированных смесью микобактерий используют дозы КАМ 40 и 4 ЕД, ППД для млекопитающих - 1000 и 100 МЕ. Препарат специфичен, если процент активности в двух системах не превышает 10 [14].
Видовая специфичность. Тест разработан для оценки качества аллергена сухого очищенного комплексного из атипичных микобактерий (КАМ) [1]. Методика предполагает определение выраженности аллергической реакции на одну дозу ППД для млекопитающих (40 ТЕ) и одну дозу КАМ (10 ТЕ) в 2 группах животных: сенсибилизированных M. bovis (не менее 10 голов) и смесью атипичных микобактерий (не менее 10 голов). Критерием пригодности препарата является выраженность реакции по критерию знаков. Так, в группе животных, инфицированных возбудителем туберкулёза бычьего вида, аллергическая реакция на КАМ должна быть выражена в достоверно меньшей степени, чем на ППД, а у инфицированных атипичными микобактерия-ми, в большей степени на КАМ, чем на туберкулин для млекопитающих.
Стерильность. Согласно ГОСТ 13909-68 стерильность туберкулина для птиц определяется прямым высевом препарата на питательные среды: МПБ, МПА, МПБ, МППБ. Среды выдерживают в течение 15 суток при температуре 37-38°С. Критерием стерильности препарата является отсутствие роста колоний микроорганизмов на питательных средах [5]. Согласно ТУ46-876-73 стерильность туберкулина сухого очищенного (ППД) для птиц определяется на МПА, МПБ, МППБ, прямым посевом. Препарат считается стерильным при отсутствии роста бактериальной или грибковой флоры на питательных средах в течении 10 дней при температуре 37-38°С [16].
В анализируемых нормативных документах видно, что при контроле стерильности аллергена из M. avium отсутствуют питательные среды для выявления грибковой микрофлоры. Так известно, что микроскопические грибы могут вегетировать на различных питательных средах, вместе с тем существуют таксоны для развития которых оптимальным является определённый состав питательных сред и температура 20- 22°С [10].
Контроль стерильности туберкулина сухого очищенного (ППД) для птиц согласно ГОСТ 23881-79 осуществляется прямым высевом препарата по 0,2-0,3 см3 (после растворения стерильным физиологическим раствором из расчёта мг/см3) в пробирки с МПА, МППБ, средой Сабуро и во флаконы с МПБ. Препарат считается стерильным при отсутствии роста колоний микроорганизмов на питательных средах в течение 10 дней [6].
Согласно СТО 00482909-0011-2011 и ГОСТ 3230602013 стерильность туберкулина для птиц определяют путем прямого посева на универсальные питательные среды или методом мембранной фильтрации.
Тестирование стерильности аллергена сухого очищенного комплексного из атипичных микобактерий (КАМ) по ТУ 10-19-518-87 осуществляется высевом содержимого трёх флаконов, (после растворения) в 6 пробирок МПА, 6 пробирок МПБ, 6 пробирок МППБ, 6 пробирок среды Сабуро. Согласно СТО 00482909-00212006 стерильность КАМ определяют путем прямого посева на питательные среды: Тиоглеколевая и среда Сабуро или методом мембранной фильтрации.
Безвредность. Определение безвредности туберкулина сухого очищенного (ППД) для птиц, согласно ТУ 46-876-73 осуществляется путём подкожного его введения морским свинкам (доза 1,0 мг/1,0 см3) и белым мышам (доза 0,25 мг/0,25 см3). Препарат считался безвредным при отсутствии развития видимых изменений в месте введения, и гибели животных в течение 10 дней [16].
Определение безвредности туберкулина сухого очищенного (ППД) для птиц, согласно ГОСТ 23881-79, осуществляется на 5 белых мышах (масса 18-25 гр.) и на 2-3 здоровых морских свинках (масса 300-350 гр.) Животным, (после растворения аллергена) препарат вводят под кожу из расчёта см3/мг белым мышам, дозу 0,25 см3, морским свинкам - 1 см3. Препарат считается безвредным, если все морские свинки и белые мыши остаются живыми в течение 10 дней, а в месте введения воспалительный процесс не развивается [6].
Сенсибилизирующие свойства. Разработка критерия оценки сенсибилизирующих свойств исторически обусловлена результатами диагностики, полученными при использовании альттуберкулина (в состав которого помимо микобактериальных белков входили компоненты питательных сред) многократное применение, которого, у здоровых животных приводило к появлению неспецифической кожной аллергической реакции [8, 17]. Изучение сенсибилизирующих свойств туберкулина сухого очищенного (ППД) для птиц осуществляется на 6 морских свинках. Трём животным с интервалом в 5 дней внутрикожно вводят по 500 ТЕ препарата. Через 15 дней, после последней инъекции, трём морским свинкам, получившим три инъекции туберкулина, и трём контрольным свинкам внутрикожно вводили по 500 ТЕ в объёме 0,1 мл растворителя. Реакцию учитывают через 24 и 48 часов. Соответствующим требованиям (СТО 00482909-0021-2006) является препарат, реакция на введение которого у испытуемых не отличается от реакции контрольных животных. Оценка сенсибилизирующих свойств туберкулина ППД для птиц и КАМ согласно современных нормативных документов осуществляется одинаково, за исключением того, что доза ППД для птиц выражена в Международных единицах, а дозировка КАМ соответствует 337,5 ЕД в 0,1 см3 [14].
Реактогенность. Определение реактогенности ППД для птиц первоначально осуществлялось на морских свинках, путём введения - 500 МЕ, а КАМ 337,5 ЕД и обозначается как свойство аллергена индуцировать не специфическое воспаление. Позднее тест претерпел изменение и контроль осуществлялся с использованием как испытуемой, так и контрольной серии препаратов. Критерием пригодности аллергена является отсутствие признаков воспалительного процесса или развитие эритемы размером, не более 5 мм [7, 13, 14, 16].
Токсичность. Тест определения токсичности позволяет выявлять у препарата общее или местное негативное воздействие на организм морских свинок. Ранее тест назывался безвредность. Токсичность туберкулина очищенного ППД для птиц согласно СТО 00482909 -0011-2011 и ГОСТ 32306-2013 определяется на 2 морских свинках, которым подкожно вводят 0,5 см3 туберкулина. Если в течение 7 дней не выявляется воспалительной реакции и гибели животных, туберкулин считается нетоксичным [7, 13].
Выводы. Государственные стандарты СССР, принятые до 1990 года, первоначально являлись нормативной базой для стран СНГ. В связи с тем, что данные ГОСТы не отвечают современным требованиям и стан-
дартам, принятым МЭБ, в РФ осуществляется работа по гармонизации нормативных документов с требованиями международных. В 2013 году в России ВГНКИ и Курской биофабрикой был разработан Межгосударственный стандарт ГОСТ 32306-2013 Туберкулины очищенные (ППД) для животных, который введён в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2015 года. Предложенный нормативный документ полностью гармонизирован с нормативными документами МЭБ и ЕФ. В настоящее время
осуществляется работа по разработке нормативной документации Международного уровня на КАМ. Методы контроля качества микобактериальных аллергенов, отражённые в действующих Российских нормативных документах, характеризуются чётким номенклатурным положением, что позволяет всесторонне исследовать свойства препаратов и выпускать стандартизированные, активные, высокоспецифичные и стабильные диагностические препараты.
Список использованных источников
1. Аллерген сухой очищенный комплексный из атипичных микобактерий (КАМ). Технические условия ТУ 1019- 518-87. 19 с.
2. Безгин В.М., Козлов В.Е. Новые технологии производства диагностических препаратов для ветеринарной медицины // М1жв1домчий тематичний науковий зб1рник. Ветеринарна медицина. Вып. 81. - Харшв, 2003. - С. 205-208.
3. Безгин В.М. Совершенствование промышленной технологии (ППД) туберкулина и его биохимическая характеристика: Автореф. дис. кан. биол. наук. - М., 1990.
4. Ваверен Ван. Бруцеллёз и туберкулёз сельскохозяйственных животных // Материалы Международной конференции МЭБ (28 июня-2 июля 1965 г.). - М.: Изд-во Колос, 1967. - С. 200-204.
5. ГОСТ 13909-68. Туберкулин для птиц. - М.: Изд-во стандартов, мер и измерительных приборов при Совете Министров СССР, 1968. - 5 с.
6. ГОСТ 23881-79. Туберкулин сухой очищенный (ППД) для птиц. - М.: Изд-во стандартов, 1979. - 13 с.
7. ГОСТ 32306-2013. Туберкулины очищенные (ППД) для животных. Технические условия. - М.: Стандартин-форм, 2014. - 16 с.
8. Оздоровительные мероприятия при туберкулёзе крупного рогатого скота / М.И. Гулюкин, Найманов А.Х., В.А. Ведерников и др. // Ветеринария. - 2012. - № 1. - С.3-8.
9. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. 36-й доклад. Серия технических докладов 745. ВОЗ. Женева, 1988. - С. 29-47.
10. Микробиология, вирусология и иммунология / Под ред. В.Н. Царёва.. М.: ГОЭОТАР - Медиа, 2009. - 581 с.
11.Мясоедов Ю.М. Оценка методов контроля качества микобактериальных аллергенов изготавливаемых с использованием M. Bovis // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. - 2015. - № 8.- С. 209-212.
12. Способ получения туберкулина / Козлов В.Е. и др. Патент на изобретение № 2113233. 1997. - 6 с.
13. СТО 00482909-0011-2011. Туберкулин очищенный ППД для птиц. - Курск, 2011. - 25 с.
14. СТО 00482909-0021-2006. Аллерген очищенный комплексный из атипичных микобактерий (КАМ). -Курск, 2007. - 29 с.
15. СТО 00482909-0001-2011. Туберкулин очищенный ППД для млекопитающих. - Курск, 2011. - 25 с.
16. Туберкулин сухой очищенный ППД для птиц. Технические условия. ТУ 46-876-73. 7 с.
17. Фрадкин В.А. Диагностические и лечебные аллергены. - М.: Медицина, 1990. - С. 51-58.
18. Шаров А. Н. и др. Препараты для диагностики туберкулёза у животных / Курская биофабрика 100- лет 1896-1996.- Курск: Изд-во ГУИПП «Курск», 1996. - С. 374-383.
19. European Pharmacopoeia 4 th Edition 2002. Council of Europe Strasbourg. - P.2088-2089.
20. Office International des Epizooties (OIE). Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. - 2009. - P. 359-369.
List of sources used
1. Allergen dry purified complex (KAM). Specifications TU 10 19 518-87. 19 p.
2. Kozlov V.E., Bezgin V.M. New technologies of diagnostic preparations for veterinary medicine. Veterinary medicine. Interdepartmental thematic scientific manual.- Release 81.-Harkov.-2003.-P.41-45.
3. Bezgin V.M. Improving industrial technology (PPD) tuberculin and its biochemical characteristics: Autor. Diss. Cand. of Biology science // M., 1990.
4. Wawer Van. Brucellosis and tuberculosis of farm animals// Proceedings of the International Conference of the OIE (28 June-February 1965).- M.: Publishing House 1967. P. 200-204.
5. State Standard 13909-68. Tuberculin for birds.-M.: Publishing House of Standards, Measures and Measuring Instruments of the USSR Council of Ministers, 1968. - 5 p.
6. State Standard 23881-79. Tuberculin dry cleaned (PPD) for birds.-M.: Publishing house of the standards, 1979.13 p.
7. State Standard 32306-2013. Purified tuberculins (PPD) for animals.-М.-Standardinform.-2014.-18 p.
8. Gulykin M. I., Naimanov A.H., Vedernikov V. A., et. al. Health activities for tuberculosis in cattle //Veterinariya.-N1.-2012.-P. 3-8.
9. WHO Expert Committee on Biological Standardization. 36 th report. Technical Report Series 745. WHO. Geneva, 1988.- P. 29-47.
10. Microbiology, virology and immunology/ ed. V. N. Tsaryova. M.: GOETAR- Media, 2009.- 581 p.
11. Myasoedov J. M., Morozov S. V. Optimization of the test of definition of biological activity PPD tuberculin for mammals// Vestnik of Kursk state agricultural Academy.- 2012.-N 9.-P.71-74.
12. A method of producing tuberculin/ V. E. Kozlov et. al. // Patent for the invention N 2113233. 1997. - 6 p.
13. Standard of organization 004829-0011-2011. Tuberculin PPD for birds. - Kursk, 2011. - 25 p.
14. Standard of organization 004829-0021-2006. Allergen purified complex of atypical mycobacteria (KAM).- Kursk, 2007. - 29 p.
15. Standard of organization 004829-0011-2011. Tuberculin PPD purified for mammalian.- Kursk, 2011. - 25 p.
16. Tuberculin PPD purified for birds. Specification 46-876-73. - 7 p.
17. Fradkin V. A. Diagnostic and medical allergens. - M.: Medicine 1990. P. 51-58.
18. Sharov A.N. et. al. Preparations for the diagnosis of tuberculosis in animals - 100. - Kursk biofactory years 19861996. - Kursk, 1996. - P.374-383.
19. European Pharmacopoeia 4 th Edition 2002. Council of Europe Strasbourg. - P.2088-2089.
20. Office International des Epizooties (OIE). Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. - 2009. - P. 359369.
