CC BY
73
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2005 Биология Вып. 6
УДК 579.873.6.083.18
СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ИММУННЫЕ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ АКТИНОБАКТЕРИЙ РОДА КНОВОСОСС113
И. Б. ИвшинааЬ, О. А. Богомягкова3, О. А. Голикова13
а Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13 ь Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Разработаны рациональные схемы получения специфических поликлональных иммунных сывороток против типовых и типичных штаммов отдельных видов актинобактерий рода Яко£1о-соссив, пополнен банк антисывороток Региональной профилированной коллекции алкано-трофных микроорганизмов ИЭГМ. С помощью полученных антисывороток исследованы им-муногенность и антигенная специфичность родококков. Проведен сравнительный анализ эффективности использования различных схем иммунизации подопытных животных.
Введение
Среди таксономических критериев, которые применяются при идентификации актинобактерий рода Шю(1ососсив, определенное значение может иметь антигенная структура бактериальных клеток, выявляемая с помощью диагностических иммунных сывороток (1Ше11, 1977). Ранее нами была оценена возможность использования серологических реакций, в частности иммунодиффузии и непрямой иммунофлуоресценции для ускоренной дифференциации родококков на уровне видов (Ившина и др., 1982, 1985, 1986). Одним из наиболее трудных вопросов серодиагностики родококков является приготовление антисывороток достаточно высокой специфичности. В связи с этим нашей целью является разработка способов получе-
ния специфических гипериммунных сывороток против представителей недавно предложенных видов Яко(1ососсш и изучение их иммуногенности и антигенной специфичности.
Материалы и методы исследования
Для приготовления иммунных сывороток использовали типовые штаммы сравнительно недавно предложенных видов родококков (табл. 1). Культуры выращивали на мясопептонном агаре (МПА) при температуре 30°С в течение 96 ч. Бактериальные клетки отмывали 3-4 раза стерильным физиологическим раствором (забуференным 1/15М фосфатным буфером pH 7,2) с помощью центрифугирования при 4000 об/мин в течение 15 мин.
Таблица 1
Титры антител иммунных сывороток, выявленных в реакциях иммунодиффузии в агаровом геле и непрямой иммунофлуоресценции
Штамм Схема иммунизации Титры антител в
РИ нМФА
К. соргорЫНш ИЭГМ 600т 0,3 мл, 1 день, подкожно, 0,3-0,5 мл, 2 дня, внутримышечно, интервал 7 дней; 0,2-0,5 мл, ежедневно в течение 3 дней, внутривенно, интервал 7 дней; 0,5-0,8 мл, ежедневно в течение 3 дней, внутривенно, интервал 7 дней; 0,8-1,0 мл, ежедневно в течение 3 дней, внутривенно, интервал 30 дней; 0,5—1,0 мл, ежедневно в течение 3 дней, внутривенно 1:64 1:128
К ‘Чоп ИЭГМ 27т 1:32 1:128
/?. г1гос1пи ИЭГМ 555т 1:64 1:64
Я. гор]г1 ИЭГМ 673т 1:64 1:128
Примечание. Приведены максимальные разведения антисывороток, при которых наблюдались четкие линии преципитации в реакции двойной иммунодиффузии в агаровом геле (РИ) и специфическое свечение интенсивностью не менее 3+ в непрямой реакции иммунофлуоресцентции (нМФА).
© И. Б. Ившина, О. А. Богомягкова, О. А. Голикова, 2005
123
Для получения водорастворимых белковых го-могенатов бактериальные клетки разрушали ультразвуком на диспергаторе «Soniprep 150 MSE» (Sanyo-) при ультразвуковых колебаниях 22 кГц, показаниях амперметра 0,7, экспозиции 20 мин и обязательном охлаждении бактериальной суспензии. Концентрация белка в гомогенатах, определяемая по методу Лоури с соавт., составляла в среднем 25 мг/мл (Lowry et al., 1951).
Для иммунизации использовали кроликов массой от 3 до 5 кг, у которых до иммунизации предварительно проверяли наличие в сыворотке крови нормальных антител к исследуемым бактериям.
Антисыворотки получали на седьмой день после завершающего цикла иммунизации. Готовые сыворотки хранили в замороженном виде с добавлением мертиолата натрия (1 : 5000).
Титр антисывороток определяли в реакции двойной иммунодиффузии в агаровом геле и в непрямой реакции иммунофлуоресценции. В реакции иммунодиффузии антигенами служили дезинтегрированные бактериальные клетки, в нМФА - 96-часовые культуры в S-форме, выращенные на МПА.
В нМФА использовали меченую изотиоциана-том флуоресцеина антикроличью сыворотку в рабочем разведении 1 : 4 производства Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Приготовленные препараты просматривали под люминесцентным микроскопом «Micros» (Австрия) с объективом 90х, применяя в качестве иммерсионной среды химически чистый диметилфта-лат, в качестве контрастирующего красителя - бычий альбумин, помеченный родамином. Для оценки интенсивности специфической флуоресценции использовали четырехкрестную шкалу. Положительным результатом иммунофлуоресцентных реакций считали флуоресценцию клеток интенсивностью не менее 3+. Преципитационные спектры исследуемых штаммов регистрировали зарисовками.
Результаты и их обсуждение
При подборе оптимальных условий для получения высокоактивных иммунных сывороток против исследуемых штаммов бактерий учитывались следующие факторы, определяющие эффективность иммунизации: физико-химическая природа вводимого антигена (корпускулярный или водорастворимый); метод его введения; кратность и интервалы между иммунизациями. Кроме того, эффективность иммунизации существенно зависит от степени им-муногенности каждого штамма, обусловленной специфическим антигенным составом клетки, активностью лизосомальных ферментов фагоцитов макроорганизма. В ранее проведенных исследованиях было показано, что наиболее интенсивно индуцируют антителообразование в организме подопытных животных водорастворимые антигены, тогда как ин-тактные клетки вызывают относительно слабый им-
мунный ответ (Ившина, 1997).
Для повышения иммунологической активности подопытных животных нами использована схема иммунизации, предусматривающая увеличение интервала между иммунизациями и введение приема отдаленной реиммунизации подопытных животных. Такая схема отличается высокой воспроизводимостью и высокой результативностью (Барбан и др., 1988). Из способов аппликации иммуногенного материала наиболее результативный интратестикуляр-ный способ, на практике он трудноосуществим, поэтому мы использовали прием сочетанного (внутримышечно и внутривенно) заражения кроликов.
В табл. 1 представлены схемы иммунизации подопытных животных, которая позволила получить диагностические иммунные сыворотки против изучаемых типовых штаммов родококков с достаточно высокими титрами антител. Несмотря на то, что данная схема является довольно длительной, относительно высокие титры антител и специфичность получаемых иммунных сывороток, а также сравнительно легкая ее переносимость кроликами-продуцентами позволили выбрать ее в качестве основной схемы иммунизации.
Для изучения относительной иммуногенности родококков четыре группы экспериментальных животных иммунизировали по однотипной схеме равными для всех бактериальных штаммов возрастающими дозами вакцин.
По нашим данным, в крови неиммунизирован-ных животных выявляются нормальные антитела по отношению ко всем исследуемым штаммам родококков в примерно равных титрах: 1о§2 величин титров ~ 0,8-2,2; Р>0,05. Можно полагать, что данные антитела вырабатываются в ответ на постоянное поступление аналогичных или родственных бактериальных антигенов в кишечный тракт кроликов вместе с пищей (Шварцман, Хазенсон, 1978).
Установлено, что динамика синтеза антител у различных штаммов родококков не одинакова (табл. 2). После трех циклов иммунизации (30-й день) все животные отвечают закономерным увеличением титров антител, а на более поздних (40-й день) этапах иммуногенеза интенсивность иммунного ответа нарастает у животных, примированных вакцинами /?. соргорЫИт ИЭГМ 600т, К. гор/и ИЭГМ 673т, Я. “Iongus" ИЭГМ 27. Иммунизирующее действие вакцины Я гИойпИ ИЭГМ 555т заметно проявляется лишь при увеличении дозы. Различия в степени иммуногенности исследуемых бактериальных штаммов наиболее четко проявляются в момент максимальной напряженности иммунитета после реиммунизации (80-й день).
Падение титров антител на 70-й день связано с особенностью схемы иммунизации, включающей прием реиммунизации. Согласно исследованиям Р.Б. Гольдина с соавт. (Гольдин и др., 1970), к реиммунизации животных следует приступать только после падения титра антител до 1 : 10 - 1 : 20 при
Специфические иммунные сыворотки против актинобактерий рода Rhodococcus 125
их максимальном уровне, достигнутом при первичной иммунизации. Таким образом, к 70-му дню был ориентировочно достигнут искомый уровень
антител; и экспериментально найденный интервал между первичной иммунизацией и отдаленной реиммунизацией кроликов составил 30 дней.
Таблица 2
Динамика образования антител, выявляемых в реакциях двойной иммунодиффузии в агаровом
Титр агглютининов в log2 к бактериальному штамму
Дни после первой вакцинации R. zopfii ИЭГМ 673т R. “longus” ИЭГМ 27 R. coprophillus ИЭГМ 600т R. rhodnii ИЭГМ 555т
1* 2* 3* 4*
30 2,5±0,83 2,0±0,67 4,0±1,33 2,0±0,67
40 6,5±2,16 6,3±2,10 8,0±2,67 5,3±1,52
70 5,3±1,74 5,0±1,67 4,8±1,58 4,0±1,33
80 7,3±2,33 6,5±2,17 6,5±2,16 5,8±1,92
♦Номер группы подопытных животных (число животных в каждой экспериментальной группе равно 4).
Таблица 3
Титры преципитинов в крови кроликов, иммунизированных водорастворимыми
бактериальными антигенами
Штаммы Схема иммунизации Титр антител в log2, выявленных в РИ
R. coprophillus ИЭГМ 600т 0,3 мл, 1 день, подкожно, 0,3-0,5 мл, 2 дня, внутримышечно, интервал 7 дней; 0,2-0,5 мл, ежедневно в течение 3 дней, внутривенно, интервал 7 дней;0,5-0,8 мл, ежедневно в течение 3 дней, внутривенно, интервал 7 дней; 0,8-1,0 мл, ежедневно в течение 3 дней, внутривенно, интервал 30 дней;0,5-1,0 мл, ежедневно в течение 3 дней, внутривенно 6,5±2,16 (4,89^-8,11)
R. "longus" ИЭГМ 27т 6,5±2,17 (5,55-7,45)
R. rhodnii ИЭГМ 555т 5,8±1,92 (4,99-6,61)
R. zopfii ИЭГМ 673т 7,3±2,33 (5,67-8,93)
R. rhodochrous ИЭГМ 62т 0,5 - 1,5 мл в смеси с неполным адьювантом Фрейнда (1:1), 4 дня, интервал 7 дней, внутримышечно; 0,25 - 0,5 мл без адьюванта, 3 дня, внутривенно 8,3±0,48 (7,27-9,93)
R. ruber ИЭГМ 333 0,5 - 1,5 мл в смеси с неполным адьювантом Фрейнда (1:1), 3 дня, интервал 14 дней, внутримышечно; 1 мл без адьюванта, один день, подкожно, интервал 30 дней; 0,25 - 1, 0 мл без адьюванта, 3 дня, внутривенно 9,0±0,55 (7,47-10,53)
Примечание. Приведены данные на 7-й день после завершающего цикла иммунизации. В скобках указан 95%-ный доверительный интервал.
После завершающего цикла иммунизации антисыворотку забирали на 7-й день после последней инъекции бактериальных антигенов.
Следует отметить, что предложенная нами схема иммунизации является более напряженной, нежели ранее разработанные оптимальные схемы получения сывороток против бактерий других видов рода Rhodococcus. В табл. 3 приведены схемы иммунизации для получения антисывороток против представителей R. rhodochrous и R. ruber (Ив-шина, 1986) с целью сравнения их эффективности с разработанной схемой иммунизации для приготовления иммунных сывороток против R. сорго-phillus, R. “longus”, R. rhodnii и R. zopfii. Ввиду того, что исследуемые нами штаммы, относящиеся к недавно предложенным видам родококков, обладают более низкой степенью иммуногенности, по сравнению с таковой у представителей R. rhodochrous и R. ruber, увеличение интервалов между иммунизациями и использование приема отдален-
ной реиммунизации позволили получить гиперим-мунные сыворотки с достаточно высокими титрами, выявляемыми в реакции иммунодиффузии и иммунофлуоресценции.
Таким образом, результаты проведенных исследований подтверждают тот факт, что не может существовать единого (универсального) способа получения высокоактивных иммунных сывороток против всех изучаемых штаммов родококков. В ходе построения рациональных схем иммунизации установлено, что степень иммуногенности исследуемых бактерий выражена неодинаково. С использованием разработанной схемы гипериммунизации животных комплексными антигенами родококков получены видоспецифические иммунные сыворотки против R. соргорШИш ИЭГМ 600т; R. “1опёш" ИЭГМ 27т; К. rhodnii ИЭГМ 555т; И юр/и ИЭГМ 673т с достаточно высокими титрами антител: средние величины 1о§2 титров преципитинов составляют 8,3±0,48 - 9,0±0,55. Полученные
антисыворотки пополнили банк специфических поликлональных иммунных сывороток Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекций культур 768; vyww.iegni.ru/iegmcol~) и успешно используются в таксономических и экологических исследованиях непатогенных актинобактерий.
Исследования поддержаны грантом Программы Президиума РАН «Научные основы биоразнообразия России». Направление 7. Проект 7.4.
Библиографический список
Барбан П.С. и др. Иммунофлуоресцентный анализ.
Свердловск: УрО АН СССР, 1988. 178 с. Ившина И.Б. Бактерии рода Шос1ососси$ (детекция, биоразнообразие, иммунодигностика): Дис. ... д-ра биол. наук. Пермь, 1997. 98 с.
Ившина И.Б. Способы получения специфических иммунных сывороток против бактерий рода Rhodococcus // Микробиол. журн. 1986. Т. 48, № 2. С. 8-12.
Ившина И.Б. и др. Идентификация бактерий рода Rhodococcus методом иммунодиффузии // Микробиология. 1982. Т. 51, вып. 4. С. 636-641.
Ившина И.Б., Пшеничное Р.А., Кеворков Н.Н. Особенности антигенной структуры родококков, культивируемых на разных средах // Микробиология. 1985. Т. 54, вып. 2. С. 290-292.
Ившина И. Б. и др. Идентификация родококков новых видов методом иммунодиффузии // Микробиол. журн. 1986. Т. 48, № 2. С. 3-8.
Иммунохимический анализ / Под ред. J1.A. Зиль-бера. М.: Медицина, 1968. 371 с.
Кудрин А.Н., Пономарева Г.Т. Применение математики в экспериментальной и клинической медицине. М.: Медицина, 1967. 356 с.
Шварцман Я.С., Хазенсон Л.Б. Местный иммунитет. Л.: Медицина, 1978. 223 с.
Lowry О.Н., Rosebrought N.J., Randall R.J. Protein measurement with the Folin-Phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265-275.
Ridell M. Serological relationships of Nocardia, Mycobacterium, Corynebacterium, and the “rhodo-chrous" taxon with special reference of taxonomy // PhD thesis. - Goteborg, 1977. 52 p.
Поступила в редакцию 21.09.2005
Specific immune sera against actinobacteria of the genus Rhodococcus
I.B. Ivshina, O.A. Bogomjagkova, OA. Golikova
The rational schemes for obtaining the high-active immune sera against bacteria of the genus Rhodococcus are developed. The immunogeneity of type and typical representatives of the Rhodococcus species is studied using the obtained diagnostic immune sera. The comparative analysis of different rubbit immunization schemes effectiveness is conducted.
