CC BY
18
3. В водном растворе микрокапсулированного ПГМГГХ в пектине (ядро/оболочка - 1:1) выход свободного ПГМГГХ составил около 60% от показателей базового градуировачного графика (рис.1), это дает основание считать, что 40% ПГМГГХ находится в микрокапсулированном связанном состоянии. Его оптическая плотность в данных концентрациях находится в пределах от 78 до 366.6 единиц
Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что при даче внутрь с водой, молоком или молозивом микрокапсулированного препарата новорожденному теленку 60% свободного ПГМГГХ будут являться активной дозой, а остальные 40% постепенно выходя из капсул, обеспечат пролонгирующий эффект.
Таким образом, полученные результаты исследований следует учитывать при подборе дозировки и разработке схемы применения микрокапсулированного Биопага-Д в пектине для профилактики острых расстройств пищеварения у новорожденных телят.
Список использованных источников 1 Полимерные биоциды-полигуанидины в ветери-нарии / М.М. Наумов, Л.А. Жукова, З.Д. Ихласова и др. - Курск: Изд-во Курск. гос. с.- х. ак., 2010. - 84 с.
2 Пат. 2561586 РФ на изобретение. Способ получения микрокапсул Биопага-Д в пектине / А.А. Кролевец, М.М. Наумов, И.А. Богачев, И.А. Брусенцев, Н.М. Наумов. -Приоритет от 12.02.2014, опубл. 27.08.2015.
3 Препарат Доксилок OR при бактериальных болезнях птиц / С.Б. Лыско, М.В. Задорожная, С.В. Новикова, О.С. Драгункина // Птицеводство. - 2014. - № 1. - С. 20-24.
4 Потиевский Э.Г., Новиков А.И. Медицинские аспекты применения пектина. — М. : Медицинская книга, 2002. — 96 с.
5 Беляев А.Г. Особенности получения пектинового препарата и функциональная характеристика его влияния на организм цыплят-бройлеров: автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Курск, 2005. — 20 с.
6 Бактрицидное действие пектинов на возбудителей кишечных инфекций птиц / А.В. Портянко, С.Б. Лыско, А.П. Красников, Л.П. Волохова // Птица и птицепродукты. - 2015. -№ 3. - С.50-52.
7 Ларионова Н.И., Дюшен Д., Курве П. Разработка микро- и наносистем доставки лекарственных средств // Греф Российский химический журнал. - 2008. - №1. - С. 48-57.
Информация об авторе
Наумов Николай Михайлович, аспирант кафедры физиологии и химии им. проф. А.А. Сысоева ФГБОУ ВО Курская ГСХА.
DEFINITION OF NUMBER OF POLIGEKSOMETILENGUANIDIN HYDROCHLORIDE IN MICROCAPSULES
FOR VETERINARY SCIENCE N. M. Naumov
Annotation: The biochemical characteristic of active ingredient and a cover of the offered microcapsules for veterinary science is given in article. The assessment of photoelectrocalorimetric researches on definition of amount of active ingredient in water solutions of the microencapsulated poligeksometilenguanidin hydrochloride is carried out, and also studied the influence on optical density in these solutions of a cover of microcapsules.
Keywords: poligeksometilenguanidin hydrochloride, guanidina, Biopag-D, pectin, microencapsulation, photoelectrocalorimetry.
ОЦЕНКА МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МИКОБАКТЕРИАЛЬНЫХ АЛЛЕРГЕНОВ, ИЗГОТАВЛИВАЕМЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ M. BOVIS
Ю.М. Мясоедов
Аннотация. В историческом аспекте обобщены и проанализированы методы контроля туберкулинов (от альттуберклуина, до туберкулина очищенного) изготавливаемых с использованием микобактерий бычьего вида.
Ключевые слова: туберкулин, метод контроля, показатель качества.
Первым этапом при проведении диагностических исследований на туберкулёз у млекопитающих, вызванного M. bovis, является аллергическая проба, предполагающая применение аллергенов, изготовленных с использованием микобактерий бычьего вида [11,23]. Диагностическая ценность аллергической пробы в условиях животноводческих комплексов и фермерских хозяйств определяются параметрами качества туберку-линов [23], которые зависят от технологии производства [4]. В России производство микобактериальных аллергенов с использованием M. bovis в небольших объёмах начато в 1891 году в институте экспериментальной ветеринарии, с 1931 продолжается в промышленных масштабах года на Курской биофабрике [23]. При этом за период промышленного производства технология изготовления изменилась от производства препарата, содержащего балластные соединения к высокоочищен-ному варианту [13]. В свою очередь, изменения состава
и качества препаратов привели к изменениям методик при их контроле [5-9,21-23]. Принимая во внимание вышеизложенное, целью обзора являлось оценка методов контроля качества микобактериальных аллергенов, изготавливаемых с использованием M. bovis в России от альттуберкулина до высокоочищенного препарата.
При проведении оценки методов контроля были использованы Российская и международная нормативная документация периода 1972 - 2011гг.
Методы, используемые при описании качественных и количественных показателей туберкулинов, изготовленных из M. bovis, исторически принятые в России, представлены в таблице 1.
Методы контроля показателей качества туберку-линов делятся на 3 группы: 1. Методы контроля физических показателей (внешний вид; растворимость; однородность раствора); 2. Методы контроля химических показателей (концентрация водородных ионов (pH); массовая доля белка в сухом туберкулине; количество белка в стандартном растворе; массовая доля хлористого натрия; массовая доля фенола; массовая доля глицерина); 3. Методы контроля биологических показателей (специфическая безвредность, активность, степень активности, специфичность, стерильность, безвредность, сенсибилизирующие свойства, реактогенность, токсичность).
Таблица 1 - Методы контроля качества аллергенов изготовленных с использованием M. bovis
Показатель качества Нормативный документ регламентирующий параметры качества препарата
ГОСТ 13910-72 ГОСТ 13910-81 ГОСТ 16739-81 ГОСТ 16739-88 СТО 00482909-00012011
Альтуберкулин для млекопитающих Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих
Форма выпуска
Раствор Сублимированный Сублимированный Раствор Сублимированный Раствор
Внешний вид + + + + + + +
Растворимость - - + + - + -
Однородность раствора - - + + - + -
Концентрация водородных ионов рН - - + + + + +
Массовая доля белка в сухом туберкулине, % - - + + - + -
Количество белка в стандартном растворе, мг/см3 - - - + - +
Массовая доля хлористого натрия, % - - - - + - +
Массовая доля фенола, % - - - - + - +
Массовая доля глицерина, % - - - - + - +
Специфическая безвредность - - - - - + +
Активность + + + + + + +
Степень активности + - - - - - -
Специфичность + + + - - + +
Стерильность + + + + + + +
Безвредность + + - - - - -
Сенсибилизирующие свойства - - - + + + +
Реактогенность - - - + + + +
Токсичность - - - - - + +
Общее количество используемых методов 6 5 8 9 10 12 13
Примечание: «-» тест не предусмотрен для данного варианта препарата.
«+» тест предусмотрен для данного варианта препарата.
Методы определения физических показателей качества
Внешний вид. Контроль внешнего вида осуществляется как для препаратов представленных в сублимированной форме и в форме раствора. Определение внешнего вида сублимированного туберкулина предполагает оценку формы, цвета, структуры содержимого флакона, что позволяет оценить качество сублимации, точность фасовки препарата [5-8,15]. Определение внешнего вида раствора аллергена осуществляется встряхиванием флаконов с последующим просмотром содержимого в проходящем свете, что позволяет выявить: механические включения неорганической природы (частицы фильтрующего материала, металлические включения, стекло и др.) и органической природы (конгломераты колоний бактерий и/или грибов или компонентов препарата), а также определить цвет.
Растворимость. Оценка растворимости методически осуществляется для препаратов, представленных в сублимированной форме, и предполагает определение времени полного растворения препарата в растворителе микобактериальных аллергенов при взбалтывании с последующим просматриванием флаконов в проходящем свете [7,8,15].
Однородность в растворе. Определение показателя осуществляется только для препаратов, представленных в сублимированной форме, после растворения в растворителе микобактериальных аллергенов. С помощью данного теста оценивается цвет раствора и наличие механических включений аналогично осуществляемые как при определении внешнего вида препарата представленного в форме раствора [7,8,15].
Методы контроля химических показателей качества
Концентрация водородных ионов (рН). Определение показателя осуществляется для препаратов, представленных как в форме раствора, так и для сублимированных препаратов после их растворения в растворителе микобактериальных аллергенов. Определение рН регламентировано с внедрением в практику очищенной формы [7], в свою очередь, использование туберкулина с определённым значением рН расширило спектр диагностических возможностей препарата, позволив помимо внутрикожного введения использовать его внутривенно и способом нанесения на конъюнктиву. Кроме того, рН является параметром, определяющим стабильность аллергена, повышение или понижение которого приводит к осаждению микобактериальных белков [14].
Массовая доля белка в сухом туберкулине. Метод Кьель-Даля характеризует содержание микобактери-альных белков в сублимированной форме аллергена и осуществляется после растворения препарата в растворителе микобактериальных аллергенов. Основанием для получения данного варианта аллергена стали исследования [7,8,15], продемонстрировавшие, что, чем выше степень очистки препарата, тем выше биологическая активность [12]. При этом использование метода определения белка для оценки альттуберкулина не имело смысла, в связи с тем, что аллерген, изготовленный по технологии, предложенной Р. Кохом, содержал большое количество балластных белковых веществ питательной среды, что приводило бы к искажению результатов химического анализа и невозможности даже приблизительно определить содержания биологически активного микобактериального белка [17].
Количество белка в стандартном растворе. Показатель аналогичен описанному выше, с той разницей, что определение белка методом Кьель- Даля осуществляется в растворе [8,15].
Массовая доля хлористого натрия. Определение показателя осуществляется для препарата, представленного в форме раствора титрованием раствора аллергена 0,1 М раствором азотнокислого серебра [8,15]. Нормирование раствора аллергена по содержанию хлористого натрия и введение в форму раствора хлористого натрия явилось вторым этапом, позволившим использовать его для осуществления конъюнктивального и внутривенного аллергического теста [22].
Массовая доля фенола. Определение показателя осуществляется для препарата, представленного в форме раствора титрованием аллергена 0,05 М раствором тиосульфата натрия [8,15].
Введение фенола в раствор диагностической формы позволяет снизить жизнеспособность микроорганизмов, контаминирующих вскрытый флакон в условиях животноводческих помещений, где риск обсеменения высок и позволяет использовать препарат в течение 2-3 часов после вскрытия флакона [11].
Массовая доля глицерина. Использование глицерина в составе диагностической формы позволяет снизить сорбцию биологически активных микобактериальных антигенов на поверхности стекла в течение всего периода хранения и таким образом стабилизировать препарат в течение периода хранения [9].
Определение массовой доли глицерина осуществляется для раствора очищенного туберкулина по плотности раствора при помощи ареометра [8,15].
Методы контроля биологических показателей качества
Специфическая безвредность. Определение специфической безвредности осуществляется при контроле очищенной формы туберкулина путём внутрибрюшин-ного введения морским свинкам. Выбор в качестве модели морских свинок обусловлен их высокой чувствительностью к микобактериям [23], а использование внутрибрюшинного введения обусловлено быстрым проявлением заболевания (в случае содержания жизнеспособных микобактерий) и развитием генерализованной формы.
Тест позволяет выявить жизнеспособные микобак-терий, гипотетически сохранившиеся в готовом препарате, при этом выдвигается нулевая гипотеза, предполагающая содержание жизнеспособных форм патогенных микобактерий в аллергене, опровержение которой осуществляется посредством проведения комплекса аллергического, паталого- анатомического и бактериологического исследований через 43 дня после внутри-брюшинного введения [15].
Активность. Метод позволяет оценить содержание единиц в определённом объёме (см3). Метод определения активности является одним из первых разработанных для контроля и претерпевших наибольшие изменения, совпадающие с изменениями производственных процессов при изменении технологии производства. Так например, согласно ГОСТ 13910-72, определение биологической активности всех производственных серий осуществлялось только на больном туберкулёзом крупном рогатом скоте [5], в то время как согласно ГОСТ 13910-81 определение активности осуществлялось как на больном туберкулёзом КРС (каждой 10-й серии), так и на сенсибилизированных морских свинках (каждой серии) [6]. Аналогичные методические подходы реализованы в ГОСТ 16739-81 [7] и ГОСТ 16739-88 [8]. В настоящее время, согласно СТО 00482909-00012011, определение активности осуществляется каждой серии препарата только на сенсибилизированных пато-
генными, апатогенными или инактивированными ми-кобактериями морских свинках.
Степень активности. Определение показателя регламентировалось только для альттуберкулина, и согласно ГОСТ 13910-72 осуществляется на больном туберкулёзом КРС [5]. При постановке теста применение нескольких разведений альттуберкулина на больном туберкулёзом крупном рогатом скоте позволяет оценить диагностические свойства при колебании содержания микобактериальных белков в альттуберкулине, так как к тому времени данный показатель не был стандартизован [20]. При этом методика определения степени активности, предложенная для использования на КРС, аналогична пробе Коха, разработанная им для тестирования туберкулина на контингенте лиц, больным туберкулёзом [17].
Специфичность. Показатель определяется аналогично показателю активности, за тем исключением, что используются морские свинки сенсибилизированные гетерологичными по отношению к туберкулину мико-бактериями - M. avium, при этом биологическая активность определяется по отношению к ППД для птиц, а результат выражается в процентах [15]. Введение в методы контроля обусловлено увеличением частоты проявления аллергических реакций на туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих в благополучных по туберкулёзу животноводческих хозяйствах, с последующим выделением от животных преимущественно микобактерий комплекса avium- intracellularae. Определение специфичности позволяет смоделировать производственную ситуацию, в которой предполагается, что животные (-ое) сенсибилизированы не патогенными микобактериями. Тест был введён в практику контроля туберкулинов после получения препарата более высокой степени очистки мембранной технологии [18]. Кроме того, разработка теста обусловлено необходимостью получения препаратов с одинаковыми диагностическими свойствами (биологической активностью и специфичностью), производимыми в разных странах мира, согласно требований МЭБ [23]. Ранее, согласно ГОСТ 13910-81, определение специфичности предполагало определение неспецифического воспаления в месте введения аллергена и проводилось на здоровом крупном рогатом скоте и здоровых морских свинках [6]. В настоящее время данный показатель обозначается как реактогенность и определяется только на здоровых морских свинках [15].
Стерильность. Метод используется как при контроле очищенного препарата представленного в форме раствора, так и в сублимированном виде, а также для альттуберкулина Коха, и позволяет выявить жизнеспособные микроорганизмы, гипотетически контамини-рующие препарат на этапах изготовления. Ранее при контрлое стерильности предполагалось использование питательных сред: МПА, МПБ, МППБ, Сабуро [8]. Согласно современных требований (СТО 00482909-00012011), определение стерильности предусматривает использование универсальной Тиоглеколевой среды и жидкой среды Сабуро [15].
Безвредность. Использование метода предполагалась для препаратов, изготовленных по технологии, предложенной Р. Кохом. Определение безвредности предполагало выявление общего токсического действия аллергена на организм лабораторных животных при подкожном введении и методически регламентировано двумя нормативными документами: ГОСТ 13910-72 и ГОСТ 13910-81. При этом в первом случае тест предусматривал использование только морских свинок [5], а во втором - только аутбредных мышей [6]. В настоящее время тест переименован и носит название: определение токсичности и предусматривает использование
только морских свинок. Технически предусматривает подкожное введение туберкулина с последующей оценкой развития воспалительного процесса в месте введения [15].
Сенсибилизирующие свойства. Определение показателя осуществляется на морских свинках и предполагает многократное введение аллергена в организм животных с целью выявления вероятной способности индуцирования гиперчувствительности замедленного типа [8,15].
Исторически введение критерия обусловлено результатами диагностики, полученной при использовании альттуберкулина для млекопитающих, в состав которого входили помимо микобактериальных белков компоненты питательной среды, использование которого, в ряде случаев, приводило к появлению у здоровых животных неспецифических реакций [18]. Поэтому определение сенсибилизирующих свойств осуществляется только для очищенных туберкулинов [7]. При этом сенсибилизирующей способностью характеризуются большинство белков с молекулярной массой более 10 кДа [3]. В то же время туберкулин изготавливаемый в РФ, содержит микобактериальные белковые комплексы в диапазоне от 10 кДа до 100 кДа [13]. Исследованиями показано отсутствие сенсибилизирующей способности при многократных введениях [16].
Реактогенность. Определение реактогенности предполагает выявление у препарата в высокой дозе 500 МЕ способность индуцировать не специфическое воспаление (PPD- bovine) в сравнении с контрольным препаратом в месте внутрикожного введения морским свинкам. Критерием пригодности препарата является отсутствие признаков воспалительного процесса или развитие эритемы размером, не превышающим 5 мм [7,15].
Токсичность. По показателю токсичность оценивается общее и местное токсическое действие аллергена на организм морских свинок и в отличие от теста определения реактогенности предусматривает подкожное введение туберкулина в дозе в 10 раз, превышающая используемую при определении реактогенности [7,15].
Исходя из вышеизложенного можно заключить, что методические подходы к контролю качества препаратов, изготовленных с использованием M. bovis, претерпели значительные изменения, что связано с изменением технологии производства и унифицированием тестов в индустриально развитых странах, используемых при производстве туберкулинов глобализационными процессами и выработкой международной нормативной базы. Методы контроля качества микобактериальных аллергенов, используемые в настоящее время, характеризуются чётким номенклатурным положением, при этом общее количество тестов возросло, что позволяет более полно описывать препараты, изготовленные с использованием M. bovis и производить стандартизированный активный, высокоспецифичный и стабильный препарат.
Список использованных источников
1 Безгин В.М., Козлов В.Е. Новые технологии производства диагностических препаратов для ветеринарной медицины// Мiжвiдомчий тематичний науковий збiрник. Ветеринар-на медицина. Вып. 81. - Харюв, 2003. - С. 205-208.
2 Ваверен Ван. Бруцеллёз и туберкулёз сельскохозяйственных животных // Материалы Международной конференции МЭБ (28 июня-2 июля 1965 г.).- М.: Изд-во Колос, 1967. -С. 200-204.
3 Вязов О.Е. Лабораторная иммунология.- М.: Медицина, 1967. - С.14.
4 Галкин Н.И. Физикохимические и биологические свойства туберкулопротеинов, очищенных гель-фильтрацией: автореф. дисс.канд. биол. наук.- М., 1978.- 14с.
5 ГОСТ 13910-72. Альттуберкулин для млекопитающих. -М.: Изд-во стандартов, 1972. - 7 с.
6 ГОСТ 13910-81. Альттуберкулин для млекопитающих. -М.: Изд-во стандартов, 1981. - 12 с.
7 ГОСТ 16739-81. Туберкулин сухой очищенный (ППД) для млекопитающих. - М.: Изд-во стандартов, 1981.- 17 с.
8 ГОСТ 16739-88. Туберкулин сухой очищенный (ППД) для млекопитающих. - М.: Изд-во стандартов, 1988.- 21 с.
9 Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. 36-й доклад. Серия технических докладов 745. ВОЗ. Женева 1988. - С. 29-47.
10 Лянда - Геллер Б.А. Получение высокоактивной фракции очищенного сухого туберкулина, её химическая и биологическая характеристика // Проблемы туберкулёза. -1963. - №9.- С.67-72.
11 Наставление по диагностике туберкулёза животных. -М., 2002. - 63 с.
12 Руководство по вакцинному и сывороточному делу/ Под ред. Н.И. Власьевского, В.А. Любарского, Л.М. Хатене-вера. - М.: Биомедгиз, 1934. - С. 480-493.
13 Способ получения туберкулина / В.Е. Козлов и др.// Патент на изобретение № 2113233. 1997. - 6с.
14 Справочник биохимика/ Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. - М.: Мир, 1991. - 544с.
15 СТО 00482909-0001-2011. Туберкулин очищенный ППД для млекопитающих. - Курск, 2011. -25 с.
16 Разработка иммунозолотых диагностических систем для идентификации возбудителя туберкулёза in situ / С.А. Староверов, И.В. Видяшева, А.С. Фомин и др. // Российский ветеринарный журнал мелкие домашние животные. - 2011. -№2. - С. 51-58.
17 Справочник практикующего врача/ Под ред. А.И. Воробьёва.- 4-е изд., испр. и доп.- М.: Бален, 1990. - С. 588.
18 Шаров А. Н. и др. Препараты для диагностики туберкулёза у животных / Курская биофабрика 100- лет 1896-1996.-Курск: Изд-во ГУИПП «Курск», 1996. - С. 374- 383
19 Шевырёв Н.С. Биологическая и химическая характеристика и стандартизация туберкулинов, изготовленных различными способами: дисс. .канд. вет. наук.- Харьков, 1971.
- 159 с.
20 Фрадкин В.А. Диагностические и лечебные аллергены. - М.: Медицина, 1990. - С. 51-58.
21 Assay Method for the Evalution of Koch's Old Tuberculin. United States Department of Agriculture Center for Veterinary Biologies Testing protocol SAM 604 Supplemental, July 21 2011.
- 11p.
22 European Pharmacopoeia 4 th Edition 2002. Council of Europe Strasbourg. -P.2088-2089.
23 Office International des Epizooties (OIE). Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. - 2009. - P. 359-369.
Информация об авторе
Мясоедов Юрий Михайлович, кандидат биологических наук, ФГУП «Курская биофабрика», е-mail: MyasoedovYurij @Yandex.ru. т. (4712) 539153.
ASSESSMENT OF METHODS OF QUALITY CONTROL OF MICROBACTERIAL ALLERGENS,
MADE WITH USE OF M. BOVIS Yu.M. Myasoyedov
Abstract. In historical aspect control methods of tuberkulin (from the alttuberkluin, to a tuberkulin cleared) the microbacteria of a bull look made with use are generalized and analysed.
Keywords: tuberculin, control method, quality indicator.
